王水元，楊立志，李 明，崔 浩，熊 毅，高 舉

（1.洪湖市人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，洪湖 433200；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，武漢 430000）

隨著人們對體育競技的重視，教練員和運動員常采用超負(fù)荷訓(xùn)練以提高運動和競技能力。但超負(fù)荷運動后，骨骼肌纖維會出現(xiàn)運動性肌肉損傷，不僅會出現(xiàn)延遲性肌肉酸痛還會使運動能力下降，若不采取及時治療，將會加劇肌肉損傷，并造成慢性疼痛[1-2]。目前對于超負(fù)荷運動導(dǎo)致的骨骼肌損傷，主要依靠生化藥物來緩解治療，然而這些藥物在被人體吸收的同時會產(chǎn)生代謝廢物，有些代謝廢物會產(chǎn)生毒副作用[3]。因此，探索出促進骨骼肌損傷快速恢復(fù)的安全有效的方法是目前運動醫(yī)學(xué)界的當(dāng)務(wù)之急。針灸是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方式，和藥物治療相比，具有其特有的優(yōu)勢，且在肌肉勞損等病癥方面已取得不錯效果[4-5]。相關(guān)研究報道，針刺可以促進超負(fù)荷訓(xùn)練后骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，從而改善超負(fù)荷訓(xùn)練對骨骼肌的損傷程度[6]?？酌返萚7]研究報道，針刺干預(yù)可以有效增加肌膜下線粒體融合程度，減少胞膜窖數(shù)量，從而抑制超負(fù)荷運動引起的骨骼肌肌束膜銜接盤結(jié)構(gòu)域的變化。劉曉然等[8]研究報道，針刺可以緩解骨骼肌微管的損傷，從而促進超負(fù)荷運動后骨骼肌的修復(fù)。但對于針刺在超負(fù)荷運動致骨骼肌損傷中是如何發(fā)揮修復(fù)作用的，其具體機制尚無定論。本研究旨在通過對大鼠進行超負(fù)荷訓(xùn)練以構(gòu)建超負(fù)荷運動致骨骼肌損傷大鼠模型，予以針刺干預(yù)，探討針刺對超負(fù)荷運動致大鼠骨骼肌損傷及相關(guān)信號通路的影響，以期為針刺在超負(fù)荷運動所致骨骼肌損傷的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

清潔級健康雄性SD 大鼠（許可證號：SYXK 2019-0108）60 只，45～55 日齡，體重250～300 g，購自勁牌有限公司；本實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)同意且本動物實驗嚴(yán)格遵循動物實驗減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）-3R原則。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號：RJ15503）購自上海仁捷生物有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（貨號：ml097316）、琥珀酸脫氫酶（succinic acid dehydrogenase，SDH）試劑盒（貨號：SDH）和超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號：ml077379）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（貨號：ml076592）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒（貨號：ml076416）均購自酶聯(lián)生物有限公司；RAPI蛋白裂解液（貨號：89900）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；PI3K抗體（貨號：sc-365290）、AKT 抗體（貨號：sc-5298）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司；山羊抗大鼠IgG 二抗購自Abbkine 公司；內(nèi)參小鼠抗β-肌動蛋白抗體（β-actin，貨號：SY0632-QIK）購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司。CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；MH-2 型微型振蕩儀購自北京銘成基業(yè)科技有限公司；SAF-680T酶標(biāo)儀購自上海巴玖公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建

將適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后的60 只大鼠隨機分為5 組：健康對照組、超負(fù)荷組、針刺組、超負(fù)荷+針刺組，每組15只。健康對照組和針刺組不進行運動干預(yù)，超負(fù)荷組和超負(fù)荷+針刺組參照文獻[9]通過超負(fù)荷運動建立骨骼肌損傷模型，具體操作如下：在1 m3的池中注深度為70 cm 的水，并使水溫在33 ℃左右，第1 周每次先讓超負(fù)荷組、超負(fù)荷+針刺組的大鼠入水中適應(yīng)水性1 h，然后讓大鼠負(fù)重其體質(zhì)量5%的重物在水中訓(xùn)練1 h；第2 周則每次直接讓大鼠負(fù)重其體質(zhì)量8%的重物訓(xùn)練2 h。每組隨機選取1 只大鼠檢測血清睪酮與皮質(zhì)酮水平，與健康對照組比較，若血清睪酮與皮質(zhì)酮的比值下降40%[10]及以上，則表示造模成功。針刺組和超負(fù)荷+針刺組大鼠根據(jù)《實用動物針灸手冊》的標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻[11]每次在大鼠超負(fù)荷運動后針刺大鼠雙側(cè)足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴，留針20 min。造模及針刺過程中，健康對照組無動物死亡，超負(fù)荷組死亡3 只，針刺組死亡1 只，超負(fù)荷+針刺組死亡2 只，剩余54只全部進行實驗。

