＊杜婕 張容彬 徐浩鵬 周廣帥

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇 212400）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國(guó)淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要經(jīng)濟(jì)物種。隨著現(xiàn)代集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，由細(xì)菌、病毒和螺原體引起的各種疾病在中華絨鰲蟹的主要養(yǎng)殖區(qū)種群中頻繁爆發(fā)[1-6]，給我國(guó)淡水蟹類(lèi)養(yǎng)殖造成了災(zāi)難性的經(jīng)濟(jì)損失。

中華絨鰲蟹作為甲殼動(dòng)物代表物種之一，雖其機(jī)體缺乏獲得性免疫系統(tǒng)-特異性免疫，但它們具備非特異性先天免疫系統(tǒng)來(lái)保護(hù)自己免受微生物病原體的侵害。甲殼動(dòng)物的血淋巴細(xì)胞在其先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮著最為重要的免疫防御作用。雖然至今國(guó)際上仍沒(méi)有一個(gè)明確的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，但一般認(rèn)為可分為3類(lèi)：大顆粒細(xì)胞（granular cells，GC）、小顆粒細(xì)胞（semi-granular cells，SGC）又稱(chēng)為半顆粒細(xì)胞，以及無(wú)顆粒細(xì)胞（agranular）或透明細(xì)胞（hyaline cells，HC）。通常認(rèn)為酚氧化酶類(lèi)主要存在于大顆粒細(xì)胞中，而小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞在吞噬病原和凝集作用中發(fā)揮著重要的作用。甲殼動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)（proPO系統(tǒng)），血淋巴的凝血過(guò)程、細(xì)胞吞噬和包裹作用、細(xì)胞凝集及各種機(jī)體通用和特有的抗菌肽（AMP）等來(lái)共同抵御病原菌的入侵[7]。AMP幾乎是所有甲殼動(dòng)物生命體中存在的關(guān)鍵防御效應(yīng)因子[8]?？咕脑诩讱?dòng)物先天免疫中表現(xiàn)出多種功能，包括殺菌活性和選擇性免疫調(diào)節(jié)作用[9-10]。由于抗菌肽具有抗革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌，以及真菌、病毒和原生動(dòng)物病原體的特性，因此非常適合作為新型抗生素及治療劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究[7,11]。

甲殼肽（Crustin）是甲殼動(dòng)物中重要的抗菌肽之一。第一個(gè)報(bào)道的甲殼肽是從濱蟹（Carcinus maenas）的血淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)的。它是一種分子量為11.5kDa的陽(yáng)離子蛋白，為一種疏水性抗菌肽，可用于抵御海洋革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[12]。至今約60多種甲殼肽類(lèi)基因已經(jīng)在多種不同的甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，包括蟹類(lèi)和對(duì)蝦類(lèi)[13-19]。在對(duì)蝦中的這些甲殼肽蛋白通常具有共同的結(jié)構(gòu)：它們均為疏水性蛋白質(zhì)，在C端區(qū)域具有單個(gè)乳清酸性蛋白（WAP）結(jié)構(gòu)域[20]。此結(jié)構(gòu)域包含50個(gè)氨基酸殘基和8個(gè)半胱氨酸殘基，形成四個(gè)二硫鍵，稱(chēng)為四二硫鍵核心結(jié)構(gòu)[13]，該結(jié)構(gòu)域包含多種功能，如蛋白酶抑制[21]和抗菌反應(yīng)[22]。關(guān)于抗菌活性，大多數(shù)研究表明有活性的甲殼肽（天然和重組的）表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性。例如上文提到的從C.maenas純化的甲殼肽對(duì)藤黃微球菌和草綠色氣球菌等有活性，而這些都是革蘭氏陽(yáng)性海洋細(xì)菌[12]。中國(guó)明對(duì)蝦的甲殼肽具有抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的活性，然而卻幾乎沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌或真菌的活性[23]。此外，也有部分研究[14-16,23]表明，甲殼肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌菌株均具有抗菌活性。

