沈文婷，陳 明，許 詣，秦建品

（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院兒科，襄陽 441021）

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房中發(fā)病率和死亡率較高的常見病狀，由感染引起全身炎癥反應(yīng)和組織器官功能障礙，進而危及患者生命[1]。據(jù)統(tǒng)計，由膿毒癥引起的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發(fā)生率高達50%，并與不良的臨床結(jié)果密切相關(guān)。AKI不僅延長了患者的住院時間，而且還與其死亡率增加有關(guān)[2]。此外，AKI患者在后期患上慢性腎臟病和終末期腎臟疾病的概率較大[3]。目前，膿毒癥引起AKI 的病理生理機制尚未完全明確，尋找膿毒癥誘發(fā)AKI的關(guān)鍵致病因子與相關(guān)機制，能夠為有效預(yù)防和診治該疾病提供新思路。

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrroiidine dithiocarbamate，PDTC）是一種穩(wěn)定的衍生自二硫代氨基甲酸酯的硫醇化合物，可作為抗氧化劑和自由基清除劑發(fā)揮多種生物效應(yīng)。此外，PDTC 還參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[4]。已有研究表明，PDTC對大鼠糖尿病腎臟損傷與大鼠急性腎損傷均具有一定的保護作用[5-6]，而關(guān)于其在膿毒癥合并AKI中的作用及機制研究較少，本研究通過構(gòu)建膿毒癥AKI 大鼠模型，以探究PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠的作用情況，及其對線粒體功能與抗衰老蛋白Klotho 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g。飼養(yǎng)于室溫（23±2）℃、濕度40%～60%的小動物飼養(yǎng)箱內(nèi)，以12 h光照/黑暗交替循環(huán)，期間自由進食、飲水。試驗前將大鼠在動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與材料

PDTC購自美國Sigma公司，ELISA試劑盒和丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所，Masson染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，免疫熒光染色試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒和增強型ECL 化學(xué)發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒與SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購自日本Takara公司，抗體Klotho、細胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）、自噬標記輕鏈3（LC3）、腎皮質(zhì)勻漿細胞色素-C（Cyto-C）、抗增殖蛋白（Prohibitin）購自英國Abcam 公司，抗體β-actin、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 和生物素標記的山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理 60只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、PDTC 組，每組20 只。模型組和PDTC組大鼠通過盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）制備膿毒癥合并AKI 模型，造模前大鼠12 h 禁食，6 h 禁水，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，后固定，剔除腹部體毛，消毒后沿腹部正中間白線切開皮膚2 cm左右切口，暴露腹腔臟器，分離盲腸，在距盲端1 cm 處進行結(jié)扎，結(jié)扎后逐層縫合切口，并立即在大鼠股部皮下注射生理鹽水。造模成功標準：在CLP 模型構(gòu)建后6 h 內(nèi)未出現(xiàn)死亡，并出現(xiàn)包括腹瀉、豎毛、萎靡、活動力減弱等膿毒癥的標準癥狀。對照組大鼠除了不進行盲腸結(jié)扎穿孔和不留置導(dǎo)管外，其他操作均與上述過程相同。PDTC 組大鼠在造模后1 h，以50 mg/kg 劑量通過腹腔注射PDTC 試劑液，模型組及對照組注射同等劑量生理鹽水，每日1次，持續(xù)1周[5]。

1.3.2 ELISA法檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）和24 h尿蛋白（24 h UP）水平 治療1周后，將大鼠麻醉后眼球取血，室溫靜置2 h，置于4 ℃低溫離心機以3 000 r/min離心15 min，取上清液，應(yīng)用Beckman CX-7 全自動生化分析儀測定血清SCr、BUN 和24 h UP 的水平，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 腎組織氧化應(yīng)激指標檢測 采血結(jié)束后處死大鼠，解剖取其右側(cè)腎組織，無菌環(huán)境下剪碎、研磨勻漿，加入緩沖液置于冰上裂解2 h，4 ℃低溫離心機以12 000 r/min 離心10 min，提取收集上清液備用，硫代巴比妥酸法檢測腎組織MDA 水平，微板法檢測腎組織SOD水平，光譜光度測量工具檢測腎組織T-AOC 水平，具體操作過程參照試劑盒說明書進行。

