趙喆禛，王夢(mèng)雅，薛 嬌，張嘉銘，劉 萍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種珍稀的藥用真菌，屬擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、多孔菌目[1]。樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌中的主要化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等活性功能，在糖尿病防治方面受到越來(lái)越多關(guān)注[2-7]。

由于野生樺褐孔菌子實(shí)體在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下要經(jīng)10～15年才能具有藥用價(jià)值，資源非常有限，無(wú)法滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求，因此解決樺褐孔菌資源短缺問(wèn)題迫在眉睫。液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)樺褐孔菌具有周期短、產(chǎn)量高、價(jià)格低的優(yōu)勢(shì)，被廣泛使用。目前，對(duì)液體深層培養(yǎng)的研究大多集中在如何提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上，對(duì)于如何提高其活性的研究不多，而液體發(fā)酵樺褐孔菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物活性與天然生長(zhǎng)子實(shí)體中的相比還存在一定差距。近年研究表明，添加刺激因子能改變次生代謝途徑中催化酶的活性，從而達(dá)到提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和活性的目的[8-9]。樺褐孔菌通過(guò)寄生在樺樹(shù)皮上進(jìn)行自身生長(zhǎng)繁殖，樺樹(shù)皮中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠確保樺褐孔菌生長(zhǎng)及合成生物活性物質(zhì)。采用高效液相色譜方法研究樺樹(shù)汁液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)白樺液中含有近70 種化合物，主要包括各種維生素、氨基酸、脂肪酸和礦物質(zhì)元素等[10]。Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)添加樺樹(shù)皮水提取物（0.01 g/L）能夠刺激液體深層培養(yǎng)的樺褐孔菌菌絲體生長(zhǎng)，且其產(chǎn)生的類(lèi)固醇產(chǎn)量達(dá)（225.5±8.7）mg/L，比對(duì)照組高97.0%，說(shuō)明白樺樹(shù)皮的提取物可作為樺褐孔菌類(lèi)固醇生物合成的誘導(dǎo)劑。

II 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）又稱非胰島素依賴型糖尿病，其重要發(fā)病機(jī)制之一為胰島素抵抗（Insulin resisitance，IR）[12-13]。HepG2 細(xì)胞被廣泛用作胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和糖尿病治療藥物作用機(jī)制的體外研究細(xì)胞模型[14]。本試驗(yàn)通過(guò)探究不同刺激因子（樺樹(shù)浸提汁、VB1、VB6和白樺脂醇）作用下樺褐孔菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞及胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞（IR-HepG2）葡萄糖消耗量的影響，確定導(dǎo)致樺褐孔菌液體深層發(fā)酵與子實(shí)體多糖降血糖活性差異的主要刺激因子，為樺褐孔菌降血糖保健食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 樺褐孔菌菌種購(gòu)于四川省綿陽(yáng)市食用菌研究所，HepG2 肝癌細(xì)胞株購(gòu)于北京博奧森生物公司。

1.1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液，北京科奧試劑有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、胰島素，美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物工程材料有限公司；二甲基亞砜（DMSO），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒，南京建成生物科技股份有限公司；鹽酸二甲雙胍（Met），北京中惠藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái)、YCP-50 CO2 培養(yǎng)箱，北京三木科技儀器有限公司；M200 pro 多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自Tecan 集團(tuán)奧地利有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液體深層發(fā)酵 將樺褐孔菌接種到馬鈴薯斜面培養(yǎng)基（PDA）上，于28 ℃下培養(yǎng)7～9 d。在4℃條件下保存獲得的斜面純培養(yǎng)菌絲體，每3 個(gè)月傳代一次。種子培養(yǎng)基由葡萄糖（20 g/L），胰蛋白胨（4 g/L），KH2PO4（1 g/L）和MgSO4（1 g/L）組成。將斜面純培養(yǎng)菌絲體接種到含100 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 一級(jí)搖瓶中，并在28 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)7 d。將種子液接種到含100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中于28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)13 d。在種子培養(yǎng)基中分別依次添加4 μg/mL VB1、4 μg/mL VB6、2 μg/mL 白樺脂醇和40%樺樹(shù)浸提汁（稱取一定量樺木屑，常溫水提8～12 h，抽濾去掉樺木屑渣得到）作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并設(shè)不添加任何刺激因子組。在第13 天收集各種培養(yǎng)條件下的樺褐孔菌培養(yǎng)液，發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后加入4 倍體積的乙醇醇沉過(guò)夜后得到多糖。

