＊徐佳元 袁洪超 王翠萍 張宇航 馮自立,4* 陳旺,4

（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院 陜西 723000 2.陜西金慧方中藥科技有限公司 陜西 723000 3.陜西天谷藥業(yè)有限公司 陜西 723000 4.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室 陜西 723000）

巫山淫羊藿（Epimedium wushanense T.S.Ying）為淫羊藿的5個來源之一，對于人體有著滋補腎陽，強壯筋骨等作用[1]。其黃酮類成分，主要成分以朝藿定C為主，其含量與其他淫羊藿有一定差異[2-5]。淫羊藿黃酮類化合物的含量受藥材品種來源和炮制工藝影響較大[6-9]。因此，本研究主要通過HPLC法測定巫山淫羊藿模擬炮制過程中黃酮類成分的含量，比較在不同溫度和受熱時間下的變化趨勢，以期達到更多淫羊藿多糖苷向低糖苷或苷元的轉化。

1.儀器與試藥

YB-2500A多功能粉碎機，永康市速峰工貿有限公司；JA5003電子天平，上海衡平儀器儀表廠；101-3A電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1260 lnfinity高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

對照品朝藿定A、B、C和淫羊藿苷，為陜西樂博生化科技有限公司產(chǎn)品（產(chǎn)地：陜西，批號：20191010）。炮制所用淫羊藿為巫山淫羊藿，陜西金慧方中藥科技有限公司產(chǎn)品（產(chǎn)地：漢中）。

2.方法與結果

(1)色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱：4.6mm×250mm，5μm；流動相：乙腈：0.1%磷酸水溶液=30:70；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：270nm。混合對照品、未處理樣品及160℃炮制20min后色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、未炮制淫羊藿樣品(B)和160℃炮制20min淫羊藿樣品(C)色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substance(A),unprocessed Epimedium sample (B) and processed epimedium sample (C) at 160℃ for 20 minutes

(2)樣品篩選與制備

①樣品篩選

由表1可以看出朝藿定A和B在海拔1400m處含量最高，朝藿定C在海拔1100m處含量最高，淫羊藿苷在海拔800m時含量較高但不穩(wěn)定。因此選取淫羊藿苷含量較少的1400m藥材進行實驗。

表1 不同海拔淫羊藿黃酮含量表Tab.1 Flavonoids content of Epimedium at various altitudes

②樣品制備

巫山淫羊藿葉片切制成1cm寬的條狀，分別放入電熱鼓風干燥箱中模擬炮制，于100℃、120℃、140℃、160℃和180℃下加熱炮制，其中在100℃、120℃、140℃下炮制時，分別于1h，2h，4h，8h，12h時間點取出適量樣品晾至室溫，而在160℃、180℃下進行炮制時，于10min，20min，40min，80min，120min時間點取出樣品晾干，晾至室溫后，用多功能粉碎機將其粉碎成粉末，裝入封裝袋內保存，備用。

(3)溶液的制備

①混合對照品額配制。精密稱取對照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷適量。用甲醇溶解配制為朝藿定A35.75g/mL、朝藿定B55g/mL、朝藿定C200g/mL和淫羊藿苷100.8g/mL的混合溶液。

②供試品溶液的配制。精密稱取淫羊藿粉末約0.2g，于具塞錐形瓶中，加入50%的乙醇20mL，在天平上稱定重量，超聲處理40min，再次稱定重量，算出兩次重量差值，并用50%乙醇補足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得到淫羊藿供試品儲備液。平行制備3份供試品溶液，計算朝藿定A、B、C與淫羊藿苷含量的RSD值。

(4)方法學考察

①線性關系考察。將混合對照品工作液分別以1μL、2μL、6μL、10μL、14μL和18μL進樣，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標繪制標準曲線見表2。

表2 對照品標準曲線Tab.2 Standard curve table of reference substance

②精密度試驗。精密稱取混合對照品工作液10μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，各對照品峰面積RSD值為：朝藿定A 0.08%、朝藿定B 0.13%、朝藿定C 0.09%、淫羊藿苷0.12%，表明本試驗方法精密度良好。

③穩(wěn)定性試驗。精密稱取供試溶液分別于制備后的0h、12h、24h、36h和48h測定，計算朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的含量RSD值：朝藿定A 0.36%、朝藿定B 1.82%、朝藿定C 1.52%、淫羊藿苷3.01%。表明所制得的供試品在48h內穩(wěn)定。

