吳 博，王欣欣，劉麗莉，包小娜，蔡 宇△

（遼寧健康產(chǎn)業(yè)集團阜新礦總醫(yī)院 1.消化內(nèi)科；2窺鏡中心，阜新 123000）

膽囊癌在膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高，在全球消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤中排名第六，腫瘤流行病學(xué)調(diào)查顯示，2018年新發(fā)和死亡膽囊癌患者超過15萬[1]。由于膽囊癌早期診斷較難以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等重要因素的存在，膽囊癌患者的預(yù)后極差[2]。雖然醫(yī)療在不斷的進(jìn)步，但是現(xiàn)有的治療策略仍不能改善膽囊癌的臨床療效，因此揭示其發(fā)病分子機制可能有助于鑒定治療膽囊癌新的治療靶標(biāo)。SASH1(scaffold protein sterile α motif-and Src-homology 3-domain containing 1,SAM and SH3 domain-containing 1)基因在正常人體組織中廣泛表達(dá)，該基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和凋亡，并參與多種疾病的發(fā)展[3]。SASH1 被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等常見惡性腫瘤中低表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)過程促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[4-6]。SASH1 在多種腫瘤中被研究，并可以作為抗腫瘤治療的靶點[7]，但是SASH1 在膽囊癌中的研究至今未有報道。因此，本研究對SASH1在膽囊癌中的表達(dá)及在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能和作用機制進(jìn)行了探討，旨在獲得SASH1作為膽囊癌抗腫瘤治療潛在分子靶點的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

高效蛋白裂解液和吉姆薩染液，購自北京solarbio公司；蛋白上樣緩沖液和BCA檢測試劑盒，購自上海碧云天試劑有限公司；PVDF膜，購自美國Millipore 公司；SASH1 一抗和鼠二抗、兔二抗，購自美國proteintech公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自美國Thermo公司；膽囊癌細(xì)胞GBC-SD、MKN-45、GES-1和人正常胃粘膜上皮細(xì)胞系RGM-1，購自美國ATCC 細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS 和胰酶，購自美國Hyclone公司；SASH1 siRNA，購自廣州銳博生物生物技術(shù)有限公司；MTS 試劑，購自美國Biovision 公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；Transwell 小室，購自美國coring 公司；4周齡左右的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 樣本來源

收集2018 年1 月至2020 年1 月入住遼寧健康產(chǎn)業(yè)集團阜新礦總醫(yī)院行手術(shù)治療的膽囊癌患者31例，要求患者在本次手術(shù)前未接受過放化療等任何形式的抗腫瘤治療。膽囊癌及大于腫瘤組織5 cm以上的癌旁組織，均由經(jīng)病理專家證實。手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本，放置-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩；颊呔炇鹬橥鈺?，所有操作均由本院倫理委員會審核通過。

1.3 Western blotting檢測SASH1蛋白表達(dá)

組織加入高效蛋白裂解液，超聲裂解細(xì)胞。12 000 r/min、4 ℃離心30 min，去除沉淀，獲得細(xì)胞總蛋白。BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，蛋白加熱煮沸進(jìn)行變性。采用10%的SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將PVDF 膜與蛋白封閉液常溫孵育1 h 后分別與目的一抗稀釋液（稀釋濃度比均為1∶500）4 ℃孵育過夜、二抗稀釋液（1∶8 000）室溫孵育1 h后，采用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

膽囊癌細(xì)胞GBC-SD、SGC996、NOZ 和正常膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC 從液氮快速復(fù)蘇后，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，放置在37 ℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞長滿時，收集各個細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，獲得細(xì)胞蛋白裂解液，采用western blotting 檢測各個細(xì)胞中SASH1 蛋白的表達(dá)。并選擇SASH1 表達(dá)最高的膽囊癌細(xì)胞進(jìn)行6 孔板接種，每孔2×105個細(xì)胞，分為NC 組和Overexpression SASH1 組(oe-SASH1 組)。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄掉培養(yǎng)基后，更換無血清培養(yǎng)基，NC組細(xì)胞加入NC 質(zhì)粒、siRNA 和lip2000，oe-SASH1 組細(xì)胞加入SASH1 過表達(dá)質(zhì)粒和lip2000。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞蛋白，采用western blotting 檢測各組細(xì)胞中SASH1的表達(dá)，并進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 MTS實驗

