喬建新，劉 明，劉熙鵬，段升強(qiáng)

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，張家口 075000）

由星形膠質(zhì)細(xì)胞所組成的腦星形細(xì)胞瘤是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤類型，在全球范圍內(nèi)具有極高的死亡率[1]。目前，關(guān)于星形細(xì)胞瘤的主要治療方法是進(jìn)行手術(shù)，其次是放療法和化療，但其預(yù)后仍不容樂觀。因此，有必要找到其新的治療方法以改善療效[2]。

miRNA 是小的非編碼單鏈RNA 分子，可通過與靶基因3'UTR 結(jié)合來調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)，其失調(diào)可通過充當(dāng)癌基因或抑癌基因參與癌癥的發(fā)生，目前有許多研究報(bào)道稱，miRNA 參與星形細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)理[3]。miR-154作為miRNA的一種已被表明在腦星形細(xì)胞瘤患者血清和組織中表達(dá)顯著下調(diào)，且與患者預(yù)后不良相關(guān)[4]。N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶7（N-acetylgalactosaminyltransferase 7，GALNT7）作為N-乙酰-D-半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶家族的成員之一，已被報(bào)道可通過多種信號通路影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力[5]。miR-154 可通過抑制GALNT7 表達(dá)抑制喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[6]。在腦星形細(xì)胞瘤中miR-154是否發(fā)揮同樣作用尚未可知。為此，本研究通過探討miR-154 對人腦星形細(xì)胞瘤（U251）細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響，以期為人腦星形細(xì)胞瘤新的靶向治療機(jī)制研究提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

胎牛血清、人腦星形細(xì)胞瘤U87、U251 細(xì)胞、pmirGLO 質(zhì)粒、DMEM 培養(yǎng)基（貨號：164210-500、YCL-0238、YCL-0237、E1330、PM150210）購自武漢益普生物科技有限公司；人腦星形細(xì)胞瘤SHG44細(xì)胞（貨號：CL-0207）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；HEB 人腦膠質(zhì)細(xì)胞（貨號：YS2890C）購自上海雅吉生物科技有限公司；Lipofectamine?2000 Transfection Reagent（貨號：11668027）購自賽默飛世爾科技；Matrigel膠（貨號：356234）購自上海善然生物科技有限公司；即用型熒光定量PCR 試劑盒（貨號：XY-TE-0731）購自上海烜雅生物科技有限公司；總RNA 提取試劑盒（貨號：AR1200-100T）購自上海吉至生化科技有限公司；QIAGEN 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：QIAGEN）購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；青霉素—鏈霉素（貨號：LM1200K）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；胰酶溶液（貨號：PYG0065）購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人β-actin、GALNT7、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2 抗體（貨號：ab8227、ab97645、ab32072、ab16663、ab76003、ab37150）購自abcam；MTT 檢測試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體（貨號：BTN111105、K12862、WE0381-QAN）購自北京百奧萊博科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號：CD-13559-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（貨號：11402ES60）購自上海翊圣生物科技有限公司；無關(guān)序列miR-NC、miR-154 mimics由賽默飛世爾科技合成。QuantStudio 3&5實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）系統(tǒng)、iBright 蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)購自賽默飛世爾科技；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞與培養(yǎng)

人腦星形細(xì)胞瘤U87、U251、SHG44 細(xì)胞及HEB人腦膠質(zhì)細(xì)胞接種到DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中后均置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基兩天更換1 次，直至細(xì)胞融合至80%左右后用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR檢測各細(xì)胞株中miR-154的表達(dá)

用RNA 提取試劑盒提取U87、U251、SHG44 及HEB 細(xì)胞中總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后通過RTqPCR檢測細(xì)胞株中miR-154表達(dá)水平。U6為內(nèi)參并對mRNA 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，2-ΔΔCt分析miR-154 表達(dá)水平（n=5）。引物由Oligo 7 和Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 RT-qPCR引物

1.2.3 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染

設(shè)置對照組，將對數(shù)生長期U251 細(xì)胞（1 mL）以2×105個/mL接種于6孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，按Lipofectamine?2000 說明書以終濃度為5 nmol/L分別將miR-NC、miR-154 mimics轉(zhuǎn)入相應(yīng)組U251細(xì)胞中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

設(shè)置對照組、miR-NC組、miR-154 mimics組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后以1×105個/孔的密度，重復(fù)5孔，每孔100 μL，在96孔板中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。添加MTT 10 μL/孔（5 g/L），4 h后棄上清培養(yǎng)液加入DMSO 100 μL，震蕩至MTT 反應(yīng)結(jié)晶充分溶解后，在570 nm 處測定吸光度OD值，計(jì)算U251細(xì)胞存活率（%）=（OD處理組/OD對照組）×100%。