目前，多數(shù)研究人員集中在對(duì)中華鱉重要免疫基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆和分析，以及分子水平的表達(dá)模式和功能分析，但對(duì)其蛋白功能的研究報(bào)道較少。此外，對(duì)這些重要免疫因子在甲殼類(lèi)動(dòng)物中蛋白表達(dá)的研究主要是通過(guò)大腸桿菌原核系統(tǒng)[21-24]，而利用酵母真核系統(tǒng)表達(dá)基因的研究則較為有限。與大腸桿菌相比，酵母具有先進(jìn)的異源蛋白質(zhì)折疊途徑，此外，利用酵母信號(hào)序列可以讓酵母細(xì)胞分泌正確折疊和加工的蛋白質(zhì)。隨著工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酵母在臨床和工業(yè)重要蛋白質(zhì)的表達(dá)方面也表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)[25-26]。

釀酒酵母作為一種普遍被認(rèn)為安全的（GRAS）生物體，它廣泛應(yīng)用于食品和飲料行業(yè)，且已成功表達(dá)多種外源真核蛋白，例如：乙肝疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子和人體血管抑制劑等[27]。然而，利用釀酒酵母真核系統(tǒng)表達(dá)中華絨鰲蟹甲殼肽基因的研究較少。

在本研究中，我們利用釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)了一種中華絨鰲蟹甲殼肽（以下簡(jiǎn)稱(chēng)EsCrustin）。將EsCrustin基因的ORF克隆到質(zhì)粒載體pHAC181中，然后利用同源重組技術(shù)將重組質(zhì)粒整合到釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1中的GAL1的啟動(dòng)子下游以啟動(dòng)表達(dá)。在D-半乳糖的誘導(dǎo)下，目的蛋白EsCrustin在酵母細(xì)胞中表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的抗菌活性和抗菌功能進(jìn)行了初步研究。本研究旨在為甲殼類(lèi)動(dòng)物先天免疫提供有價(jià)值的理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期預(yù)防和控制水生甲殼動(dòng)物疾病的發(fā)生。

1.實(shí)驗(yàn)材料和方法

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)菌株

健康的中華絨螯蟹（平均體重25g）來(lái)自中國(guó)江蘇省句容的某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。購(gòu)買(mǎi)的中華絨鰲蟹飼養(yǎng)在紫外水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，該系統(tǒng)可保持在水溫為28±1℃下進(jìn)行充氣和過(guò)濾。在實(shí)驗(yàn)前2周，每天以4%體重的比例投喂商業(yè)蝦飼料（巴大飼料，南通）。

實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體pHAC181在LB液體培養(yǎng)基（10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，pH7.0）中于37℃培養(yǎng)，釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1在30℃ YPD培養(yǎng)基（10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖）中進(jìn)行培養(yǎng)。

(2)中華絨鰲蟹血淋巴中分離RNA及cDNA合成

用75%乙醇擦拭健康的中華絨鰲蟹進(jìn)行消毒，以500μL ACD-B（14.7g/L葡萄糖，4.8g/L檸檬酸，13.2g/L檸檬酸鈉）作為抗凝劑置于1mL注射器中從其腹部第二附肢中進(jìn)行血淋巴抽取。然后，將稀釋后的血淋巴在20℃以4000g離心5min，獲得血淋巴細(xì)胞，然后根據(jù)Trizol試劑盒（Takara，日本）的方法提取血淋巴總RNA。具體步驟為：將0.2mL氯仿及Trizol試劑（Takara，日本）加入到血淋巴細(xì)胞中，劇烈搖晃，靜置15min。將混合物4℃ 12000g離心15min，然后將分離出的上層水相中加入異丙醇（0.5mL），4℃、12000g離心10min。去上清，將所得沉淀用75%乙醇洗滌，然后進(jìn)行空氣干燥，最后溶解于20μL DEPC處理過(guò)的無(wú)菌水中。通過(guò)在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Eppendorf，德國(guó)）中測(cè)量260/280nm和260/230處的吸光度來(lái)評(píng)估RNA的濃度和質(zhì)量。選擇符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的RNA（1.8≤OD260/280≤2.1且OD260/230≥2.0）用于后續(xù)cDNA合成。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的總體完整性。使用PrimeScript RT Reagent Kit（Takara，日本）對(duì)1μg RNA進(jìn)行cDNA合成。