1.3.4 HE 染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 解剖取大鼠左側(cè)腎組織，置入4%多聚甲醛浸泡固定，固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片機切成5 μm 的組織薄片，切片常規(guī)脫蠟至水，加入蘇木精染色5 min，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，晾干，中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理形態(tài)變化并拍照。

1.3.5 Masson 染色觀察腎組織膠原沉積 取制備好的腎組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，加入weigert鐵蘇木精液染色10 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，流水沖洗干凈，依次加入Masson染液染色3 min，麗春紅酸性品紅液染色5 min，l%磷鉬酸水溶液分化3 min，苯胺藍染液染色5 min，1%冰醋酸水溶液浸泡并洗滌切片，脫水與透明后，中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察腎組織膠原沉積情況并拍照。

1.3.6 TUNEL 染色檢測腎組織細胞凋亡 腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加入20 μg/mL蛋白酶K室溫孵育15 min，PBS 沖洗干凈，滴加50 μL TUNEL試劑液，37 ℃孵育1 h，加入過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑，37 ℃孵育30 min，DAB試劑液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。通過光學(xué)顯微鏡觀察，凋亡細胞核呈棕褐色，隨機選擇6個視野統(tǒng)計TUNEL陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)，計算TUNEL陽性細胞率。

1.3.7 免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織Klotho 蛋白表達 腎組織石蠟切片脫蠟水化，置于檸檬酸鹽緩沖液（溫度95 ℃）煮沸15 min，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，5%山羊血清室溫封閉2 h，將切片分別與兔抗Klotho（1∶500）在4 ℃冰箱孵育過夜。次日，PBS 沖洗切片，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織染色情況，胞質(zhì)染成黃色至棕色即為陽性，隨機選擇6 個視野，Image-Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計陽性表達面積。

1.3.8 實時熒光定量PCR 法（RT-qPCR）檢測腎組織Klotho mRNA 表達 TRIzol 法提取右側(cè)腎組織總RNA，Nanodrop 測定RNA 純度、濃度，按照cDNA 合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明進行qPCR 檢測基因mRNA 表達，以GAPDH 作為內(nèi)參基因。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min（1個循環(huán)）；95 ℃變性30 s（1個循環(huán)），55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s（42 個循環(huán)）。引物序列如下：Klotho 上游引物:5'-GGGTCACTGGGTCAATCT-3'，下游:5'-GCAAAGTAGCCACAAAGG-3'；GAPDH 上游引物:5'-ACAGCAACAGGTGGTGGAC-3'，下 游:5'-GCCGATCCACACGGAGTAC-3'。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA相對表達水平。

1.3.9 免疫熒光染色檢測腎組織LC3 與COX Ⅳ表達 將左側(cè)腎組織在OCT 化合物中冷凍并切成8 μm 的縱切片。將切片解凍，4%甲醛溶液固定20 min，0.2 %Triton X-100 透化處理切片20 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗LC3（1∶200）與COX Ⅳ（1∶50）抗體在4 ℃冰箱共同孵育過夜。次日，PBS 沖洗切片，加入TRITC 標記的山羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育2 h，PBS 沖洗，中性樹膠封片，使用熒光顯微鏡觀察熒光表達并拍照。

1.3.10 Western blotting 法檢測腎組織Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達 將右側(cè)腎組織皮質(zhì)剪碎勻漿，加入RIPA 裂解緩沖液裂解提取總蛋白，BCA 法測定濃度。以50 μg 蛋白加樣，10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉中封閉2 h，滴加兔抗Cyto-C（1∶1 000）、Prohibitin（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜，以β-actin 作為腎皮質(zhì)胞漿內(nèi)參蛋白，COX Ⅳ作為腎皮質(zhì)線粒體內(nèi)參蛋白。次日，TBST清洗3次，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST清洗3次，增強型ECL 液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，Image-Pro Plus 6.0軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠生化指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中SCr、BUN的含量和24 h UP 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，PDTC 組大鼠血清中SCr、BUN 含量和24 h UP水平顯著下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠SCr、BUN和24 h UP比較

表1 各組大鼠SCr、BUN和24 h UP比較

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

與對照組相比，模型組大鼠腎組織內(nèi)SOD、TAOC 含量顯著減少，MDA 含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，PDTC組大鼠腎組織內(nèi)SOD、T-AOC 含量均顯著增加，而MDA 含量則顯著減少（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織SOD、MDA和T-AOC水平比較

