尹瑞旸，李 星，胡錦榮，胡小松，沈 群*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）2 國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心 北京100094）

糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，表現(xiàn)為胰島素分泌不足或胰島素利用率降低，進而引起的高血糖癥狀[1]。其中，以胰島素抵抗為特征的二型糖尿病占總數(shù)的90%，成為全球性的重大公共衛(wèi)生問題[2]。很多科學家都在尋找合適的藥物或者通過膳食干預來改善胰島素抵抗，降低二型糖尿病對人體健康的影響[3-4]。然而，這些藥物會導致患者出現(xiàn)體重增加、骨質(zhì)流失和胃腸道功能紊亂等不良反應[5]。還有相當一部分研究通過食物中的功效成分降低胰島素抵抗[6-7]。研究表明，提高谷類的攝入量可降低糖尿病的發(fā)病率[8]。

小米作為粟類的代表，是干旱及半干旱地區(qū)的主要糧食作物。小米富含多種活性組分，如膳食纖維、多酚、色素、抗性淀粉及蛋白等，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝及護肝等生物功能[9-10]。大量的動物實驗及人群試驗發(fā)現(xiàn)小米具有降糖功效。Ren 等[11]人發(fā)現(xiàn)小米膳食可顯著降低糖耐量受損人群空腹血糖及餐后2 h 血糖[9]。Qi 等[12]人研究表明小米干預可顯著降低STZ 誘導的糖尿病大鼠的空腹血糖[10]。小米富含多種活性組分，如膳食纖維、多酚、色素、抗性淀粉及蛋白等，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝及護肝等生物功能[11-12]。有研究表明，小米中的脂肪酸，尤其是亞油酸可顯著降低小米淀粉的體外消化率[13]；小米中的蛋白可降低糖尿病小鼠的血糖和血脂含量[14]。然而，綜合比較小米不同極性組分的降糖作用的研究較少。

肝臟作為糖代謝的重要器官，參與糖的代謝及合成，也是胰島素抵抗的重要靶器官。相對于動物實驗，體外的細胞試驗因具有周期短、成本低及易于重復等優(yōu)點而廣泛用于食品和藥品的體外評價。其中，HepG2 細胞為人肝癌細胞，該細胞既保留了正常肝細胞的生物特征，又具有高親和力的胰島素受體[15]。大量試驗表明，利用棕櫚酸（PA）處理HepG2 細胞可成功誘導胰島素抵抗模型，此時細胞的糖吸收顯著低于正常細胞[16-17]。本試驗中采用水、乙醇、正丁醇、正己烷4 種不同極性溶劑提取小米不同組分，分析提取物及沉淀物消化液的抗氧化活性和對PA 誘導的IR-HepG2 細胞糖吸收的影響，為小米的功效研究提供支持，為進一步推廣利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

HepG2 細胞株購自北京協(xié)和醫(yī)學院細胞庫。

DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、0.25%胰酶細胞消化液，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，美國Gibco 公司；無脂肪酸牛血清白蛋白、膽鹽，上海源葉生物科技有限公司；棕櫚酸鈉、胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、噻唑藍（MTT），美國Sigma 公司；乙醇、正丁醇、正己烷（分析純級），國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖檢測試劑盒，南京建成生物研究所；試驗所用小米購于山西東方亮生命科技股份有限公司，小米所含基本營養(yǎng)成分如表1所示。

表1 小米基本營養(yǎng)成分Table 1 Nutritional components of millet

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取 小米樣品置37 ℃熱風干燥箱中烘干24 h，粉碎過80 目篩。小米粉用水、乙醇、正丁醇及正己烷以料液比1∶10 在50 ℃條件下旋渦提取1 h，抽濾，重復兩次，分別收集濾液及濾渣。乙醇、正丁醇及正己烷提取物減壓蒸餾，水提物及濾渣冷凍干燥，得水提物、乙醇提取物、正丁醇提取物及正己烷提取物，提取率分別為5.978%，9.764%，6.262%，4.749%，提取物及沉淀物于-80℃冷藏備用。

1.2.2 提取物及沉淀物的體外模擬消化 通過調(diào)節(jié)pH 值、溫度、添加酶模擬胃腸道消化液，利用消化液對小米提取物及沉淀物進行體外模擬消化?？谇幌A段：于50 mL 離心管中加入提取物0.15 g 或沉淀物0.75 g（不添加樣品為空白組），之后加入9 mL 口腔消化液（α-淀粉酶終活力為200 U）將pH 值調(diào)至6.75，37 ℃下震蕩10 min。胃消化階段：用1 mol/L HCl 將口腔消化液pH 值調(diào)至1.2，終止α-淀粉酶作用，加入9 mL 胃消化液（0.32 g 胃蛋白酶溶于100 mL 的0.03 mol/L NaCl溶液）37 ℃下震蕩2 h。腸消化階段：用1 mol/L NaHCO3將胃消化液pH 值調(diào)至6.5，終止胃蛋白酶作用，加入1.5 mL NaCl（120 mmol/L）、1.5 mL KCl（5 mmol/L）及9 mL 腸消化液（0.15 g 胰蛋白酶和0.9 g 膽鹽溶于100 mL 的0.1 mol/L NaHCO3），37 ℃下震蕩2 h（消化流程如圖1所示）。