(3)表達(dá)載體的構(gòu)建及同源重組

將獲得的中華絨鰲蟹甲殼肽cDNA序列（EsCrustin，GenBank登錄號(hào)GQ200833.1）[28]使用5'末端分別帶有EcoR I和Sph I位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)使用質(zhì)粒pHAC181[29]作為目的基因克隆的載體（pHAC181是一種多拷貝質(zhì)粒，它是在商業(yè)化質(zhì)粒YEplac181中插入了三個(gè)HA標(biāo)簽）。在經(jīng)過(guò)酶切和T4 DNA連接酶（Takara，日本）孵育連接后，將混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1（TransGen，中國(guó)）中。菌落PCR后，通過(guò)限制酶來(lái)驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性重組質(zhì)粒是否正確。使用同源重組技術(shù)將目標(biāo)基因與重組質(zhì)粒的HA標(biāo)簽整合到釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1的GAL1啟動(dòng)子（S.cerevisiae GAL1-ScRCH1為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的菌株，用GAL1代替ScRCH1菌株的原啟動(dòng)子）下游，利用高保真PrimeSTARGXL DNA聚合酶（Takara，日本）和同源重組引物（表1）來(lái)擴(kuò)增同源重組長(zhǎng)片段，采用檢測(cè)引物用于驗(yàn)證整合是否成功（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的特異性引物

(4)重組蛋白EsCrustin的表達(dá)

將成功同源重組的菌株在D-半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YPG（20g/L Peptone、20g/L D-半乳糖、10g/L酵母提取物；D-半乳糖為誘導(dǎo)劑）30℃條件下220rpm劇烈振蕩培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物OD600達(dá)到1.0-1.5時(shí)，提取蛋白，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western Blot分析檢測(cè)重組蛋白EsCrustin的表達(dá)情況。

(5)SDS-PAGE及Western Blot分析

使用標(biāo)準(zhǔn)10% SDS-PAGE分析重組EsCrustin的表達(dá)。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色使蛋白質(zhì)條帶可視化。通過(guò)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)在電泳轉(zhuǎn)移裝置（Trans-blot SD，Bio-Rad）中以25V電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（Bio-Rad）上30min。然后將硝酸纖維膜用Tris緩沖鹽水（TBS：10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5）在室溫下洗滌10min，并在室溫下在封閉緩沖液（TBS緩沖液中的3%BSA）中孵育2h。隨后將膜用含有0.05%(v/v)Tween 20(TBST)的TBS在室溫下洗滌10min，并與抗HA抗體（Abcam，英國(guó)）在室溫下孵育2h。用TBS洗滌3次后，加入與辣根過(guò)氧化物酶（Abcam，英國(guó)）偶聯(lián)的二抗。孵育2h后，洗膜3次，采用曝光顯影法檢測(cè)重組蛋白，通過(guò)與蛋白Maker比對(duì)，以確認(rèn)重組表達(dá)的EsCrustin的分子量。