收集NC 組和oe-SASH1 組細(xì)胞進(jìn)行96 孔板接種，每孔2×103個細(xì)胞，以細(xì)胞貼壁的時間計為0點，每組設(shè)置0 h、24 h、48 h、72 h和96 h時間點，及每個時間點設(shè)置6 個復(fù)孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在相對應(yīng)的時間點，每孔中加入20 μL MTS試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測490nm 處各孔的吸光度值（OD值）。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗

NC組和oe-SASH1組細(xì)胞PBS洗兩次后，采用無EDTA 的胰酶消化收集，PBS 洗兩次，每管6×105個細(xì)胞，每組設(shè)置3個管，每管加入500 μL的凋亡染色緩沖液重懸細(xì)胞及5 μL 的Annexin V-FITC 和PI染色液，在常溫下避光孵育10 min 后，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 Transwell實驗

收集NC組和oe-SASH1組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗兩次后進(jìn)行Transwell 小室孔接種，每孔1×105個細(xì)胞、100 μL 無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞接種至Transwell小室膜的上室面，其下室面放于含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將Transwell 小室取出，其膜的上室面細(xì)胞擦除后，下室面的細(xì)胞經(jīng)PBS 清洗、甲醇固定和吉姆薩染色后，在顯微鏡下觀察膜下室面的細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞數(shù)越多，表明細(xì)胞穿膜數(shù)越多，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力越強。

1.8 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗

收集NC組和oe-SASH1組細(xì)胞，PBS洗兩次后進(jìn)行裸鼠接種，每只裸鼠4×106個細(xì)胞、100 μL PBS，細(xì)胞懸液接種至裸鼠的右側(cè)腋窩下。采用游標(biāo)卡尺每周對裸鼠成瘤的體積進(jìn)行測量，接種4 周時處死裸鼠，解剖移植瘤，并對瘤體進(jìn)行稱重。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用DUNNETt檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SASH1在膽囊癌組織中的表達(dá)水平

SASH1 在膽囊癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為（1.04±0.33）和（1.38±0.59），SASH1在膽囊癌組織中的表達(dá)顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)（t=2.773,P=0.007）。

2.2 SASH1蛋白在膽囊癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

與正常膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC相比，SASH1在膽囊癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著降低（F=195.34,P＜0.001），其中在GBC-SD 細(xì)胞中的表達(dá)最低（P＜0.05），見圖1A。GBC-SD轉(zhuǎn)染SASH1過表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果顯示，與NC 組相比，oe-SASH1 組中SASH1 相對表達(dá)量顯著增加（t=8.62,P＜0.001），見圖1B。

圖1 SASH1蛋白在膽囊癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

2.3 細(xì)胞增殖能力的檢測

與NC組相比，24 h之后，oe-SASH1組GBC-SD細(xì)胞各個時點的OD 值顯著降低，增殖能力降低（P＜0.05），見表1。

表1 不同時間點NC組和oe-SASH1組GBC-SD細(xì)胞的OD值

表1 不同時間點NC組和oe-SASH1組GBC-SD細(xì)胞的OD值

2.4 細(xì)胞凋亡的檢測

NC組和oe-SASH1組細(xì)胞凋亡率分別為（4.61±0.39）和（14.38±2.16），與NC 組相比，oe-SASH1 組GBC-SD 細(xì)胞凋亡率顯著增加（t=7.710,P=0.001），見圖2。

圖2 流式細(xì)胞實驗檢測SASH1對膽囊癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的檢測

NC 組和oe-SASH1 組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為（68.67±7.39）和（44.33±4.85），與NC 組相比，oe-SASH1 組GBC-SD 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低（t=4.769,P=0.005），見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測SASH1 siRNA對膽囊癌細(xì)胞GBCSD轉(zhuǎn)移能力的影響

2.6 細(xì)胞凋亡體內(nèi)成瘤能力的檢測

采用裸鼠成瘤檢測NC 組和oe-SASH1 組膽囊癌細(xì)胞體內(nèi)生長能力，結(jié)果顯示，與NC 組相比，oe-SASH1 組GBC-SD 細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力顯著降低（P＜0.001），見圖4。

圖4 裸鼠成瘤實驗檢測各組細(xì)胞裸鼠成瘤體積

2.7 SASH1 siRNA 對PI3K/AKT 信號通路及其下游基因表達(dá)的影響

oe-SASH1 組GBC-SD 細(xì)胞中PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白pPI3K 和pAKT 的表達(dá)減少，但是總蛋白PI3K和AKT蛋白的表達(dá)無顯著變化，見圖5和表2。