④加樣回收率試驗。精密稱取己知含量的淫羊藿樣品于容量瓶中，加入相同含量的混合對照品溶液，制備供試品溶液，共3份，按同一色譜條件測定，計算朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的平均加樣回收率和含量RSD值分別為：朝藿定A 88%、3.89%，朝藿定B 97%、4.42%，朝藿定C 104%、3.31%，淫羊藿苷91%、2.43%。

(5)樣品測定與數(shù)據(jù)處理

將供試樣品溶液按上述色譜條件進行測定，應用SPSS 22.0進行單變量2因素方差分析。

(6)不同溫度與受熱時間對炮制淫羊藿過程中黃酮類成分含量的影響分析

為說明淫羊藿炮制過程中黃酮類成分含量是否受不同溫度與受熱時間的影響及影響大小，對黃酮類化合物含量的變化進行組內方差分析。結果見表3。

表3 不同溫度與受熱時間對黃酮類化合物含量影響的方差分析Tab.3 Variance analysis of the influence of different temperature and heating time on the content of flavonoids

從表5可見，炮制淫羊藿過程中溫度對朝藿定A、B的含量無顯著影響（P＞0.05），對朝藿定C和淫羊藿苷的含量有顯著影響（P＜0.05）；受熱時間對朝藿定A、B、C的含量無顯著影響（P＞0.05），受熱時間對淫羊藿苷有顯著影響（P＜0.05）。

(7)炮制淫羊藿過程中黃酮類成分含量隨受熱時間變化趨勢圖

巫山淫羊藿葉片主要成分在100℃下加熱的含量變化圖如圖2(A)所示，淫羊藿中朝藿定A、B、C含量整體降低，淫羊藿苷含量增加，炮制12h后朝藿定A、B、C降低幅度分別為-23.00%、-23.88%、-1.74%，淫羊藿苷上升幅度為+168.27%，在120℃下加熱的含量變化圖如圖2(B)所示，朝藿定A、B、C隨時間增加含量降低，炮制12h后朝藿定A、B、C含量降低幅度分別為-25.8%、-26.11%、-7.69%，淫羊藿苷含量增加，上升幅度為+555.77%，在140℃下加熱含量變化圖如圖2(C)所示，朝藿定A、B、C隨時間增加含量降低，在12h時分別降低至-28.64%，-35.07%，-28.57%，淫羊藿苷先增后減，淫羊藿苷在炮制1h時含量上升至+572.11%，12h時又降低至+241.35%；在160℃下加熱含量變化圖如圖2(D)所示，在40min內，朝藿定A、B、C和淫羊藿苷含量變化明顯，變化幅度明顯分別為-60.56%，-52.99%，-8.96%，+330.77%，隨后含量變化逐漸平穩(wěn)，其中在20min時淫羊藿苷含量上升達到最大值+856.08%；在180℃下加熱含量變化圖如圖2(E)所示，朝藿定A、B、C含量整體呈下降幅度較大，降幅分別為-84.51%，-64.55%，-70.13%，淫羊藿苷含量在1h時先增至+317.31%，12h時又降至+13.46%。

圖2 在100℃(A)、120℃(B)、140℃(C)、160℃(D)、180℃(E)和不同時間模擬炮制過程中朝藿定A、B、C和淫羊藿苷含量的變化趨勢圖Fig.2 The content of chahuidine A,B,C and icariin during processing at 100℃(A),120℃(B),140℃(C),160℃(D),180℃(E) and different times change trend chart

綜合上述結果表明巫山淫羊藿葉片在100℃、120℃、140℃、160℃和180℃模擬炮制過程含量變化規(guī)律為在相同的溫度下，隨著加熱時間的增加，多糖苷（朝藿定A、B、C）含量減少，低糖苷（淫羊藿苷）隨加熱時間含量先增加后減少。推測巫山淫羊藿葉片在加熱過程中存在多糖苷向低糖苷轉化。

3.結論與討論

本試驗通過探究受熱溫度與時間對巫山淫羊藿中黃酮類成分的影響，獲得淫羊藿藥材的最佳炮制工藝。

經(jīng)分析統(tǒng)計，朝藿定A、B含量隨受熱時間增加含量呈下降趨勢，可能是由于其在巫山淫羊藿中含量較低；朝藿定C含量在100℃、120℃、140℃、160℃和180℃炮制過程中含量均呈降低趨勢；不同溫度下淫羊藿苷含量隨著時間變化各不相同，但整體均呈增加趨勢，并在160℃炮制20min時達到含量最大值，高于藥典標準（0.50%）約一倍。因此，本實驗結果將為在有限資源條件下充分利用巫山淫羊藿提供有價值的基礎數(shù)據(jù)。