(6)抗菌活性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)抗菌活性驗(yàn)證所使用的菌株包括4種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌）和三種革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和葡萄球菌）。對(duì)于抗菌活性，最低抑菌濃度（MIC）值是通過(guò)液體生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)確定的[30]。本實(shí)驗(yàn)中使用貧肉湯營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（10g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl，pH7.5）來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)，細(xì)菌在30℃劇烈搖動(dòng)下培養(yǎng)24h，然后測(cè)定細(xì)菌懸浮液的OD600來(lái)檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)濃度，統(tǒng)一選擇對(duì)數(shù)期細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且將細(xì)菌濃度統(tǒng)一調(diào)整為OD600=0.001。將10μL的重組蛋白EsCrustin樣品（同時(shí)以釀酒酵母GAL1-ScRCH1空菌株作為陰性對(duì)照）在無(wú)菌96孔板中進(jìn)行孵育，在該板中每個(gè)孔中均有100μL對(duì)數(shù)期細(xì)菌培養(yǎng)物（統(tǒng)一稀釋為OD600=0.001）。MIC值為觀(guān)察到細(xì)菌生長(zhǎng)的重組蛋白EsCrustin最高濃度和導(dǎo)致100%抑制細(xì)菌生長(zhǎng)（殺菌）最低濃度之間的范圍。

(7)細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)

重組蛋白EsCrustin對(duì)細(xì)菌識(shí)別和凝集作用通過(guò)細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行測(cè)定[31]。本研究選取4種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌）和3種革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和葡萄球菌）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在貧肉湯培養(yǎng)基中將以上細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)且細(xì)菌濃度調(diào)整為1.0×107cells/mL，將10μL的重組蛋白EsCrustin（終濃度為20ug/μL）加入至90μL細(xì)菌懸浮液中，同時(shí)將不表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1蛋白作為陰性對(duì)照。將細(xì)菌與重組蛋白混合物在30℃下孵育過(guò)夜，然后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)菌。

(8)瓊脂平板擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性

將4種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌）和三種革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和葡萄球菌）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期且濃度統(tǒng)一調(diào)整為1.0×107cells/mL來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用玻璃珠將每種菌懸液100μL均勻涂布在LB平板中，然后將直徑為5mm的濾紙貼在平板上，在濾紙上滴入10μL重組EsCrustin蛋白。將平板在30℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀(guān)察抑菌圈。同時(shí)，設(shè)定不表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1為陰性對(duì)照。

(9)數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。使用one-way ANOVA分析的數(shù)據(jù)表示為平均值±SE，統(tǒng)計(jì)顯著性定義為P＜0.05。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)EsCrustin cDNA的克隆和同源重組

圖1A為本實(shí)驗(yàn)中釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建策略。從中華絨鰲蟹血淋巴中提取總RNA，并使用甲殼肽蛋白的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增出的目的cDNA開(kāi)放閱讀框（ORF）為336bp（圖1B），共編碼112個(gè)氨基酸。在酶切和T4DNA連接酶后，將cDNA片段與載體pHAC181連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中。通過(guò)限制酶驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（圖1C）。同源引物INT-F和INT-R擴(kuò)增的同源重組大片段為4705bp（圖1D），而檢測(cè)引物擴(kuò)增的633bp則表明該轉(zhuǎn)化子為正確的同源重組（圖1E）。

圖1 釀酒酵母菌株表達(dá)中華絨螯蟹Crustin的真核表達(dá)構(gòu)建策略圖

圖1A為酵母真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程；圖1B表示中華絨鰲蟹Crusin的cDNA開(kāi)放閱讀框（ORF）為336bp；圖1C表明通過(guò)酶切驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。圖1D表示重組質(zhì)粒采用高保真PrimeSTARGXLDNA聚合酶通過(guò)同源重組引物擴(kuò)增，其目的片段長(zhǎng)度為4705bp，圖1E表示檢測(cè)引物用于驗(yàn)證陽(yáng)性同源重組轉(zhuǎn)化子，目的片段為633bp的為同源重組成功的轉(zhuǎn)化子，M：Marker。

(2)蛋白表達(dá)及Western Blot分析

中華絨鰲蟹甲殼肽EsCrustincDNA在酵母真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。該表達(dá)載體在氨基末端具有3個(gè)HA標(biāo)簽，因此估測(cè)重組EsCrustin的分子量約為20kDa。將重組質(zhì)粒整合到釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1的GAL1啟動(dòng)子下游，YPG（20g/L蛋白胨、20g/LD-半乳糖、10g/L酵母提取物）用作誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過(guò)D-半乳糖誘導(dǎo)重組EsCrustin的表達(dá)。通過(guò)10%SDS-PAGE電泳分析表明，含有重組蛋白的釀酒酵母菌株可表達(dá)大小約為20kDa的蛋白質(zhì)，Western Blot分析表明，HA抗體與重組蛋白EsCrustin結(jié)合，且其分子量為20kDa，表明重組蛋白成功表達(dá)（圖2）。

