南文慶，范學鋒，宋 濤，王勤學，方彩霞，付衛(wèi)東

（甘肅省慶陽市人民醫(yī)院 1.藥劑科，2.腫瘤科，甘肅 745000）

宮頸癌是全世界女性中第四大最常見的惡性腫瘤，也是腫瘤相關死亡的第四大主要原因，僅在2018年就報告了約57萬例宮頸癌病例和31萬例死亡病例[1]。據估計，全世界宮頸癌死亡的85%左右發(fā)生在低收入和中等收入的發(fā)展中國家中，包括我國在內，宮頸癌死亡率是發(fā)達國家的18 倍[2]。由于診斷和治療的進步，早期宮頸癌患者的臨床結局得到了改善，而晚期和轉移性宮頸癌的預后仍然不盡人意[3]。研究報道天然化合物是抗宮頸癌晚期治療的潛在有效治療劑[4]。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種天然的多酚化合物，其在包括宮頸癌在內的多種腫瘤中的抗腫瘤作用逐漸被報道[5-6]。研究顯示，RSV 通過抑制HPV E6 蛋白、STAT3 磷酸化、自噬信號通路等抑制宮頸癌的惡性進展，但是RSV在宮頸癌發(fā)揮抗腫瘤的具體作用機制未完全明確[6-8]。金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloproteinase 9,ADAM9)屬于ADAM 家族，該家族與包括血管生成、細胞間相互作用和遷移等多種生物學過程相關[9]。ADAM9在宮頸癌組織中高表達，其高表達與宮頸癌患者預后不良相關[10]。Lin 等[11]報道RSV 通過蛋白—蛋白酶體途徑抑制腫瘤細胞中ADAM9蛋白的表達以抑制肺癌和食管癌細胞遷移和生存能力。本研究通過探討RSV調控ADAM9抑制宮頸癌的惡性進展，獲得RSV抗宮頸癌治療的新分子機制及ADAM9作為RSV潛在抗癌靶點的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

宮頸癌細胞系HeLa，購自中國科學院細胞庫；DMEM細胞培養(yǎng)基和FBS，購自北京清大天一生物技術有限公司；DMSO 和RSV 試劑購自美國sigma公司；細胞計數試劑盒-8（CCK8），購自英國Abcam公司；Transwell小室，購自美國Coring公司；活性氧ROS檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；ADAM9敲減質粒（sh-ADAM9）和ADAM9過表達質粒（oe-ADAM9），由上海吉凱基因生物技術有限公司構建；高效蛋白裂解液，購自上海貝博生物科技公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑，購自美國Thermo公司；上樣緩沖液，購自上海碧云天試劑有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，購自北京索萊寶試劑公司；PVDF膜，購自美國Promega公司；ECL化學發(fā)光試劑盒，購自中國大連Meilunbio?飛克特試劑有限公司；ADAM9 和GAPDH 抗體，購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將宮頸癌細胞HeLa 培養(yǎng)在含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，并在5%CO2的37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長滿時，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗兩次后，加入胰酶消化細胞，終止消化后進行細胞傳代。

1.3 CCK8檢測RSV對宮頸癌細胞增殖的影響

HeLa 細胞胰酶消化計數后，以每孔1 500 個細胞接種于96 孔板內，設置0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 濃度RSV 的細胞，每個濃度設置6 個平行復孔。細胞接種10 h后，分別采用相應濃度的RSV處理細胞。藥物處理48 h 后，更換100 μL 培養(yǎng)基和20 μL 的CCK8 試劑，混勻后在37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。采用酶標儀450 nm檢測細胞吸光度值（OD值）。細胞增殖抑制率=（1-相應濃度RSV平均細胞OD值/0濃度RSV平均細胞OD值）×100%。

1.4 細胞分組及細胞轉染

HeLa 細胞胰酶消化計數后，以每孔2×105個細胞接種于6孔板內，分為DMSO組和RSV組。細胞接種10 h時，采用20μmol/L的RSV處理RSV組，采用相對應體積的DMSO處理DMSO組，放置培養(yǎng)箱中處理48 h。

