呂娉婷，付 瑤，宋 慧

（遼寧省遼陽市中心醫(yī)院 1.藥學(xué)部；2.藥庫；3.藥局，遼陽 111000）

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在全球惡性腫瘤中居第四位[1]，在我國惡性腫瘤發(fā)病率中排第二，病死率排第三[2]。食管癌的危險因素包括遺傳背景、吸煙、飲酒、胃食管反流病、飲食和肥胖等[3]。由于食管癌早期無癥狀，多數(shù)患者在初診時已處于晚期，目前對于食管癌晚期患者的治療手段有限，患者的預(yù)后仍然較差[4]。中藥在食管癌的治療中取得了較大的療效，其作為臨床化療藥物的補充治療顯著改善了食管癌患者的預(yù)后[5]。小白菊內(nèi)酯（parthenolide，PTL）是傳統(tǒng)藥材芳香植物小白菊（tanacetum parthenium）的主要活性成分，具有較強的抗炎、抑菌、解痙作用。研究發(fā)現(xiàn)，PTL能明顯抑制肺癌、結(jié)直腸癌及食管癌細胞的增殖、遷移和凋亡[6-8]，表明PTL 具有抗腫瘤活性。自噬是不同于細胞凋亡的另一種程序性死亡現(xiàn)象，對于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬對于腫瘤的生長起到了負性調(diào)控作用[9]。本研究旨在探討PTL調(diào)控自噬抑制食管癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞和主要試劑 PTL、自噬抑制劑3-MA 和自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin 均購自美國Selleckchem 公司；食管癌細胞系Eca109 購自中國上?？茖W(xué)院細胞庫；DMEM 細胞培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自上海弘順生物科技有限公司；MTS細胞增殖試劑盒購自中國北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購自美國Coring公司；高效蛋白裂解液購自上海貝博生物科技公司；BCA蛋白濃度檢測試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自北京索萊寶試劑公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；P62、Beclin1、LC3 Ⅱ和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 食管癌細胞Eca109 快速復(fù)蘇后，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h更換細胞培養(yǎng)基，當細胞匯合度達到70%時，胰酶消化、傳代，取生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

1.3 MTS法檢測細胞增殖 用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.5×104個/mL，以每孔100μL細胞懸液接種至96 孔板，分為不同濃度（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 和40 μmol/L）PTL組和對照組（NC 組、0 μmol/L PTL），每組6 個平行復(fù)孔。處理48 h 后，更換100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，每孔加入20 μL 的MTS 試劑，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率=（1－OD 值PTL 組/OD 值NC 組）×100%。

采用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，以2 mL/孔細胞懸液接種于6 孔板，分為4組：NC 組、PTL 組、PTL+Rapamycin 組、PTL+3-MA組。PTL組加入10 μmol/L PTL，PTL+Rapamycin組加入10 μmol/L PTL 和10 μmol/L Rapamycin，PTL+3-MA 組加入10 μmol/L PTL 和5 μmol/L 3-MA，NC組加入等量二甲基亞砜（DMSO）。同以上方法檢測各組細胞增殖抑制率。實驗重復(fù)3次。

1.4 Transwell檢測細胞遷移 用DMEM無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，以100 μL/孔細胞懸液接種于Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上，Transwell 小室的下室加入500μL DMEM 完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。穿膜細胞經(jīng)PBS 洗滌3 次，置于甲醇溶液中固定10 min，吉姆薩染色30 min。顯微鏡下觀察，計算穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.5 裸鼠皮下成瘤實驗檢測細胞體內(nèi)生長能力 用PBS 調(diào)整細胞濃度為5×107個/mL，以100μL/只細胞懸液注射于裸鼠左側(cè)腋下。給予動物充足的水和食物，并在適宜的環(huán)境中飼養(yǎng)。將成瘤裸鼠隨機分為NC組和PTL組，每組6只。注射食管癌細胞1周后，PTL組灌胃給予2 mg/kg PTL，NC組灌胃給予等量DMSO，每隔一天灌胃1 次，連續(xù)21 d。每周觀察成瘤情況，測量裸鼠成瘤的體積。給藥結(jié)束時，將瘤體剝離出，對瘤體進行稱重。

1.6 Western blotting法檢測自噬相關(guān)蛋白表達

加入高效蛋白裂解液裂解細胞，4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，取上清，BCA 法檢測蛋白濃度，煮沸使蛋白變性；每組取50μg 蛋白，行SDS-PAGE 電泳（80 V、2 h），濕轉(zhuǎn)法（350 mA、1.5 h）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；8%脫脂牛奶室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；加入一抗P62、Beclin1、LC3Ⅱ（均1∶500）和GAPDH（1∶1 000），置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜3次；加入二抗（1∶8 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次。采用ECL 化學(xué)發(fā)光法凝膠成像系統(tǒng)Dolphin-View顯示蛋白條帶。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達量。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTL抑制食管癌細胞Eca109增殖 0 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 和40 μmol/L 組PTL 細胞增殖抑制率分別為（0.52±0.23）%、（14.16±3.04）%、（25.47±5.59）%、（42.25±2.36）%、（63.32±7.89）%和（75.18±5.34）%，PTL呈濃度依賴性地抑制食管癌細胞Eca109 的增殖（均P＜0.05），PTL 作用Eca109 細胞IC50值為（9.53±1.28）μmol/L。