1.2.2 血清CK和LDH活性檢測

針刺干預(yù)結(jié)束后，每組隨機選取6 只大鼠，經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，將大鼠斷頸處死，分別取血清和骨骼肌組織，骨骼肌組織放入超低溫冰箱中備用。血清于4 ℃下靜置0.5 h 后，進行離心操作（3 000 r/min，10 min），分離血清。然后，按照試劑盒操作指南，檢測大鼠血清中CK和LDH含量水平。

1.2.3 骨骼肌中氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)水平檢測

取冰箱備用的部分骨骼肌組織，經(jīng)0.9%生理鹽水漂洗后，擦干稱重，置于小燒杯中。用移液管量取0.86%的預(yù)冷生理鹽水3 mL 和剪碎的組織倒入勻漿管中，充分研磨使組織勻漿化；然后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)進行離心操作（3 000 r/min，10 min），離心后取下層沉淀，通過超聲破碎儀將骨骼肌的線粒體破碎，加入2 mL裂解液，根據(jù)試劑盒說明操作，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組大鼠骨骼肌組織勻漿中MAD、GSH-Px、SDH和SOD水平。

1.2.4 蘇木精—伊紅（HE）染色

針刺干預(yù)結(jié)束后，每組隨機選取3 只大鼠，經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，將大鼠斷頸處死，取部分骨骼肌組織，剩余骨骼肌組織放入超低溫冰箱中備用。將骨骼肌組織在4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中清洗，在冰上將組織剪成小塊，置入濃度為10%的甲醛溶液中固定，待一天一夜后，置入乙醇脫水3 h；然后進行石蠟包埋、切片操作，放入60 ℃恒溫箱20 min，把烤干的玻片放置在染色架上，然后放進二甲苯與乙醇等比混合液中，浸泡12 min后再放入二甲苯浸泡20 min，乙醇中浸泡25 min，將二甲苯洗后，放蒸餾水中浸泡2 min，蘇木精中染色2 min，在小流量水下沖洗4 min，再放入伊紅溶液中浸泡20 s，置于60 ℃恒溫15 min，在乙醇中脫水6 min，二甲苯中浸泡20 min，然后通過樹膠封片，烘干后，在生物顯微鏡下觀片。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

取HE 染色中部分剩余骨骼肌組織，將其剪碎約1 mm3大小，搓洗后收集細(xì)胞懸液，然后進行離心，除去上清，用70%乙醇固定，經(jīng)PBS 洗滌后，加入100 μL二甲基亞砜、20 μLAnnexinV-FITC及20 μL PI，37 ℃避光反應(yīng)20 min，在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法

取HE 染色中剩余骨骼肌組織，在液氮中進行研磨，研磨后加入到RAPI裂解液中進行勻漿，然后進行離心操作（4 ℃，12 000 r/min），離心12 min，離心后EP管中液體分三層取上清液，通過蛋白質(zhì)定量法測定蛋白含量后，進行SDS-PAGE電泳，通過半干法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉在搖床中進行封閉（37 ℃，1 h），加入一抗（1∶1 000）（PI3K，AKT，Bcl-2和Bax抗體），β-actin（1∶1 000），4 ℃過夜，IgG二抗（1∶2 000），37 ℃下孵育1 h，顯色成像并通過Image-ProPlus軟件分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對大鼠血清指標(biāo)的影響

與健康對照組比較，超負(fù)荷組大鼠血清CK 和LDH水平明顯升高（P＜0.05）；與超負(fù)荷組比較，針刺組和超負(fù)荷+針刺組血清CK和LDH水平明顯降低（P＜0.05）；與針刺組比較，超負(fù)荷+針刺組血清CK和LDH水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清CK和LDH水平比較，n=6