圖1 樣品消化流程Fig.1 Digestion process of samples

70 ℃下加熱消化液15 min 將酶滅活，10 000×g離心15 min。收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾除菌分裝，得水提物消化液、乙醇提取物消化液、正丁醇提取物消化液、正己烷提取物消化液、水沉淀物消化液、乙醇沉淀物消化液、正丁醇沉淀物消化液、正己烷沉淀物消化液及小米消化液，于-80 ℃保存。

1.2.3 DPPH 自由基清除能力測定 0.15 mmol/L DPPH-乙醇溶液與樣品溶液按1∶1（體積比）混合，室溫避光反應1 h 后，離心取上清，于波長517 nm處測定吸光值。DPPH·清除能力按下式計算：

DPPH·清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中，A0——DPPH 溶液+無水乙醇/蒸餾水的吸光度；A1——DPPH 溶液+樣品溶液的吸光度；A2——樣品溶液+無水乙醇的吸光度。

利用5～50 μmol/L 水溶性維生素E 制作標準曲線為y=0.0135x-0.0189，R2=0.999。

1.2.4 總抗氧化能力測定 將提取物及消化液配制成不同的質(zhì)量濃度梯度，其中提取物為5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg/mL，提取物消化液為5 mg/mL，沉淀物消化液為25 mg/mL。樣品溶液與工作液按1∶3（體積比）比例混合，其中工作液為10 mmol/L 2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、20 mmol/L FeC13、0.3 mol/L 醋酸緩沖液以1∶1∶10（體積比）的比例混合，搖勻后于37 ℃水浴中靜置10 min，于波長593 nm 處測定其吸光值。另以FeSO4作標準曲線（濃度為0.0125～0.300 mmol/L，吸光度為0.087～0.952），樣品的抗氧化活性以達到同樣吸光度值所需的FeSO4的物質(zhì)的量表示。標準曲線為：y=3.0485x+0.0458，R2=0.999。

1.2.5 MTT 法測定細胞存活率 細胞加樣處理后，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM 于37 ℃避光孵育4 h 后除去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，震蕩混勻以完全溶解出MTT 紫色結(jié)晶產(chǎn)物。用酶標儀在波長570 nm 處測定吸光度值。

1.2.6 棕櫚酸鈉溶劑的配制 棕櫚酸鈉（PA）在70 ℃下用超純水溶解，加入到5%牛血清白蛋白（不含游離脂肪酸）溶液中，配制成終濃度為5 mmol/L 的PA 母液，用0.22 μm 濾膜過濾除菌分裝，于-20 ℃保存，兩周內(nèi)用完。使用前將PA 母液55 ℃復熱15 min 后，用DMEM 培養(yǎng)基稀釋到相應倍數(shù)。

1.2.7 小米提取物及消化液對IR-HepG2 糖吸收的測定 當HepG2 細胞融合度為80%時，將細胞消化，用含15% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整密度，以30 000 個/孔的密度接種于96 孔板中。待細胞貼壁后，換以含或不含0.25 mmol/L PA 及樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將細胞分為正常對照組、模型組及樣品組，提取物組終質(zhì)量濃度為20，40，80 μg/mL；提取物消化液組終質(zhì)量濃度20，80 μg/mL；沉淀物消化液組終質(zhì)量濃度200，400 μg/mL。細胞加樣處理24 h 后，棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗2 次，換為含10-7mol/L 胰島素的無血清DMEM 培養(yǎng)基孵育20 h 后，取5 μL 上清液，用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量。以無血清DMEM 培養(yǎng)基葡萄糖含量為對照，計算樣品20 h 葡萄糖消耗量。若細胞數(shù)量變化較大，需進行歸一化處理。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理方法 采用Excel 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均為4 次重復試驗的平均值和標準誤差。采用SPSS 16.0 軟件進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物及提取物消化液的抗氧化活性