2.3 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響

HE 染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎組織未見變化，腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見上皮細胞脫落，細胞外基質(zhì)正常分布；與對照組相比，模型組大鼠腎組織內(nèi)腎小管萎縮、壞死，上皮細胞脫落，并有空泡性病變，伴隨大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，PDTC組大鼠腎小管壞死與萎縮現(xiàn)象明顯減輕，管腔內(nèi)脫落細胞減少，炎性細胞浸潤減輕，見圖2。Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎組織內(nèi)藍染膠原纖維較少；與對照組相比，模型組大鼠腎組織中藍染膠原纖維面積明顯增多，纖維束增粗，排列紊亂，呈現(xiàn)明顯纖維化；與模型組相比，PDTC組大鼠腎組織中藍染膠原纖維面積明顯減少，纖維化程度有所減輕，見圖3。

圖2 HE染色檢測大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)（×400）

圖3 Masson染色檢測大鼠腎組織膠原沉積（×400）

2.4 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織細胞凋亡的影響

TUNEL 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織內(nèi)TUNEL 陽性細胞凋亡率為（26.56±2.03）%，較對照組（6.85±0.49）%顯著升高（P＜0.05）；PDTC 組TUNEL 陽性細胞凋亡率（18.31±1.52）%顯著低于模型組（P＜0.05），見圖4。

圖4 TUNEL染色檢測大鼠腎組織細胞凋亡（×400）

2.5 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織Klotho蛋白與mRNA表達水平的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎組織內(nèi)有明顯的棕褐色染色，Klotho 陽性面積率為（37.13±3.28）%；模型組腎組織染色較淺較少，Klotho 陽性面積率為（8.92±0.73）%，較對照組顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，PDTC 組腎組織染色加深，Klotho 陽性面積率為（24.77±2.06）%，顯著高于對照組（P＜0.05），見圖5。模型組腎組織Klotho mRNA相對表達量為（0.73±0.03），較對照組（1.00±0.05）明顯下調(diào)（P＜0.05）；而相較于模型組，PDTC 組腎組織Klotho mRNA 相對表達量（0.72±0.06）明顯上調(diào)（P＜0.05）。

圖5 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腎組織Klotho蛋白表達（×400）

2.6 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織線粒體水平的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，相較于對照組，模型組大鼠的腎組織中綠色熒光增強，LC3 水平升高，COX Ⅳ和LC3 共定位也隨之增加；而與模型組比較，PDTC組大鼠腎組織內(nèi)綠色熒光減弱，LC3水平明顯降低，COX Ⅳ和LC3共定位也發(fā)生減少，見圖6。

圖6 免疫熒光染色檢測大鼠腎組織中LC3和COX Ⅳ表達（×400）

2.7 PDTC 對膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織線粒體Cyto-C、Prohibitin蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)胞漿Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），腎皮質(zhì)線粒體Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，PDTC組大鼠腎皮質(zhì)胞漿Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達則顯著降低（P＜0.05），同時，腎皮質(zhì)線粒體Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖7。

圖7 Western blotting檢測大鼠腎組織Cyto-C、Prohibitin蛋白表達

3 討論

膿毒癥又稱敗血癥，是由微生物或其他病原體入侵引起的強烈的全身性炎癥反應(yīng)，通過不可控的炎癥反應(yīng)對機體的多個器官造成急性功能損害，并最終發(fā)展為多器官功能障礙綜合征[1]。腎臟是常受炎癥反應(yīng)攻擊的靶器官之一，AKI 是膿毒癥的主要并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致腎小管嚴重損傷，造成腎功能障礙，并對患者生命造成了極大的威脅[7]。然而，膿毒癥發(fā)展的潛在機制仍不清楚。在本研究中，應(yīng)用構(gòu)建膿毒癥合并AKI 大鼠模型，探討PDTC 作用下對該疾病的影響，及其與線粒體功能障礙的關(guān)聯(lián)和調(diào)控的分子靶點。