1.2.2 樺褐孔菌胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞影響的測(cè)定

1.2.2.1 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖影響的測(cè)定 凍存的HepG2 細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中（含10%FBS），于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每3 d 傳代一次。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，加新鮮培養(yǎng)液吹打制成密度為1×105細(xì)胞/mL 的單細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種于96 孔板，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，5 種多糖分別按照終質(zhì)量濃度為20、40、80、120、160、320 μg/mL 添加，并設(shè)置空白對(duì)照組，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 和48 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），再于培養(yǎng)箱中孵化4 h，棄去舊培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO 終止反應(yīng)。待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算增殖率[15]。

1.2.2.2 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)正常HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗影響的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測(cè)定，以加入終質(zhì)量濃度為20，40，80，160 μg/mL 的多糖樣品組為試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組以及Met 組（終濃度1×10-3mmol/L）和胰島素組（終濃度1×10-8mmol/L）兩組陽(yáng)性對(duì)照，分別孵育24 h 和48 h 后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)葡萄糖含量。細(xì)胞葡萄糖消耗量（△GC）為空白組葡萄糖含量減試驗(yàn)組葡萄糖含量[17]。每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后再加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)定吸光值，結(jié)果以△GC/MTT 表示，以去除因活細(xì)胞數(shù)量改變而引起的誤差。

1.2.2.3 HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立 采用高糖高胰島素法建立胰島素抵抗模型[18]。用胰蛋白酶消化HepG2 細(xì)胞后，加入新鮮DMEM 培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞密度為2×105細(xì)胞/mL 的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為含胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，通過(guò)葡萄糖消耗測(cè)定判斷胰島素抵抗細(xì)胞模型是否建立成功。

1.2.2.4 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)胰島素抵抗（IR）-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗影響的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[19]的方法，將細(xì)胞以2×105細(xì)胞/mL 的密度接種于96 孔板，以含誘導(dǎo)濃度（10-6mmol/L）胰島素的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。以加入不同質(zhì)量濃度的多糖組為試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（二甲雙胍組）、陰性對(duì)照組（IR 模型組），在處理24 h 和48 h 后，同1.2.2.2 節(jié)處理，結(jié)果以△GC/MTT 表示。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Excel、SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，并用ANOVA 方差分析進(jìn)行多組間比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同刺激因子發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響

由表1 可以看出，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降。與對(duì)照組相比，無(wú)刺激因子組、樺樹(shù)浸提汁組、VB1組、VB6組以及白樺脂醇組發(fā)酵多糖，在低（20～40 μg/mL）、中質(zhì)量濃度（80～160 μg/mL）時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，細(xì)胞死亡率小于6%，表明其對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。當(dāng)質(zhì)量濃度為320 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞死亡率絕大多數(shù)大于6%，但均低于10%，說(shuō)明多糖質(zhì)量濃度越高，對(duì)細(xì)胞增殖的影響越大。

表1 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of extracellular polysaccharides produced by different stimulating factors on the proliferation of HepG2 cells

細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，除白樺脂醇組外，細(xì)胞死亡率均低于10%，說(shuō)明多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞毒性較小。白樺脂醇組細(xì)胞死亡率大于10%，且當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到320 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率下降顯著（P<0.01），說(shuō)明過(guò)高質(zhì)量濃度的多糖對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性影響。

綜上，添加刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖與不添加刺激因子產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖影響效果相近。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為20～160 μg/mL 時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響，培養(yǎng)24 h 后，與陽(yáng)性對(duì)照組（二甲雙胍組和胰島素組）無(wú)顯著差異，因此，選擇20，40，80，160 μg/mL 為安全范圍進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

