孫譽(yù)軒，陳晨，李俊

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

0 引言

昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)作為細(xì)胞工程的重要組成部分，已廣泛運(yùn)用在分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物反應(yīng)器研發(fā)等領(lǐng)域［1］.自Grace［2］設(shè)計(jì)出Grace昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基，建立桉蠶（Antheraea eucalypti）卵巢細(xì)胞系以來(lái)，昆蟲(chóng)組織及細(xì)胞培養(yǎng)取得快速發(fā)展.有統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)表明，昆蟲(chóng)中已經(jīng)建成的細(xì)胞系已達(dá)800余株［3］.但相較于昆蟲(chóng)的巨大數(shù)量來(lái)講，目前已經(jīng)建成的細(xì)胞系還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足對(duì)特定物種和特定功能細(xì)胞的研究.已建成的細(xì)胞系中，母細(xì)胞來(lái)源通常采用胚胎或卵巢，其優(yōu)點(diǎn)是再生潛力較高，如黃粉蟲(chóng)、甜菜夜蛾等［4-5］.其他來(lái)源亦有中腸、脂肪體、器官芽和血液等［6］.此外，在達(dá)摩鳳蝶細(xì)胞系的建立過(guò)程中采用新孵的幼蟲(chóng)為母細(xì)胞來(lái)源［7］.在甜菜夜蛾中，Wu等［8］采用蛹組織為材料，獲得對(duì)甜菜夜蛾核多角體病毒（SeMNPV）和苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcMNPV）高敏感的NTU-SE細(xì)胞系.基于不同組織或細(xì)胞類(lèi)型建立的細(xì)胞系豐富昆蟲(chóng)的細(xì)胞系類(lèi)型，對(duì)病毒敏感型細(xì)胞株篩選及特定組織的功能研究具有重要意義.

脂肪體組織是昆蟲(chóng)能量?jī)?chǔ)存和代謝的主要場(chǎng)所.組成脂肪體組織的細(xì)胞主要是滋養(yǎng)細(xì)胞（trophocyte）、尿細(xì)胞（urocyte）和含菌細(xì)胞（mycetocyte）.滋養(yǎng)細(xì)胞是脂肪體組織的主要細(xì)胞，在不同的昆蟲(chóng)類(lèi)型和生命階段其細(xì)胞的形狀多樣且不規(guī)則，脂肪以小的脂滴或以大的液泡形式占據(jù)滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的大部分空間［9］.脂肪體除為昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育提供能量外，還具有多種生理功能.脂肪體是昆蟲(chóng)先天免疫過(guò)程中體液免疫的重要組織，通過(guò)合成抗菌肽抵御病原菌入侵.此外，脂肪體受蛻皮激素（20E）調(diào)控參與蛹期脂肪體解離及變態(tài)發(fā)育過(guò)程［10］.目前利用昆蟲(chóng)脂肪體組織建成的脂肪體細(xì)胞系還較少.但對(duì)于脂肪體生理功能及脂類(lèi)代謝等研究來(lái)講，脂肪體的原代培養(yǎng)及細(xì)胞系建立是十分必要的.

柞蠶是大蠶蛾科的絹絲昆蟲(chóng)，其體型較大，易于解剖，進(jìn)行組織或細(xì)胞培養(yǎng).關(guān)于柞蠶脂肪體的原代培養(yǎng)還未有相關(guān)研究報(bào)道.本研究以柞蠶脂肪體組織為材料進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察原代培養(yǎng)過(guò)程中脂肪體細(xì)胞的各種形態(tài).通過(guò)轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)表達(dá)載體，驗(yàn)證脂肪體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力和外源蛋白表達(dá)能力.

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

柞蠶蛹為青6號(hào)品種，購(gòu)自吉林省蠶業(yè)研究所.Grace培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司.青霉素、鏈霉素雙抗購(gòu)自武漢普諾賽.高效轉(zhuǎn)染試劑StarFectⅡ購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè).實(shí)驗(yàn)主要儀器為美國(guó)Thermo公司8000WJ型培養(yǎng)箱；上海三發(fā)SF-CJ-1型超凈臺(tái)；日本奧林巴斯IX71型熒光倒置顯微鏡.