2.1.1 提取物DPPH 自由基清除能力比較 由于消化液中的酶與DPPH·反應生成的物質(zhì)有顏色，對檢測結(jié)果有干擾，結(jié)果不可信，因此僅對提取物的DPPH·清除能力進行測定。由圖2 可知，4 種提取物對DPPH·的清除效果與樣品質(zhì)量濃度都呈劑量依賴關(guān)系。各提取物的抗氧化能力存在較大差距，當樣品質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL 時，水、乙醇、正丁醇及正己烷提取物對DPPH·的清除率分別為（55.07±0.31）%，（45.07±1.10）%，（26.47±1.17）%，（20.67±0.90）%。單位質(zhì)量濃度樣品的DPPH·清除能力相當于水溶性維生素E 質(zhì)量摩爾濃度的值分別為（15.00±0.45），（11.06±0.48），（7.00±0.20），（5.04±0.15）μmol/mg，說明水提物的抗氧化能力優(yōu)于有機溶劑提取物。

圖2 提取物的DPPH·清除率Fig.2 DPPH· scavenging rate of extracts

2.1.2 提取物及其消化液總抗氧化能力比較 從圖3 可知，不同提取物質(zhì)量濃度與總抗氧化能力呈劑量依賴關(guān)系。當樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，水、乙醇、正丁醇及正己烷提取物的總抗氧化能力分別為（0.136±0.001），（0.099±0.001），（0.032±0.002），（0.029±0.003）mmol/L。在較高質(zhì)量濃度下（＞15 mg/mL），水提物的抗氧化能力達到平臺期，其抗氧化能力不及乙醇提取物，說明水提物存在較單一的物質(zhì)，對特定的自由基清除能力較強，但總抗氧化能力不及乙醇提取物。

圖3 提取物總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity of extracts

小米作為一種糧食作物，其主要成分為淀粉，蛋白，脂肪、膳食纖維，還包含一些微量物質(zhì)如多酚、胡蘿卜素等（表1）。根據(jù)以往研究可知，水提物中主要富集的成分有水溶性蛋白、多糖及酚酸類物質(zhì)等[18]。小米中有較高含量的酚酸物質(zhì)（如阿魏酸為15.6 μg/100 g），而酚酸類物質(zhì)有較高的抗氧化活性[19]。乙醇提取物中富含豐富的醇溶蛋白及多酚等物質(zhì)，其中小米中的蛋白主要為醇溶蛋白，是小米乙醇提取物主要成分，賦予了乙醇提物較高的抗氧化活性[20-21]。正己烷提取物中主要為脂肪酸、葉黃素、生育酚及胡蘿卜素等，其抗氧化活性不及乙醇提取物[22]。

從圖4 可知，當樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，抗氧化能力分別為水提取＞乙醇取提物＞正丁醇提取物＞正己烷提取物，分別為（0.068±0.000），（0.045 ±0.001），（0.025 ±0.002），（0.016 ±0.000）mmol/L?？梢园l(fā)現(xiàn)，消化后提取物的抗氧化能力明顯降低，分別降低了50.00%，54.55%，21.88%，44.83%。當沉淀物消化液質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，抗氧化能力為正己烷沉淀物≥小米＞乙醇沉淀物＞正丁醇沉淀物≥水沉淀物。

圖4 提取物及沉淀物消化液總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of extracts and sediment digestive solution

提取物經(jīng)過消化后抗氧化能力有所下降，這是由于胃腸道消化中pH 值的變化及酶的作用使一些活性成分分解。因此，體外試驗不能夠完全顯示出活性組分對機體的作用效果。之后的體外細胞篩選小米降糖成分的試驗，將綜合評價提取物、提取物消化液及沉淀物消化液對胰島素抵抗細胞糖吸收的作用。

2.2 小米提取物及其消化液對IR-HepG2 糖吸收的影響

2.2.1 小米提取物對IR-HepG2 糖吸收的影響由圖5 可知，模型組細胞的糖吸收顯著低于對照組，說明0.25 mmol/L 的PA 處理HepG2 細胞可成功復制出胰島素抵抗模型。水提物、乙醇提取物、正丁醇提取物及正己烷提取物均促進了模型細胞的糖吸收。其中80 μg/mL 乙醇提取物，40 μg/mL和80 μg/mL 正丁醇提取物，20，40，80 μg/mL 正己烷提取物均可顯著提高胰島素抵抗細胞的糖吸收，與模型組相比吸收率分別提高19.17%，25.02%，41.44%，9.15%，26.38%，53.07%，說明此質(zhì)量濃度下的提取物對HepG2 細胞的胰島素抵抗有改善作用。Nishizawa 等[14]發(fā)現(xiàn)小米蛋白可以顯著改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗，然而乙醇提取物對IR-HepG2 的改善作用不及抗氧化性不強的正己烷提取物，這表明起到降糖效果的活性物質(zhì)不僅僅是具有較高抗氧化活性的蛋白及多酚等物質(zhì)，同時表明乙醇提取物中的醇溶蛋白主未經(jīng)消化很難被細胞利用。有研究表明，不飽和脂肪酸——亞油酸可有效增加胰島素敏感性，降低餐后及空腹血糖[23]。小米中富含豐富的不飽和脂肪酸，而這些脂肪酸主要富集在正己烷提取物中，而正丁醇提取物中也富集了較多的脂肪酸[22]。因此，推測小米中的脂肪酸具有較好的改善糖代謝的作用。