1.2.5 平板克隆法檢測U251細(xì)胞增殖情況

各組U251細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）終止消化后制備懸浮液并轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直至克隆細(xì)胞肉眼可見，棄上清后15 min 多聚甲醛固定，20 min 結(jié)晶紫溶液（1%）染色，流水沖洗晾干后計(jì)數(shù)（n=5），克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.6 Transwell法檢測U251細(xì)胞侵襲和遷移能力

侵襲實(shí)驗(yàn)：用無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋4 ℃過夜融化的Matrigel（50 mg/L）膠后，包被Transwell小室上室，37 ℃過夜孵育1 h后將各組U251細(xì)胞調(diào)整濃度為2.5×105個/mL，取200 μL接種于小室上室，并在下室加入DMEM培養(yǎng)基500 μL培養(yǎng)24 h后PBS清洗，棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞，進(jìn)行30 min甲醇固定、30 min 結(jié)晶紫溶液（0.1%）染色，隨機(jī)選取5 個視野內(nèi)觀察穿膜細(xì)胞并計(jì)數(shù)。遷移：使用未被Matrigel 膠所包被的上室，除此之外與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-154 與GALNT7的靶向關(guān)系

通過TargetScan(http://www.Targetscan.org/)確定miR-154與GALNT7結(jié)合位點(diǎn)后驗(yàn)證二者靶向關(guān)系。將與miR-154 靶向序列相結(jié)合的GALNT7 的3'-UTR 片段經(jīng)擴(kuò)增、酶切和連接后，構(gòu)建野生型和突 變 型GALNT7 載 體：pmirGLO-GALNT7-wt 和pmirGLO-GALNT7-mut。將接種于96 孔板的對數(shù)生長期U251細(xì)胞分為pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics 組、pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 組以及pmirGLO-GALNT7-mut+miR-154 mimics 組、pmirGLO-GALNT7-mut+miR-NC 組。按Lipofectamine?2000 說明書分別對各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h 后，使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性：分別添加報(bào)告基因細(xì)胞裂解液（200 μL）和熒光素酶反應(yīng)液（50 μL）檢測熒光強(qiáng)度A 后再加入反應(yīng)終止液對熒光強(qiáng)度B 檢測進(jìn)行，熒光素酶相對活性：A/B。

1.2.8 Western blotting 檢測U251 細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況

使用RIPA 裂解液對U251 細(xì)胞進(jìn)行裂解后，用BCA 蛋白試劑盒測定各組細(xì)胞總蛋白含量；SDSPAGE 電泳分離蛋白、低溫轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，脫脂奶粉進(jìn)行為時1 h的封閉，加入兔抗β-actin、GALNT7、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2（1∶1 000）一抗孵育（4 ℃）過夜后再用二抗（1∶5 000）孵育2 h，蛋白凝膠成像儀定量分析各蛋白含量（n=5）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組件比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-154在人腦星形細(xì)胞瘤U87、U251、SHG44細(xì)胞及HEB人腦膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況

與HEB人腦膠質(zhì)細(xì)胞（0.99±0.12）相比，人腦星形細(xì)胞瘤U251、U87、SHG44 細(xì)胞中miR-154 表達(dá)水平均顯著降低（0.35±0.09、0.56±0.11、0.61±0.10），并且在U251 細(xì)胞中其表達(dá)量最低（F=31.880，P＜0.001）（圖1），因此選擇U251細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-154在各細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.2 miR-154轉(zhuǎn)染效率檢測

與對照組比較，miR-NC 組U251 細(xì)胞中miR-154 表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05），miR-154 mimics 組其表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）（表2）。通過熒光顯微鏡觀察U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，見圖2。

表2 各組U251細(xì)胞中miR-154的表達(dá)水平比較n=5，

表2 各組U251細(xì)胞中miR-154的表達(dá)水平比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖2 熒光顯微鏡觀察結(jié)果（×200）

2.3 MTT法檢測miR-154對U251細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，miR-NC 組U251 細(xì)胞存活率無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組U251細(xì)胞存活率比較n=5，

表3 各組U251細(xì)胞存活率比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

2.4 平板克隆法檢測miR-154 對U251 細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，miR-NC 組U251 細(xì)胞克隆數(shù)無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低（P＜0.05），見表4，圖3。

表4 各組U251細(xì)胞克隆數(shù)比較n=5，

表4 各組U251細(xì)胞克隆數(shù)比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖3 miR-154對U251細(xì)胞增殖的影響

2.5 miR-154對U251細(xì)胞侵襲遷移的影響

與對照組比較，miR-NC 組U251 細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)顯著減少（P＜0.05），見表5，圖4。

表5 各組U251細(xì)胞侵襲、遷移情況比較n=5，

表5 各組U251細(xì)胞侵襲、遷移情況比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

2.6 miR-154對U251細(xì)胞內(nèi)增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的影響