表1 各組大鼠血清CK和LDH水平比較，n=6

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負(fù)荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

2.2 針刺對大鼠骼肌氧化應(yīng)激水平的影響

與健康對照組比較，超負(fù)荷組大鼠MDA 水平明顯升高，SOD、GSH-Px 和SDH 和水平明顯降低（P＜0.05）；與超負(fù)荷組比較，針刺組和超負(fù)荷+針刺組MDA 水平明顯降低（P＜0.05），GSH-Px、SOD、SDH 水平顯著升高（P＜0.05）；與針刺組比較，超負(fù)荷+針刺組MDA 水平顯著升高，GSH-Px、SOD 和SDH水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌中SOD、GSH-Px和SDH水平比較，n=6

表2 各組大鼠骨骼肌中SOD、GSH-Px和SDH水平比較，n=6

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負(fù)荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

2.3 HE染色觀察針刺對大鼠骨骼肌損傷病理形態(tài)學(xué)的影響

HE 染色結(jié)果顯示，健康對照組和針刺組大鼠的骨骼肌未見異常，肌纖維完整，細(xì)胞核大小形態(tài)均正常；超負(fù)荷組大鼠骨骼肌肌纖維不完整，肌纖維間細(xì)胞增生，細(xì)胞核固縮、溶解，可見炎性細(xì)胞浸潤，膠原纖維增生嚴(yán)重；超負(fù)荷運動+針刺組病理程度明顯減輕，只有少量炎性細(xì)胞浸潤，肌纖維間細(xì)胞增生也明顯變少。

2.4 針刺對大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響

健康對照組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡率為（7.12±1.02）%、超負(fù)荷組為（28.64±2.31）%、針刺組為（9.03±1.25）%、超負(fù)荷+針刺組為（15.02±1.53）%（F=110.42，P＜0.001），與健康對照組比較，超負(fù)荷組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；針刺組與健康對照組的骨骼肌細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與超負(fù)荷組比較，超負(fù)荷+針刺組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖1 HE染色觀察大鼠骨骼肌病理學(xué)變化（×400）

圖2 各組大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡染色圖

2.5 針刺對大鼠骨骼肌PI3K/AKT 信號通路的影響

與健康對照組比較，超負(fù)荷組PI3K、AKT 蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；針刺組中PI3K、AKT蛋白水平與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與超負(fù)荷組比較，超負(fù)荷+針刺組組大鼠骨骼肌PI3K、AKT 蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 各組信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較，n=3

表3 各組信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較，n=3

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負(fù)荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

圖3 針刺對PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的影響

2.6 針刺對大鼠骨骼肌凋亡蛋白表達的影響

與健康對照組比較，超負(fù)荷組Bcl-2 蛋白水平明顯下調(diào)，Bax蛋白水平明顯上調(diào)（均P＜0.05）。與超負(fù)荷組比較，超負(fù)荷+針刺組大鼠骨骼肌Bcl-2蛋白水平無顯著差異（P＞0.05），Bax蛋白水平明顯下調(diào)（均P＜0.05），見圖4、表4。

圖4 針刺對凋亡相關(guān)蛋白的影響

表4 各組凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較，n=3

表4 各組凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較，n=3

與健康對照組比較，*P＜0.05；與超負(fù)荷組比較，#P＜0.05；與針刺組比較，&P＜0.05。

3 討論

針刺療法作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)療法，已經(jīng)存在了數(shù)千年，且在骨骼肌損傷的治療中取得了顯著的效果[12]。有證據(jù)顯示，在機體特定穴位進行針刺，刺激信號將通過組織間機械力的傳導(dǎo)傳遞給周邊組織，引發(fā)級聯(lián)效應(yīng)，最后致使細(xì)胞發(fā)生一系列功能性反應(yīng)[13]。本研究為探索針刺對超負(fù)荷運動致骨骼肌損傷的作用及相關(guān)機制，通過將大鼠進行超負(fù)荷訓(xùn)練制造骨骼肌損傷大鼠模型，然后針刺大鼠足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴3 個穴位，檢測大鼠血清CK和LDH水平，觀察骨骼肌病理形態(tài)學(xué)改變，檢測與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)物質(zhì)的含量、骨骼肌細(xì)胞凋亡情況以及相關(guān)通路蛋白的表達水平。中醫(yī)認(rèn)為，針刺腎俞穴和足三里具有補腎益精、增加體能的功效[14]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，針刺腎俞穴可以有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而實現(xiàn)機體的正常生理反應(yīng)和免疫反應(yīng)；針刺陽陵泉穴和內(nèi)關(guān)穴可以有效刺激機體的免疫系統(tǒng)，提升對炎癥的抵御力[15]。以上證據(jù)說明了刺激這3個穴位的合理性和科學(xué)性。