1.2 柞蠶蛹脂肪體組織的獲取

在超凈臺(tái)中，將柞蠶蛹置于含75%酒精的離心管中浸洗消毒30 min，隨后用無(wú)菌水沖洗蛹體表2～3次，再用滅菌紗布擦干體表水分.用無(wú)菌的剪刀將柞蠶表皮剪開(kāi)一小口，用鑷子夾取脂肪體組織，置于盛有滅菌生理鹽水的無(wú)菌平皿中.去除與脂肪體連接的馬氏管、卵巢或精巢等組織后，將脂肪體在含有生理鹽水的平皿中漂洗3次，去除血細(xì)胞和脂肪滴.最后轉(zhuǎn)移至新的盛有生理鹽水的平皿中，再轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中.

1.3 柞蠶蛹脂肪體的原代培養(yǎng)及染色

用鑷子和剪刀將脂肪體組織分成較小的組織塊，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶T25中，組織塊先不加培養(yǎng)基，并用吸管吸去表面液體，倒置并使其牢固貼壁.經(jīng)2 h倒置貼壁后在組織塊周邊滴加Grace培養(yǎng)基（含20%血清及終濃度100 U/mL青霉素、鏈霉素雙抗），置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后，緩緩的加入3 mL培養(yǎng)基.隨后置于27℃培養(yǎng)箱中長(zhǎng)期培養(yǎng).

將脂肪體組織接種至60 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行油紅O染色.染色前小心吸棄培養(yǎng)基和脂肪體組織塊，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，向培養(yǎng)皿中加入4%的甲醛固定細(xì)胞30 min.隨后用PBS稀釋油紅O染液儲(chǔ)備液至終濃度3 mg/mL，加入培養(yǎng)皿.室溫染色30 min，隨后吸棄染液，并加入PBS洗數(shù)次直到透明，置于顯微鏡下觀察.

1.4 柞蠶脂肪體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將脂肪體細(xì)胞培養(yǎng)于60 mm的培養(yǎng)皿中，按轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說(shuō)明將7.5μL轉(zhuǎn)染試劑和2.5μg昆蟲(chóng)表達(dá)載體pIZT/V5-His（帶有綠色熒光蛋白GFP基因）震蕩混勻成復(fù)合物，室溫孵育10 min后加入培養(yǎng)皿中，輕搖使其充分混勻.27℃培養(yǎng)24～48 h，置于熒光倒置顯微鏡觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹脂肪體原代培養(yǎng)的組織細(xì)胞類(lèi)型和特點(diǎn)

本研究以倒置貼壁法對(duì)柞蠶蛹脂肪體進(jìn)行原代培養(yǎng)，相較于直接貼壁培養(yǎng)，倒置貼壁更有助于脂肪體的貼壁和脂肪體細(xì)胞的解離.柞蠶脂肪體組織塊貼壁后約3 d即能觀察到脂肪體細(xì)胞的解離，解離的脂肪體細(xì)胞部分懸浮于培養(yǎng)基中，部分貼壁于培養(yǎng)瓶底部（圖1A）.經(jīng)過(guò)5 d左右的培養(yǎng)后，可觀察到少量脂肪組織塊周?chē)霈F(xiàn)輻射狀細(xì)胞，初期較為細(xì)長(zhǎng).部分脂肪組織塊周邊可看到含有油滴的細(xì)紋狀細(xì)胞（圖1B）.隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，這些細(xì)長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸的部分聚集，包含的油滴越來(lái)越多.

經(jīng)過(guò)約5 d的培養(yǎng)，在組織塊周?chē)霈F(xiàn)一些長(zhǎng)的梭形細(xì)胞，并不斷向外伸展.梭形細(xì)胞的細(xì)胞體積較大，細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則圓形、多角形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央清晰可見(jiàn).經(jīng)過(guò)約15 d培養(yǎng)，梭形細(xì)胞不斷向外擴(kuò)展，呈放射狀生長(zhǎng)（圖1C）.此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不斷增加，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，細(xì)胞相互之間相互擠壓連接.經(jīng)過(guò)約30 d的培養(yǎng)，梭形細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，在梭形細(xì)胞的相互連接處開(kāi)始逐漸出現(xiàn)一些小的圓形脂肪體細(xì)胞，其形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，可能是由梭形細(xì)胞分化產(chǎn)生（圖1D）.