圖2 Western blot驗(yàn)證重組蛋白EsCrustin的表達(dá)

用HA抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證表明，重組蛋白EsCrustin分子量約為20kDa，泳道1-3代表3個(gè)不同的同源重組轉(zhuǎn)化子均表達(dá)了目的蛋白。M：蛋白Marker。

(3)重組蛋白EsCrustin的抗菌活性

為了測(cè)定EsCrustin的抗菌活性，我們檢測(cè)了最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以評(píng)價(jià)抑菌和殺菌活性。重組蛋白EsCrustin對(duì)4種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌）和3種革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和葡萄球菌）的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。MIC和MBC值分別在0.467-0.921μM和0.887-1.135μM的范圍之內(nèi)（表2）。

表2 重組蛋白的抗菌功能

(4)細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證重組蛋白EsCrustin是否可以與微生物表面產(chǎn)生相互作用，我們用4種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌）和三種革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和葡萄球菌）進(jìn)行細(xì)菌凝集試驗(yàn)。結(jié)果表明，除銅綠假單胞菌外，所有革蘭氏陰性菌株都能被EsCrustin凝集（圖3A）。此外，實(shí)驗(yàn)中3種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌均可被重組蛋白凝集（圖3B）。以上結(jié)果表明，重組蛋白EsCrustin可識(shí)別部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的表面分子。另一方面，兩株甲殼動(dòng)物病原菌嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）發(fā)生凝集，表明重組蛋白EsCrustin可能為中華絨鰲蟹的一種重要的抗菌免疫蛋白。

圖3 細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)

圖3A顯示除銅綠假單胞菌外，其他3種革蘭氏陰性菌都被重組蛋白EsCrustin凝集，而圖3B中3種革蘭氏陽(yáng)性菌與對(duì)照蛋白相比均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。Bar：5μm。

(5)瓊脂糖平板擴(kuò)散法檢測(cè)重組蛋白抑菌活性

在涂布有嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）的平板上，重組蛋白EsCrustin明顯抑制其生長(zhǎng)，在平板上出現(xiàn)明顯的抑菌圈，且重組蛋白EsCrustin的抑菌圈明顯大于對(duì)照蛋白C。

本研究中采用瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)重組蛋白EsCrustin對(duì)不同細(xì)菌的抑制能力，觀(guān)察抑菌圈的出現(xiàn)及其大小。采用了革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和葡萄球菌）進(jìn)行測(cè)定。將這7種細(xì)菌均勻涂布在LB平板上，同時(shí)在平板上貼有濾紙，其上滴有10μL重組EsCrustin蛋白，將平板在30℃培養(yǎng)過(guò)夜后，可以觀(guān)察到在嗜水氣單胞菌平板上濾紙周?chē)霈F(xiàn)明顯的抑菌圈，且重組蛋白的抑菌圈明顯大于對(duì)照蛋白（對(duì)照蛋白為未表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1）（圖4）。其他6種菌在平板上抑菌圈不明顯。

圖4 瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)細(xì)菌抑菌圈

3.討論

Crustin作為一種甲殼動(dòng)物抗菌肽，因其抗菌的完整性而被認(rèn)為是一種重要的免疫基因，并且它被認(rèn)為在甲殼類(lèi)動(dòng)物的非特異免疫中非常重要，具體表現(xiàn)為它存在于機(jī)體血淋巴顆粒細(xì)胞，在其對(duì)病原微生物的胞吐中發(fā)揮重要作用[32]。本研究采用釀酒酵母表達(dá)中華絨鰲蟹甲殼肽，我們將EsCrustincDNAORF（336bp）克隆到載體pHAC181中，然后利用同源重組技術(shù)將重組質(zhì)粒整合到釀酒酵母菌株GAL1-ScRCH1中GAL1啟動(dòng)子的下游，最后成功構(gòu)建重組蛋白，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加D-半乳糖使重組甲殼肽蛋白過(guò)表達(dá)，經(jīng)過(guò)收集、裂解將總蛋白在10%SDS-PAGE上進(jìn)行分析。WesternBlot表明重組蛋白EsCrustin的分子量約為20kDa（圖2）。