CK 和LDH 作為骨骼肌損傷的生物標(biāo)志物，可以反映骨骼肌微細(xì)損傷的程度[16]。當(dāng)超負(fù)荷運動致使骨骼肌細(xì)胞膜遭到破壞，此時CK 和LDH 就會從細(xì)胞內(nèi)滲漏到血液中，導(dǎo)致血清中CK 和LDH 水平明顯升高。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠超負(fù)荷運動后血清中CK 和LDH 水平明顯升高，而經(jīng)針刺干預(yù)后，CK 和LDH水平明顯降低。此外，在HE染色實驗中，發(fā)現(xiàn)針刺后大鼠骨骼肌損傷程度明顯減輕。說明針刺可以有效減輕大鼠骨骼肌的損傷程度。

在進行超負(fù)荷運動后，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞損傷的重要因素之一[17]。超負(fù)荷運動后，體內(nèi)活性氧會增多，會使細(xì)胞膜得通透性變強，進而氧化應(yīng)激相關(guān)酶就會從細(xì)胞里被釋放到細(xì)胞外[18]。MDA可以反映脂質(zhì)過氧化程度。SOD可以反映自由基清除能力，有效清除活性氧。SDH是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，為有氧呼吸提供電子，SDH活性越強，組織的氧利用能力就越強。GSH-Px可以清除由活性氧和脂質(zhì)過氧化物，保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。本實驗結(jié)果顯示，針刺后MDA 水平顯著降低，而SOD、SDH和GSH-Px水平均顯著升高。說明針刺可以有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，其原因可能是針刺關(guān)鍵穴位后使得大鼠SOD活性增強，增強清除自由基的能力，減輕脂質(zhì)過氧化，最終有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，與Seo 等[19]報道的針刺可以有效減輕大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)論相一致。

細(xì)胞凋亡在骨骼肌損傷中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超負(fù)荷組骨骼肌細(xì)胞凋亡率較健康對照組明顯升高，而經(jīng)針刺干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率明顯下降，說明針刺可以有效降低大鼠骨骼肌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族也參與控制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，該家族調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要蛋白包括Bcl-2 和Bax。當(dāng)觀察到Bax 蛋白表達升高，而Bcl-2 蛋白表達降低時，則預(yù)示細(xì)胞也啟動了凋亡程序。本研究結(jié)果顯示，與超負(fù)荷組比較，超負(fù)荷+針刺組大鼠骨骼肌Bcl-2 蛋白水平無顯著差異，Bax 蛋白水平明顯下調(diào)。這可能是因為研究所納入樣本量太少差異比較不具備統(tǒng)計學(xué)意義，后續(xù)可加大樣本量進行研究，但Bcl-2 蛋白表達顯著降低仍可表明細(xì)胞已啟動凋亡程序。這一結(jié)果與趙曉琴等[21]報道的針刺可以緩解大鼠離心運動后骨骼肌細(xì)胞凋亡的結(jié)論相類似。而PI3K/AKT信號通路在調(diào)控細(xì)胞的凋亡中起著關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果顯示，大鼠超負(fù)荷運動后PI3K 和AKT 蛋白水平顯著下降，而經(jīng)針刺干預(yù)后，PI3K和AKT蛋白水平明顯回升，提示針刺大鼠足三里、腎俞穴等關(guān)鍵穴位后，PI3K/AKT信號通路被激活，從而抑制了骨骼肌細(xì)胞的凋亡。這一結(jié)果與既往研究報道的針刺大鼠足三里等穴位會激活A(yù)KT信號通路，抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡[22]的結(jié)論相類似。

綜上所述，針刺可以緩解大鼠骨骼肌的損傷程度，其機制可能是針刺關(guān)鍵穴位后，PI3K/AKT信號通路被激活，從而抑制了骨骼肌細(xì)胞的凋亡，同時減輕了大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。