與對照組比較，miR-NC組U251細(xì)胞內(nèi)c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），而在miR-154 mimics組其表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表6，圖4。

表6 各組U251細(xì)胞內(nèi)增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的比較n=5，

表6 各組U251細(xì)胞內(nèi)增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖4 miR-154對U251細(xì)胞侵襲遷移的影響

2.7 U251 細(xì)胞中miR-154 與GALNT7 間的靶向關(guān)系

Http://microRNA.org 預(yù)測結(jié)果顯示出miR-154與GALNT7 間具有結(jié)合位點(diǎn)，GALNT7 是miR-154的潛在靶基因（圖6）。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示：與pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 組相比，pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics 組熒光素酶活性顯著降低（t=5.890，P＜0.01）；其余組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.234，P＞0.05）（圖7）。與對照組比較，NC 組GALNT7 表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），miR-154 mimics組GALNT7表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表7、圖8。

表7 各組GALNT7蛋白表達(dá)水平比較n=5，

表7 各組GALNT7蛋白表達(dá)水平比較n=5，

與對照組比較，*P＜0.05。

圖5 miR-154對各組U251細(xì)胞內(nèi)c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表達(dá)水平的影響

圖6 miR-154與GALNT7結(jié)合位點(diǎn)

圖7 熒光素酶活性檢測結(jié)果

圖8 miR-154對GALNT7蛋白表達(dá)的影響

3 討論

星形細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的一種具有高侵襲性的高度惡性腦腫瘤，其源自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，占原發(fā)性腦腫瘤的60%以上，并且其早期體征和癥狀為非特異性[7-9]。目前針對星形細(xì)胞瘤治療的療效十分有限，而且由于當(dāng)前治療的非特異性靶向性質(zhì)，患者普遍復(fù)發(fā)率很高，因此，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和醫(yī)學(xué)手段的提高，靶向治療越來越得到醫(yī)學(xué)工作者的重視[10]。

miRNA作為非編碼RNA已被證明參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，并且越來越多的研究表明，miRNA 在癌癥發(fā)生過程中的重要性及其作為癌癥良好治療靶標(biāo)的 適 用 性[10]。miR-101[11]、miR-128[12]、miR-224-3p[13]、miR-154[4]等多種miRNA被發(fā)現(xiàn)參與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。在星形細(xì)胞瘤患者組織和血清中miR-154 表達(dá)顯著降低，并且高表達(dá)患者預(yù)后較為良好，其低表達(dá)可能與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且對該疾病具有一定診斷和預(yù)后評估的價值[4]。miR-154已被發(fā)現(xiàn)參與乳腺癌[14]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[15]等多種類型癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，并且在其中表達(dá)異常降低。研究發(fā)現(xiàn)，miR-154-5p通過靶向抑制PIWI 樣蛋白1（Piwi-like protein 1，PIWIL1）表達(dá)來抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。miR-154通過靶向抑制Wnt5a表達(dá)而具有作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抑制因子的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-154 在星形細(xì)胞瘤U251細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著降低，miR-154過表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞存活率、細(xì)胞克隆數(shù)、侵襲和遷移數(shù)、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表達(dá)水平，結(jié)果表明，miR-154過表達(dá)可顯著抑制U251細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

GALNT7 作為GALNT 家族成員之一，可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境的相互作用，其在宮頸癌[16]、結(jié)直腸癌[17]等多種類型的惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，表明GALNT7參與腫瘤的發(fā)生，抑制其表達(dá)可使腫瘤消退[16]。LncRNA TP73-AS1 沉默可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其死亡，而外源性GALNT7 可逆轉(zhuǎn)TP73-AS1 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制的作用[18]。有幾項(xiàng)研究也表明，miR-125a-5p[15]、miRNA-30e[19]等多種miRNA 的可靶向調(diào)節(jié)GALNT7 的表達(dá)，在宮頸癌中miR-125a-5p 通過抑制EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（EGFR/ PI3K/AKT）途徑激活來使GALNT7表達(dá)下調(diào)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[16]。在LSCC中，miR-154可通過抑制GALNT7表達(dá)抑制LSCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[6]。本研究靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，GALNT7 是miR-154 的潛在靶基因，與pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 組相比，pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics組熒光素酶活性顯著降低，并且miR-154 mimics組GALNT7表達(dá)水平顯著降低。結(jié)果表明，miR-154 過表達(dá)對U251 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制可能與抑制GALNT7表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-154 過表達(dá)通過靶向抑制GALNT7 表達(dá)來抑制U251 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究不僅對星形細(xì)胞瘤的新的靶向治療機(jī)制的研究具有重要價值，還為miR-154 在星形細(xì)胞瘤中的作用機(jī)制研究提供了參考，但在未來的研究中還需要對其下游通路進(jìn)行研究，使其機(jī)制研究更為完善。