由表2 可知，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組（10-8mmol/L 胰島素組、10-3mmol/L 二甲雙胍組）葡萄糖消耗量顯著提高。無(wú)刺激因子組發(fā)酵產(chǎn)生的多糖，僅在質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時(shí)顯著促進(jìn)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗率（與對(duì)照組相比，P<0.01），培養(yǎng)24 h 和48 h 后分別提高了80.46%和40.80%。

表2 不同刺激因子發(fā)酵多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響Table 2 Effect of fermented polysaccharides with different stimulating factors on glucose consumption in HepG2 cells

樺樹(shù)浸提汁發(fā)酵組隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，與對(duì)照組相比，40～160 μg/mL 胞外多糖均能促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖攝取，其中葡萄糖攝取率最高處理組為160 μg/mL 樣品組，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，攝取率分別提高81.61%和31.20%，分別顯著高于對(duì)照組（P<0.01）和胰島素組（P<0.05），但較二甲雙胍組的效果差。

使用VB1發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，低質(zhì)量濃度（20～40 μg/mL）時(shí)葡萄糖消耗量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），而80 μg/mL時(shí)可顯著提高HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗率比對(duì)照組提高了56.32%；培養(yǎng)48 h 后，20～160 μg/mL 的多糖均能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗，其中80 μg/mL 處理組的葡萄糖攝取率較對(duì)照組提高了53.60%，差異具有顯著性（P<0.01），且高于相同試驗(yàn)條件下胰島素的效果（P<0.01）[20]。此外，80 μg/mL 多糖培養(yǎng)細(xì)胞48 h 后，HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量高于無(wú)刺激因子組。

VB6發(fā)酵組隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，葡萄糖的消耗率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，低質(zhì)量濃度組樣品組（40 μg/mL）和中質(zhì)量濃度組（80～160 μg/mL）的胞外粗多糖均能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取，其中80 μg/mL 樣品組培養(yǎng)24 h和48 h 后的葡萄糖攝取率最高，比對(duì)照組分別提高了139.08%，86.40%，比無(wú)刺激因子組分別提高了32.48%，32.39%，且顯著高于胰島素組和二甲雙胍組[21]。

添加白樺脂醇發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，與對(duì)照組相比，40 μg/mL 和80 μg/mL 的胞外粗多糖均能促進(jìn)葡萄糖攝取，葡萄糖攝取率最高的處理組為40 μg/mL 樣品組，培養(yǎng)24 h 和48 h 后對(duì)HepG2細(xì)胞的攝取率較對(duì)照組分別提高了48.28%和22.40%，然而160 μg/mL 處理下的細(xì)胞葡萄糖攝取率較對(duì)照組低，可能與細(xì)胞存活率有關(guān)。此外有研究發(fā)現(xiàn)，將白樺脂醇添加到樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)基中能顯著提高三萜類(lèi)、類(lèi)固醇類(lèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，這也說(shuō)明白樺脂醇可作為樺褐孔菌液體發(fā)酵的刺激因子[19]。

綜上，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h 和48 h 后，添加不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的多糖均能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗，但不同刺激因子影響體外降血糖活性效果不一致，推測(cè)可能是由于不同刺激因子產(chǎn)生的多糖種類(lèi)和單糖組成等不同，導(dǎo)致其體外降血糖活性不同[22]。160 μg/mL樺樹(shù)浸提汁組、80 μg/mL VB1組和VB6組、40 μg/mL 白樺脂醇組多糖均能顯著提高HepG2 細(xì)胞24 h 的葡萄糖消耗量，且VB6的促進(jìn)效果最好。其原因可能是維生素常以輔酶或輔基的形式參與生物催化劑-酶系的活動(dòng)，能夠促進(jìn)甲基的形成和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞周?chē)M織的碳水化合物代謝，參與蛋白質(zhì)及脂肪代謝等重要生命活動(dòng)，故在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)中常加入VB1、VB6、VB12等作為生長(zhǎng)因子刺激菌絲體生長(zhǎng)以及代謝產(chǎn)物的生成[23-25]。

2.3 不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)IRHepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