2.2 PTL調(diào)控自噬對食管癌細胞增殖能力的影響 與NC 組比較，PTL 組、PTL+Rapamycin 組和PTL+3-MA 組細胞增殖抑制率升高，即細胞增殖能力降低（均P＜0.05）；與PTL 組比較，PTL+Rapamycin 組細胞增殖抑制率升高，即細胞增殖能力降低（P＜0.05），PTL+3-MA 組細胞增殖抑制率降低，即細胞增殖能力升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 4組食管癌細胞增殖能力比較

2.3 PTL調(diào)控自噬對食管癌細胞遷移能力的影響 與NC 組比較，PTL 組、PTL+Rapamycin 組和PTL+3-MA 組穿膜細胞數(shù)明顯減少，即細胞遷移能力降低（均P＜0.05）；與PTL 組比較，PTL+Rapamycin 組穿膜細胞數(shù)明顯減少，即細胞遷移能力降低（P＜0.05），PTL+3-MA 組穿膜細胞數(shù)明顯增加，即細胞遷移能力升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 4組食管癌細胞遷移能力比較

2.4 PTL 抑制食管癌細胞體內(nèi)生長 裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示，PTL 組成瘤體積為（140.57±13.54）mm3，明顯低于NC 組的（328.38±13.76）mm3（t=23.830，P=0.006）；PTL 組成瘤體重為（20.82±5.17）mg，明顯低于NC 組的（37.65±8.36）mg（t=23.830，P=0.006），見圖3。

圖3 裸鼠皮下成瘤實驗檢測Eca109細胞體內(nèi)生長能力

2.5 PTL 對食管癌細胞Eca109 自噬相關(guān)蛋白表達的影響 與NC 組比較，PTL 組、PTL+Rapamycin組和PTL+3-MA 組P62、Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達量均顯著升高（均P＜0.05）；與PTL 組比較，PTL+Rapamycin組P62、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），PTL+3-MA 組P62、Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 4組食管癌細胞自噬相關(guān)蛋白表達量比較

3 討論

目前新輔助療法、手術(shù)切除、放療和化學(xué)療法是食管癌患者的主要治療方法，但是食管癌患者的預(yù)后仍然不理想[4]。與肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤不同，分子靶向治療已廣泛應(yīng)用于臨床治療，目前尚未開發(fā)出專門針對食管癌的靶向療法[4]。中草藥在亞洲已經(jīng)使用了數(shù)千年，不僅具有抗炎活性，并含有豐富的抗癌化合物，已長期用作抗腫瘤藥物，可在腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫中發(fā)揮直接的細胞毒性作用和間接調(diào)控作用，并改善化療藥物的副作用[10]。雙氫青蒿素等中草藥具有較低的毒性，能提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期[5,10]。

PTL屬于天然倍半萜內(nèi)酯，包含α-亞甲基-γ-內(nèi)酯環(huán)和環(huán)氧基團，使得其能夠與生物分子的親核位點相互作用，PTL一直被用作消炎和抗偏頭痛的特性草藥，最近其抗癌活性被逐漸發(fā)現(xiàn)[11]。PTL 可通過調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)蛋白，用于抑制和治療尼古丁相關(guān)的肺癌[6]。在結(jié)直腸癌中，PTL 通過抑制間充質(zhì)蛋白的表達抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力降低[7]。另有文獻報道，PTL 可減弱食管癌Eca109 和KYSE-510 細胞在體外的增殖、遷移和血管生成能力，以及抑制小鼠異種移植瘤生長[8]；并通過抑制NF-κB 信號通路，調(diào)控腫瘤生長、血管生成等相關(guān)基因的表達[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTL呈濃度依賴性地抑制食管癌細胞Eca109增殖、遷移及裸鼠體內(nèi)生長（P＜0.05）。

自噬是維持真核細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的進化保守過程，在蛋白質(zhì)和細胞器的降解和代謝中起主要作用。自噬是一把“雙刃劍”，在某些情況下會觸發(fā)腫瘤細胞的死亡，而有些研究顯示自噬增強腫瘤細胞生長能力[9]。中藥通過誘導(dǎo)自噬抑制惡性腫瘤的進展是其發(fā)揮抗癌作用的重要機制，研究報道，PTL 呈濃度依賴性地增加胰腺癌細胞自噬，誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。PTL 通過誘導(dǎo)自噬在體內(nèi)、外抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的生長和遷移能力[14]。而自噬相關(guān)蛋白的改變是細胞自噬的關(guān)鍵，Beclin1基因是自噬必需的，其缺失等位基因在食管癌中被報道[15]。而自噬受體蛋白P62及自噬發(fā)生的執(zhí)行者LC3II表達增加均促進細胞自噬[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTL 促進P62、Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達（P＜0.05），表明PTL 促進食管癌細胞的自噬。那么，PTL 是否通過調(diào)控細胞自噬抑制食管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力？本組進一步采用自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin及自噬抑制劑3-MA 與PTL 共同處理食管癌細胞，結(jié)果顯示，與Rapamycin 聯(lián)合干預(yù)細胞后，PTL 對食管癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用增強；而與3-MA 共同干預(yù)細胞，PTL 對食管癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用減弱（P＜0.05），表明PTL通過促進細胞自噬在食管癌中發(fā)揮抗癌作用。

綜上所述，PTL 通過促進細胞自噬抑制食管癌細胞的增殖和遷移及體內(nèi)移植瘤生長，有望成為治療食管癌的新型藥物。