PDTC 的抗氧化作用與抑制核因子-κB（NFκB）活性密切相關(guān)，在多個促炎性細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄中起著至關(guān)重要的作用。體外和體內(nèi)研究均顯示，PDTC 參與減弱炎癥反應(yīng)。例如，PDTC 通過阻斷IL-6、IL-8 和GM-SCF 分泌并抑制NF-κB 活化來響應(yīng)人內(nèi)皮細胞的炎癥介質(zhì)[8]。在人肝上皮細胞中，PDTC 抑制細胞因子模擬可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達和一氧化氮（NO）合成，破壞肝細胞中STAT 激活來抑制IL-6 信號傳導(dǎo)[9]。另外，PDTC可通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達在大鼠肝損傷模型中發(fā)揮保護作用[10]。在本研究中，使用PDTC 治療膿毒癥合并AKI 大鼠后，通過檢測發(fā)現(xiàn)相較于未經(jīng)治療的模型組大鼠，治療后的大鼠血清中SCr、BUN 含量和24 UP 水平明顯下降（P＜0.05）。此外，還觀察到大鼠腎小管壞死與萎縮現(xiàn)象得以改善，炎性細胞浸潤減輕，纖維化程度減小。以上指標檢測結(jié)果均說明，PDTC 可在大鼠膿毒癥合并AKI 中起到保護作用。因此，鑒于PDTC 具有廣泛生物學(xué)和病理學(xué)作用，在調(diào)節(jié)炎癥信號通路中可將其作為針對多種炎癥疾病的有效治療方法來開展相關(guān)研究。

膿毒癥可引起線粒體損傷和免疫功能紊亂，并且在炎癥反應(yīng)中NO等危險因素均可誘發(fā)線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等現(xiàn)象[11]。線粒體作為機體的能量中心，參與真核生物的氧化代謝過程，是產(chǎn)生ROS 的主要場所。線粒體DNA 從受損細胞泄漏到循環(huán)系統(tǒng)中時，再加上細菌感染，可能導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征。當線粒體膜電位下降時，內(nèi)外膜間的蛋白質(zhì)釋放至胞漿介導(dǎo)細胞凋亡，此外，功能失調(diào)的線粒體可通過選擇性自噬進行降解，從而促進受損線粒體的周轉(zhuǎn)[12]。Cyto-C 和Prohibitin均主要表達于線粒體內(nèi)膜，Cyto-C可作為線粒體損傷的標志物，當線粒體發(fā)生損傷時，Cyto-C釋放至胞漿觸發(fā)細胞凋亡相關(guān)級聯(lián)反應(yīng)；Prohibitin可通過自身結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)與線粒體多肽鏈結(jié)合，防止降解的發(fā)生[13-14]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過PDTC治療膿毒癥合并AKI大鼠后，腎組織內(nèi)細胞凋亡明顯減少，LC3 表達也減少，同時，大鼠腎皮質(zhì)線粒體Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達明顯升高，而腎皮質(zhì)胞漿Cyto-C、Prohibitin 蛋白表達則明顯降低（P＜0.05）。由此說明，PDTC 可改善膿毒癥合并AKI 大鼠的線粒體損傷及功能障礙。

氧化應(yīng)激條件下線粒體的結(jié)構(gòu)和功能受損是生物能量和細胞氧利用受損的主要原因，是觸發(fā)線粒體功能障礙的關(guān)鍵。線粒體不足或過多會導(dǎo)致線粒體呼吸過程中出現(xiàn)ROS缺乏或積累，最終導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)失控和生物能量代謝性疾病[15]。Klotho蛋白由腎小管分泌，在腎臟中呈現(xiàn)高表達，能夠抑制發(fā)揮抗氧化作用，并且參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、離子轉(zhuǎn)運和器官纖維化等過程[16-17]。本研究表明，通過PDTC治療膿毒癥合并AKI大鼠后，抑制了大鼠腎組織內(nèi)SOD、T-AOC 含量的減少和MDA含量的增加，并促進了Klotho 蛋白表達（P＜0.05）。由此推測，PDTC 可抑制膿毒癥合并AKI 大鼠腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并激活Klotho的表達。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明，PDTC可改善大鼠膿毒癥合并AKI，其能夠抑制氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)線粒體功能，并激活Klotho 表達。然而，膿毒癥合并AKI 的機制錯綜復(fù)雜，PDTC 作用過程中是否涉及其他靶點與機制還有待進一步研究。