經(jīng)過(guò)約10 d左右的培養(yǎng)，部分脂肪體除解離出較大的顏色較深的脂肪體細(xì)胞外，在一些組織周?chē)_(kāi)始出現(xiàn)小的卵圓形細(xì)胞（圖1E），其大小與梭形細(xì)胞分化產(chǎn)生的圓形細(xì)胞相比略小.在前期培養(yǎng)階段卵圓形細(xì)胞的分裂能力較強(qiáng)，隨后細(xì)胞不斷長(zhǎng)大，顏色加深，并逐漸成熟.培養(yǎng)約30 d左右，許多卵圓形細(xì)胞開(kāi)始聚集成團(tuán)塊狀，但仍有許多卵圓形細(xì)胞不斷增殖（圖1F）.在脂肪體組織周?chē)怆x出的細(xì)胞中，卵圓形細(xì)胞的數(shù)量最多，生長(zhǎng)最快，成熟顏色加深以后與組織解離出的成熟圓形脂肪體較為相近.

除上述幾種生長(zhǎng)較快的細(xì)胞外，在脂肪體的原代培養(yǎng)過(guò)程中，還觀察到一些其他類(lèi)型的細(xì)胞.瘤狀細(xì)胞在經(jīng)過(guò)約5 d左右的培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生（圖1G）.瘤狀細(xì)胞是成熟脂肪體解離后多個(gè)細(xì)胞聚集形成的一種類(lèi)似瘤體的細(xì)胞.瘤狀細(xì)胞的分裂增殖能力較弱，經(jīng)過(guò)約30 d的培養(yǎng)后，許多貼壁生長(zhǎng)的瘤狀細(xì)胞不再貼壁，或出現(xiàn)大量的脂肪油滴，逐漸死亡.在培養(yǎng)的過(guò)程中，還觀察到少量管道狀細(xì)胞，其細(xì)胞較其他類(lèi)型的細(xì)胞明顯細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞顏色較淺，較為透明，脂肪滴在整個(gè)細(xì)胞中可較為明顯觀察到（圖1H）.

圖1 原代培養(yǎng)中不同形態(tài)的柞蠶脂肪體細(xì)胞的觀察

2.2 原代培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和觀察

取培養(yǎng)較好的15 d左右的原代脂肪體細(xì)胞，加入轉(zhuǎn)染試劑和pIZT/V5-His表達(dá)載體，使載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入脂肪體細(xì)胞中.由于載體上帶有GFP基因，若轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，則GFP蛋白表達(dá)后可通過(guò)熒光顯微鏡觀察到綠色熒光.觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24 h后，卵圓形脂肪體細(xì)胞已能觀察到綠色熒光（圖2A）.結(jié)果表明新生的細(xì)胞具有較強(qiáng)的活性，具有一定的轉(zhuǎn)染能力.經(jīng)過(guò)48 h的轉(zhuǎn)染后，大多數(shù)卵圓形的脂肪體細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光（圖2B），表明轉(zhuǎn)染效率較高.

圖2 pIZT/V5-His昆蟲(chóng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的脂肪體細(xì)胞

2.3 原代培養(yǎng)脂肪體細(xì)胞的油紅O染色觀察

油紅O為脂溶性染料，用于脂肪或脂類(lèi)物質(zhì)含量高的細(xì)胞或組織的染色.基于此，通過(guò)油紅O染色對(duì)不同形態(tài)的脂肪體細(xì)胞進(jìn)行染色觀察和鑒定.結(jié)果表明，在脂肪體細(xì)胞的原代培養(yǎng)過(guò)程中，梭形細(xì)胞和卵圓形細(xì)胞的染色均較為清晰，細(xì)胞核均清晰可見(jiàn)（圖3A、3B），表明這些細(xì)胞中脂肪含量均較高，符合脂肪體細(xì)胞的特點(diǎn).此外，油紅O的染色液表明瘤狀細(xì)胞和管道狀細(xì)胞也含有較多的脂肪（圖3C、3D）.這些脂肪后期會(huì)隨著細(xì)胞的死亡以油滴的形式分散于整個(gè)培養(yǎng)基或貼壁于培養(yǎng)皿底部，影響其他正常細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，給原代培養(yǎng)和細(xì)胞系構(gòu)建帶來(lái)一定的困難.