圖5 提取物對胰島素抵抗HepG2 細胞糖吸收的影響Fig.5 Effect of extracts on glucose uptake of IR-HepG2

2.2.2 提取物消化液對胰島素抵抗HepG2 細胞糖吸收的影響 如圖6所示，與正常對照組相比，模型組糖吸收下降了31.97%，有顯著性差異（P<0.05）；水提物消化液對胰島素抵抗細胞糖吸收無顯著影響。與C1 及C2 相比，20 μg/mL 和80 μg/mL 乙醇提取物消化液、正丁醇提取物消化液、正己烷提取物消化液均可顯著促進胰島素抵抗細胞糖吸收。提取物消化前、后對胰島素抵抗細胞的糖吸收存在差異。其中，水提物消化后降低了IRHepG2 細胞的糖吸收；乙醇提取物消化后胰島素抵抗改善作用顯著增強，這可能是由于水提物中的多糖分解為單糖，增加了對細胞的刺激作用。有研究表明，高糖的攝入會加重糖脂代謝紊亂，降低HepG2 細胞的糖吸收[24-25]。小米醇溶蛋白在未消化前不容易被細胞利用，在胃腸道消化后分解為多肽或氨基酸作用于細胞，提高了其生物利用率[26-27]，揭示了在體外細胞評價前期進行模擬消化試驗的重要性，特別是對于含有較多蛋白及淀粉多糖等大分子物質(zhì)的樣品。

圖6 提取物消化液對胰島素抵抗HepG2 細胞糖吸收的影響Fig.6 Effect of extracts digestive solution on glucose uptake in IR-HepG2

2.2.3 沉淀物消化液對胰島素抵抗HepG2 細胞糖吸收的影響 如圖7所示，與C1 及C2 相比，200 μg/mL 和400 μg/mL 的水沉淀物消化液、正丁醇沉淀物消化液，正己烷提取物消化液、小米消化液均可顯著促進胰島素抵抗細胞糖吸收。乙醇沉淀物消化液對胰島素抵抗細胞糖吸收無顯著影響，因此推測小米中起降糖作用的主要物質(zhì)集中在乙醇提取物中。小米正己烷提取物及正己烷沉淀物消化液均可有效促進IR-HepG2 細胞的糖吸收（圖6 和7），可能是由于油脂類物質(zhì)會與小米中的蛋白作用，抑制了蛋白質(zhì)的消化，在剝離了這些物質(zhì)后提高了正己烷沉淀物中蛋白的消化程度，從而提高了降糖效果，使正己烷沉淀物消化液仍保持較高的活性。推測小米各組分之間存在相互作用（協(xié)同或拮抗），從而影響其生物活性。

圖7 沉淀物消化液對胰島素抵抗HepG2 細胞糖吸收的影響Fig.7 Effect of sediment digestive solution on glucose uptake in IR-HepG2

3 結(jié)論

本文研究表明，DPPH·清除能力的大小順序為水提?。疽掖继崛∥铮菊〈继崛∥铮菊和樘崛∥??？偪寡趸芰εcDPPH·清除能力結(jié)果類似，水提物也表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時達到平臺期，抗氧化能力不及乙醇提取物。提取物經(jīng)過模擬體內(nèi)胃腸道消化后，總抗氧化活性降低。然而，抗氧化能力較強的水提物對IR-HepG2 細胞糖吸收的影響較低，而正己烷和正丁醇對胰島素抵抗改善作用明顯。當提取物經(jīng)過胃腸道消化后，對IR-HepG2 細胞糖吸收作用效果發(fā)生改變，其中乙醇提取物消化后降糖活性升高，水提物消化后加重了細胞的胰島素抵抗，可能是由于提取物的蛋白及多糖分解、小分子活性物質(zhì)在酸堿條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等多種原因，需要進一步的驗證。同時，提取后剩余物及小米消化后的消化液對IR-HepG2 細胞糖吸收也有促進作用，與提取物的結(jié)果基本吻合。

本試驗的結(jié)果表明，提取物的抗氧化活性與其胰島素改善作用之間沒有明顯聯(lián)系，能夠改善胰島素抵抗作用的物質(zhì)可能為低抗氧化活性物質(zhì)，該類物質(zhì)在經(jīng)胃腸道消化后仍可保持較好的降糖功效。