李森森，楊再波△，朱 彬，童國勇，張宏謐

（1.湖北恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院口腔診療中心，恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院口腔科，恩施 445000）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的惡性腫瘤，占所有頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）病例的40%，通常表現(xiàn)為侵略性行為，經(jīng)常導(dǎo)致局部浸潤和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。大多數(shù)OSCC 患者在診斷時處于晚期臨床階段，由于手術(shù)難以根治并且預(yù)后較差，OSCC 的5 年生存率＜50%[2]。約25%～50%的患者在治療后會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[3]。因此，尋找可靠的生物標志物和新的分子靶點對于開發(fā)和實施OSCC患者的精準個性化治療至關(guān)重要。

同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（homeodomain-interacting protein kinase 2，HIPK2）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，通過參與調(diào)控基因表達對細胞周期、凋亡及衰老具有調(diào)控作用[4]。相關(guān)研究表明，HIPK2可作為抑癌基因，抑制乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，或表達上調(diào)發(fā)揮促癌作用[5-7]。HIPK2 在OSCC 中表達升高，且以僅胞質(zhì)陽性表達為主，與OSCC 的密預(yù)后密切相關(guān)[8]。但HIPK2 對OSCC 的具體作用機制尚未見相關(guān)報道，因此，本文通過構(gòu)建HIPK2 短發(fā)夾RNA 沉默HIPK2 表達，探究其對OSCC 細胞SCC-25 生長、自噬及裸鼠移植瘤生長的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青—鏈霉素和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；人舌磷癌細胞SCC-25購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 購 自Thermo Fisher；一 抗HIPK2、c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ和Actin購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SCC-25 細胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素）培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，試驗選用對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞處理及分組

設(shè)計兩對shRNA序列（HIPK2-shRNA1、HIPK2-shRNA2）干擾HIPK2 表達，取對數(shù)生長期SCC-25細胞，將細胞隨機分為4組：Control組、shRNA-NC 組、HIPK2-shRNA1 組 和HIPK2-shRNA2組。Control 組不做處理，shRNA-NC 組轉(zhuǎn)染shRNA-NC 陰性對照載體，HIPK2-shRNA1 組轉(zhuǎn)染HIPK2-shRNA1 慢病毒載體，HIPK2-shRNA2 組轉(zhuǎn)染HIPK2-shRNA2慢病毒載體。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測HIPK2 mRNA水平

用Trizol法從SCC-25細胞中提取總RNA，采用PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，35 個循環(huán)。以Actin為內(nèi)參基因，用2-△△CT計算各目的基因相對表達量。引物序列：HIPK2-shRNA1 上游引物為5'-TGACCACTGTCCACAACCAGCCCTCAG-3'，下游引物為5'-TCGCACCGAGTAGCCAGCGTGC-3'；HIPK2-shRNA2 上游引物為5'-AGGAAGAGTAAGCAGCACCAG-3'，下游引物為5'-TGCTGATGGTGATGACACTGA-3'；Actin上游引物為5'-CGATGCCCTGAGGCTCTTT-3'，下游引物為5'-TAGTTTCATGGATGCCACAGGAT-3’。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖

將SCC-25 細胞接種至6 孔板，約500 個細胞每孔，按方法“1.3項”進行處理及分組，培養(yǎng)7 d后棄掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗凈干燥后于顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)目，計算克隆形成率。細胞克隆形成率（%）=細胞克隆總數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞SCC-25細胞接種于6孔板，按方法“1.3 項”分組處理，胰酶消化吸收后，PBS 洗滌2 次，加入500 μL 緩沖液懸浮細胞，再加入5 μL磷脂酰絲氨酸蛋白混勻，最后加入碘化丙啶10 μL室溫避光反應(yīng)20 min 通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

1.7 Western blotting 檢測HIPK2、c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表達

各組細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。4 ℃下加入HIPK2、c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ一抗（1∶1 000）孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入電化學(xué)發(fā)光顯色液顯色。以GAPDH 為內(nèi)參，ImageJ 軟件分析各組細胞目的蛋白與GAPDH比值。

1.8 裸鼠移植瘤模型的建立

20 只雄性Balb/c 裸鼠購自武漢大學(xué)動物實驗中心，5 周齡，體重（20±2）g，許可證號：SCXK（鄂）2019—0004，在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)。將裸鼠隨機分為兩組：Control 組和HIPK2-shRNA2 組，取方法“1.3 項”處理后的Control 組和HIPK2-shRNA2 組處于對數(shù)生長期的SCC-25 細胞，分別注射于裸鼠后背部靠近腋窩處皮下（1×107個/mL，0.2 mL/只）。達成瘤標準（瘤徑≥0.5 cm）進行后續(xù)實驗。處死所有裸鼠，稱取腫瘤重量，TUNEL 染色檢測細胞凋亡，免疫組化檢測Caspase-3 陽性表達率，western blotting檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達水平。

1.9 TUNEL染色

將裸鼠腫瘤組織切片用二甲苯浸洗2 次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1 次，每次3 min。參照TUNEL 凋亡試劑盒說明書，用蛋白酶K 工作液在37 ℃下封閉20 min，PBS 清洗2 次。在每個切片樣本上加入TUNEL 反應(yīng)液50 μL，37 ℃閉光反應(yīng)60 min。用DAPI 復(fù)染10 min后熒光顯微鏡下觀察。