前期的研究表明，甲殼肽EsCrustin序列在N端包含一個(gè)19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，在C端包含一個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域[28]，WAP結(jié)構(gòu)域已被描述為具有多種功能，例如包括蛋白酶抑制作用[21]和抗菌活性[22-33]。多數(shù)報(bào)道中，甲殼肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有活性，例如從C.maenas純化的第一個(gè)甲殼肽，它對(duì)柑橘假單胞菌、科庫(kù)里假單胞菌、藤黃假單胞菌和草綠色細(xì)菌均表現(xiàn)了抗菌活性[12]。此外，也有研究表明，甲殼肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌均具有抗菌活性[14-18]。在我們的研究中，重組蛋白EsCrustin的抗菌活性在4種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌）和三種革蘭氏陽(yáng)性菌（包括枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、葡萄球菌）中進(jìn)行。結(jié)果表明，重組蛋白EsCrustin對(duì)4種革蘭氏陰性菌和3種革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，其中MIC和MBC值分別為0.467-0.921μM和0.887-1.135μM（表2）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的報(bào)道相似，斑節(jié)對(duì)蝦的甲殼肽重組蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌[17-18]均表現(xiàn)出明顯的抗菌活性。此外，高等動(dòng)物中的幾種含有WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，例如SLPI（分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑）[34-35]、彈性蛋白[36-37]對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌也都表現(xiàn)出抗菌活性。以上結(jié)果表明，不同的甲殼肽可能具有不同的生物學(xué)功能，它們?cè)诩讱?dòng)物的免疫防御系統(tǒng)中對(duì)細(xì)菌的抗菌活性具有選擇性。

本研究用細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)重組蛋白EsCrustin是否與微生物表面相互作用，結(jié)果顯示重組蛋白EsCrustin可凝集除銅綠假單胞菌外的其他六種細(xì)菌。因此，重組表達(dá)的EsCrustin可有效地凝集某些入侵的細(xì)菌并抑制其進(jìn)一步的感染到機(jī)體組織。重組蛋白EsCrustin可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖并與其底物結(jié)合，從而有效識(shí)別并凝集病原體。根據(jù)Christie的研究，蛋白質(zhì)中WAP結(jié)構(gòu)域的存在為甲殼肽蛋白分子提供了蛋白酶抑制活性和抗菌活性[38]。本文的細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)也表明EsCrustin是一種有效的抗菌肽，可抵抗部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。此外，瓊脂平板擴(kuò)散法也表明重組蛋白EsCrustin對(duì)嗜水氣單胞菌具有明顯的抑菌作用。因此，本研究結(jié)果表明EsCrustin是甲殼類(lèi)動(dòng)物中一種重要的先天免疫因子，它是可直接對(duì)細(xì)菌起到效應(yīng)作用的抗菌蛋白。

綜上，本研究將中華絨鰲蟹甲殼肽EsCrustin在釀酒酵母真核系統(tǒng)中成功表達(dá)且預(yù)測(cè)其蛋白分子量約為20kDa。重組蛋白的抗菌活性表明，EsCrustin是甲殼類(lèi)先天免疫系統(tǒng)中一種重要的免疫因子，而這種具有抗菌活性的甲殼肽可應(yīng)用于水產(chǎn)健康養(yǎng)殖領(lǐng)域以控制細(xì)菌和病原體的侵染及促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生態(tài)、健康發(fā)展。