圖3 不同形態(tài)柞蠶脂肪體細(xì)胞的油紅O染色觀察

3 討論

昆蟲(chóng)的脂肪體類(lèi)似于人體的肝臟和脂肪，是昆蟲(chóng)脂類(lèi)和糖類(lèi)代謝以及多種中間代謝過(guò)程的主要器官［11-12］.不同種類(lèi)昆蟲(chóng)的脂肪體組織形態(tài)存在一些差異，有些為片層狀，有些為串珠狀或條帶狀等［9］.脂肪體組織通常由中胚層起源的細(xì)胞組成，有時(shí)也包含一些外胚層細(xì)胞，因此在脂肪體原代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種形態(tài)的細(xì)胞，并可反映其胚層起源.在柞蠶脂肪體的原代培養(yǎng)過(guò)程中觀察到多種形態(tài)的細(xì)胞，這些細(xì)胞的形態(tài)和特點(diǎn)與文獻(xiàn)［13］研究結(jié)果較為一致.柞蠶脂肪體原代培養(yǎng)中，卵圓形細(xì)胞的分裂增殖能力較強(qiáng)，從點(diǎn)狀分布逐漸發(fā)展成成片分布，最后聚集成團(tuán)塊狀.在家蠶脂肪體原代培養(yǎng)中，Kishimoto等［14］發(fā)現(xiàn)卵形細(xì)胞和球形細(xì)胞聚集成網(wǎng)格狀組織的現(xiàn)象，這些網(wǎng)格狀組織中的細(xì)胞分裂繁殖能力較強(qiáng).除卵圓形細(xì)胞外，長(zhǎng)期的培養(yǎng)觀察表明，梭形細(xì)胞等也具有較強(qiáng)的分裂增殖能力.然而，這些細(xì)胞增殖能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減緩.油紅O染色也表明許多脂肪體細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)后逐漸出現(xiàn)細(xì)胞死亡，脂質(zhì)油滴分散至培養(yǎng)基中.因此，通過(guò)脂肪體的原代培養(yǎng)，篩選出增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞類(lèi)群，如卵圓形細(xì)胞，建立柞蠶脂肪體組織的細(xì)胞系具有一定的可行性.

本研究采用的倒置貼壁法更容易使貼壁的組織塊游離出脂肪體細(xì)胞，原代培養(yǎng)效果較好.目前已有的柞蠶原代培養(yǎng)多采用精巢、卵巢等分裂能力較強(qiáng)的組織，培養(yǎng)方法采用組織塊直接貼壁法、胰酶消化法等，培養(yǎng)基采用TC-100、Grace等.柞蠶蛹卵巢原代培養(yǎng)中，王林美等［15］對(duì)培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，表明采用機(jī)械分散法及MGM-448培養(yǎng)基的細(xì)胞貼壁效果好，生長(zhǎng)旺盛.對(duì)于分裂能力相對(duì)較弱的脂肪體組織來(lái)講，倒置貼壁有助于脂肪體組織更好貼壁并適應(yīng)新的體外培養(yǎng)環(huán)境，較快解離或游離出脂肪體細(xì)胞，加快原代培養(yǎng)進(jìn)程.因此，培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基等條件可影響細(xì)胞的分裂和分化潛能，進(jìn)而影響柞蠶相關(guān)組織細(xì)胞系的建立.本研究為柞蠶原代培養(yǎng)提供良好的方法補(bǔ)充，可為柞蠶脂肪體功能研究打下良好的基礎(chǔ).

目前，柞蠶中還未有脂肪體細(xì)胞系建立的報(bào)道，僅有柞蠶胚胎細(xì)胞系的建立和成蟲(chóng)卵巢細(xì)胞株的建立［16］.細(xì)胞株系的建立對(duì)相關(guān)組織的功能研究提供很好的材料，但一般周期較長(zhǎng).本研究成功在原代培養(yǎng)的脂肪體細(xì)胞中直接進(jìn)行轉(zhuǎn)染表達(dá)外源基因，表明脂肪體細(xì)胞較好的轉(zhuǎn)染能力，特別是一些活性較強(qiáng)的新生細(xì)胞.因此，在原代培養(yǎng)過(guò)程中去除較大的組織塊，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染可實(shí)現(xiàn)基因在脂肪體細(xì)胞中表達(dá)，這對(duì)于柞蠶脂肪體功能的研究具有重要的意義.