根據(jù)表3 結(jié)果顯示，IR 組的葡萄糖消耗量與對(duì)照組相比顯著降低，說(shuō)明模型建立成功，且陽(yáng)性對(duì)照二甲雙胍組（10-3mmol/L）能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。無(wú)刺激因子組胞外多糖細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，40～160 μg/mL 的樣品組均能提高IR-HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量，然而當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h 后，其促進(jìn)IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的效果下降，與IR 組無(wú)顯著差異，且低于空白對(duì)照組。

表3 不同刺激因子發(fā)酵多糖對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的影響Table 3 Effect of fermented polysaccharides with different stimulating factors on glucose consumption in IR-HepG2 cells

使用樺樹(shù)浸提汁組產(chǎn)生的胞外多糖培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，與IR 組相比，20～160 μg/mL 的胞外多糖均能促進(jìn)IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖的攝取，其中160 μg/mL 樣品組的葡萄糖攝取率最高，較IR 組提高183.33%；培養(yǎng)48 h 后，40～160 μg/mL 的胞外多糖均能促進(jìn)葡萄糖消耗，其中160 μg/mL 樣品組的葡萄糖攝取率最高，較對(duì)照組提高21.55%，較IR組提高40.41%（P<0.01），但較相同試驗(yàn)條件下二甲雙胍的促進(jìn)效果差。

使用VB1組產(chǎn)生的胞外多糖培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，樣品組在40～160 μg/mL 時(shí)能提高葡萄糖攝取率，且在160 μg/mL 時(shí)促進(jìn)效果最好，較IR 組提高152.56%（P<0.01）；培養(yǎng)48 h 后，樣品組在40～160 μg/mL 范圍能提高葡萄糖消耗率，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗量顯著提高（P<0.05），較IR 組提高39.59%，較無(wú)刺激因子組提高29.55%。

添加VB6發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，與IR 組相比，20～160 μg/mL 多糖均能促進(jìn)IR-HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗，培養(yǎng)24 h 后，當(dāng)質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗量顯著升高（P<0.01），較IR組提高196.15%；培養(yǎng)48 h 后，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗量與IR 組相比提高76.33%，與無(wú)刺激因子組相比提高66.80%，且顯著高于相同試驗(yàn)條件下二甲雙胍組的葡萄糖消耗量（P<0.01）。

添加白樺脂醇發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖在20～160 μg/mL 范圍均能促進(jìn)IR-HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量。其中多糖質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時(shí)（細(xì)胞培養(yǎng)24 h），葡萄糖消耗量較IR 組顯著提高（P<0.01），但略低于對(duì)照組；培養(yǎng)48 h 后，其葡萄糖消耗量較IR 組顯著提高（P<0.01），且高于對(duì)照組，較無(wú)刺激因子組提高20.08%。

綜上，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h 和48 h 后，添加不同刺激因子發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖均對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗具有促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果不一致，與IR 組相比，160 μg/mL 樺樹(shù)浸提汁組、40 μg/mL VB6組、80 μg/mL VB1組和白樺脂醇組發(fā)酵多糖均能顯著提高胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞48 h 的葡萄糖消耗量，且效果均好于無(wú)刺激因子組，其中VB6組的促進(jìn)效果最為顯著。

3 結(jié)論

在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加樺樹(shù)浸提汁后，產(chǎn)生的樺褐孔菌能夠促進(jìn)樺褐孔菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)多糖培養(yǎng)的正常及胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞葡萄糖的消耗量，證明樺樹(shù)中確實(shí)含有促進(jìn)樺褐孔菌子實(shí)體產(chǎn)生活性多糖的刺激因子，且樺樹(shù)浸提汁中的白樺脂醇、VB1和VB6均能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)多糖的降血糖活性起到不同程度的促進(jìn)作用，其中VB6的促進(jìn)效果最顯著，可能是由于添加不同刺激因子產(chǎn)生的發(fā)酵胞外多糖種類(lèi)和其單糖組成不同所致。后續(xù)可深入研究不同刺激因子對(duì)于樺褐孔菌活性多糖生成的調(diào)節(jié)機(jī)理，或?qū)ζ浼兓嗵堑臉?gòu)效關(guān)系進(jìn)一步討論，以期為調(diào)控樺褐孔菌高降血糖活性多糖的產(chǎn)生提供新的思路和理論基礎(chǔ)。