圖5 Western blotting 實驗檢測SASH1 對膽囊癌細(xì)胞GBCSD細(xì)胞周期蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)的影響

表2 SASH1的表達(dá)對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達(dá)的影響

表2 SASH1的表達(dá)對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達(dá)的影響

3 討論

膽囊癌是膽道中最具有侵略性和最常見的惡性腫瘤[1]。膽囊癌的唯一且可能的治療方法是手術(shù)切除，但由于隱匿性早期癥狀和缺乏診斷標(biāo)志物，在臨床診斷出膽囊癌時，癌細(xì)胞大部分已入侵鄰近器官并通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，喪失了手術(shù)機會。晚期膽囊癌患者對化療藥物反應(yīng)有限，導(dǎo)致了高死亡率。研究顯示，T1 和T2 期的膽囊癌患者5 年生存率分別為85.9%和56.1%，而T3和T4期的膽囊癌患者5年生存率分別下降至19.2%和14.1%[2]。膽固醇代謝和膽結(jié)石等被認(rèn)為是膽囊癌的主要高危因素，但是膽囊癌具體的發(fā)生發(fā)展機理尚未完全闡明[8]。目前已經(jīng)確定癌基因和抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)展，這表明基因研究可能為開發(fā)延長膽囊癌患者生存期的有效藥物提供新的靶點[9]。

SASH1 基因?qū)儆谛盘栥暯拥鞍譙LY 家族的一個成員，定位于細(xì)胞核，包含SAM和SH3結(jié)構(gòu)域，具有信號銜接和分子支架的功能，在正常生命活動中發(fā)揮重要作用，如SASH1通過一氧化氮信號傳導(dǎo)參與調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞成熟過程，以及SASH1在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[3]。研究顯示，SASH1異常表達(dá)引起多種腫瘤的惡性進(jìn)展，是一個新型的腫瘤抑制基因。Zeller等[10]于2003年首次報道在乳腺癌樣品中SASH1的表達(dá)顯著降低。同時，SASH1基因位于染色體6q23-25，該區(qū)域為肺癌易感性基因座，SASH1 與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]，SASH1低表達(dá)預(yù)示非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良，同時，過表達(dá)SASH1可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和對順鉑的敏感性[5]。在胃癌組織中SASH1的表達(dá)顯著低于其癌旁組織，SASH1 低表達(dá)與胃癌患者TNM 分期顯著相關(guān)，是胃癌患者獨立的預(yù)后因素[6]。但是SASH1在膽囊癌中的表達(dá)情況未知，本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，SASH1 在膽囊癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，但是本研究膽囊癌組織樣本較少，未能分析SASH1 表達(dá)水平與膽囊癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，后續(xù)還需進(jìn)一步擴大樣本進(jìn)行研究。

盡管SASH1在膽囊癌組織中表達(dá)異常，其發(fā)揮的功能及作用機制仍有待闡明。目前研究已經(jīng)充分顯示SASH1 調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)功能[4-7]。本研究結(jié)果顯示，SASH1在膽囊癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于在正常膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC中的表達(dá)，并選擇SASH1表達(dá)最低的膽囊癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染SASH1 過表達(dá)質(zhì)粒，過表達(dá)SASH1 抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)成瘤能力，以及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，表明SASH1 抑制膽囊癌的惡性進(jìn)展。SASH1 在蛋白激酶B（Akt）中的抑制作用被認(rèn)為是SASH-1 抗癌作用的潛在分子機制。SASH1 過表達(dá)通過降低p-Akt 及其包括cyclin D1，Bcl-2和MMP-2靶基因的表達(dá)水平抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[12]。Sun 等[13]報道，SASH1可能通過在體內(nèi)和體外下調(diào)PI3K/AKT信號通路抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在骨肉瘤中SASH1 通過PI3K/AKT 信號通路抑制細(xì)胞增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。PI3K/AKT在膽囊癌中也處于異常激活狀態(tài)[15]，在膽囊癌細(xì)胞系中我們發(fā)現(xiàn)SASH1 抑制pPI3K 和pAKT 蛋白的表達(dá)，表明SASH1在膽囊癌中同樣通過下調(diào)PI3K-AKT信號通路發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，SASH1 在膽囊癌組織中低表達(dá)，SASH1可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。SASH1可能是膽囊癌抗治療的潛在分子靶點。