1.10 免疫組化測定察Caspase-3蛋白的表達情況

取各組裸鼠腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋制成厚度約4 μm的切片，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，陽性表達為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用光學(xué)顯微鏡觀察Caspase-3在腫瘤組織中的表達情況。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HIPK2 mRNA和蛋白表達水平

與Control 組比較，HIPK2-shRNA1 組、HIPK2-shRNA2組HIPK2 mRNA水平和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 HIPK2 mRNA水平和蛋白表達水平

2.2 HIPK2 短發(fā)夾RNA 對SCC-25 細胞克隆形成率的影響

與Control 組比較，HIPK2-shRNA1 組、HIPK2-shRNA2 組細胞克隆形成率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 HIPK2短發(fā)夾RNA對SCC-25細胞克隆形成率的影響

2.3 HIPK2 短發(fā)夾RNA 對SCC-25 細胞凋亡率的影響

與Control組比較，HIPK2-shRNA1、HIPK2-shRNA2 組細胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 HIPK2短發(fā)夾RNA對SCC-25細胞凋亡率的影響

2.4 HIPK2 短發(fā)夾RNA 對SCC-25 細c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

與Control組比較，HIPK2-shRNA1、HIPK2-shRNA2 組c-Myc 蛋白表達明顯降低，cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2 比值顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 HIPK2短發(fā)夾RNA對SCC-25細c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

2.5 HIPK2短發(fā)夾RNA 對SCC-25細胞Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達的影響

與Control 組比較，HIPK2-shRNA1 組、HIPK2-shRNA2 組Bcelin1、ATG7 蛋白表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 HIPK2短發(fā)夾RNA對SCC-25細胞Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達的影響

2.6 HIPK2短發(fā)夾RNA 對口腔鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤模型的影響

與Control 組比較，HIPK2-shRNA2 組裸鼠腫瘤重量降低，Caspase-3陽性細胞數(shù)、細胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 HIPK2短發(fā)夾RNA對口腔鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤模型的影響

3 討論

OSCC發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種遺傳因素、生活方式和代謝風(fēng)險，但其具體分子機制尚不明確。因此，需要探索新的分子治療靶點，并通過更好地闡明分子機制和功能意義來發(fā)現(xiàn)OSCC有效的治療方式。

增殖能力的增強及凋亡的減弱是腫瘤細胞重要的生物學(xué)特征，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)基礎(chǔ)[9]。抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是治療OSCC 的有效手段。c-Myc 為原癌基因，可介導(dǎo)腫瘤細胞無限增殖，促進腫瘤細胞凋亡，相關(guān)研究表明，c-Myc高表達可促進OSCC的發(fā)生[10]。與細胞凋亡相關(guān)的基因Bax 升高能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，Bcl-2 是細胞凋亡的抑制劑，Bax/Bcl-2 比值能反應(yīng)細胞凋亡狀況[11]。細胞中的Caspase-3一般無活性，以procaspase-3 形式存在，其活化后剪切下游分子，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。Cheng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HIPK-2 表達降低可一起宮頸癌細胞凋亡增加，增殖減少。Puca 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2 可通過激活p53 抑癌基因細胞凋亡活性，從而促進乳腺癌細胞凋亡。本文研究表明，短發(fā)夾RNA沉默HIPK2表達可升高SCC-25 細胞凋亡率，可降低SCC-25 細胞克隆形成率，降低裸鼠移植瘤腫瘤重量，降低c-Myc蛋白表達水平，升高cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2比值，升高裸鼠移植瘤腫瘤細胞Caspase-3陽性細胞數(shù)和細胞凋亡率。提示HIPK2 短發(fā)夾RNA 可抑制SCC-25細胞增殖和裸鼠移植瘤腫瘤的生長，并誘導(dǎo)SCC-25細胞和裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡。

自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有促進和抑制的雙重作用[15]。Beclin1基因，位于染色體17q21上，可作為抑癌基因參與大部分惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，相關(guān)研究表明，Beclin1在口腔鱗癌組織中的陽性表達率顯著低于癌旁組織，與腫瘤分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]。ATG7是自噬調(diào)節(jié)的重要蛋白，可通過調(diào)節(jié)多種酶的活性從而激活細胞的自噬及凋亡過程[17]。自噬蛋白LC3 可分為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，LC3-Ⅱ定位在雙層膜和自噬體上，是自噬體的特異性標志分子，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)，其比值大小是判定自噬水平的高低的依據(jù)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2 短發(fā)夾RNA 具有升高SCC-25細胞Bcelin1、ATG7 蛋白表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，升高裸鼠移植瘤腫瘤細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。提示HIPK2短發(fā)夾RNA可誘導(dǎo)并激活SCC-25細胞和裸鼠移植瘤腫瘤細胞自噬，促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，HIPK2 短發(fā)夾RNA 可抑制SCC-25細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬，抑制裸鼠移植瘤模型移植瘤的生長。HIPK2有望成為治療OSCC的新靶點。