HeLa 細胞胰酶消化計數后，以每孔2×105個細胞接種于6孔板內，分為RSV組、RSV+NC組、RSV+sh-ADAM9 組和RSV+oe-ADAM9 組。細胞接種10 h后，RSV組采用20μmol/L的RSV處理細胞，RSV+NC 組采用20μmol/L 的RSV 處理細胞并采用脂質體2000 轉染無關序列，RSV+sh-ADAM9 組采用20μmol/L的RSV處理細胞并采用脂質體2000轉染ADAM9敲減質粒，RSV+oe-ADAM9組采用20μmol/L的RSV處理細胞并采用脂質體2000轉染ADAM9過表達質粒。

1.5 Transwell檢測細胞遷移能力

各組HeLa 細胞胰酶消化并洗滌細胞兩次后，計數，以1×106個細胞重懸至100μL 無血清培養(yǎng)基中，鋪在Transwell 小室的上腔室中的聚碳酸酯膜上。600μL 完全培養(yǎng)基（含有10%FBS）放入Transwell 小室的下室中，放至37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將穿過膜的細胞于甲醇溶液中固定10 min，吉姆薩染色30 min。采用顯微鏡計數細胞穿過的數目。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

各組HeLa 細胞胰酶消化并洗滌細胞兩次后，加入高效蛋白裂解液。細胞裂解后4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，獲得蛋白上清液。BCA 蛋白濃度檢測試劑檢測蛋白的濃度，水煮變性。50μg 等量蛋白加至SDS-PAGE 凝膠中80 V 電泳2 h 后，采用350 mA、1.5 h 將蛋白條帶轉移至PVDF 膜上。PVDF 膜與8%脫脂牛奶室溫孵育1 h，封閉非特異性抗原。TBST 洗3 次后，與ADAM9 一抗稀釋液（稀釋倍數1∶500）、GAPDH 一抗稀釋液（稀釋倍數1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗3 次后，與兔二抗稀釋液（稀釋倍數1∶10 000）常溫孵育1 h，TBST 搖床洗3 次后，采用ECL 化學發(fā)光法顯示蛋白條帶。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 流式細胞儀檢測ROS

各組HeLa 細胞棄掉舊培養(yǎng)基后，加入含有10μmol/L DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)基放置37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中孵育30 min進行探針裝載。PBS洗3次后，采用流式細胞儀，在488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，獲得樣品熒光強度。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSV抑制宮頸癌細胞HeLa增殖

HeLa 細胞經不同濃度的RSV 處理48 h 后，CCK8結果顯示RSV呈濃度依賴性抑制宮頸癌細胞HeLa的增殖能力，見圖1。

圖1 RSV對HeLa細胞增殖能力的影響

2.2 RSV抑制宮頸癌細胞遷移能力

20 μmol/L 的RSV 處理宮頸癌細胞HeLa 48 h后，Transwell 小室實驗檢測結果顯示，DMSO 組穿膜細胞數為（74.33±16.09）個，RSV組穿膜細胞數為（30.67±3.79）個。與DMSO 組比較，RSV 組宮頸癌細胞遷移能力顯著降低(t=4.582,P=0.006)，見圖2。

圖2 RSV對HeLa細胞遷移能力的影響

2.3 RSV抑制宮頸癌細胞中ADAM9蛋白的表達

20 μmol/L 的RSV 處理宮頸癌細胞HeLa 48 h后，western blotting實驗檢測結果顯示，DMSO組細胞中ADAM9 蛋白的表達為0.98±0.09，RSV 組細胞中ADAM9蛋白的表達為0.13±0.04，與DMSO組相比，RSV 組宮頸癌細胞中ADAM9 蛋白的表達顯著降低(t=14.945,P=0.000)，見圖3。

圖3 RSV對HeLa細胞中ADAM9蛋白表達的影響

2.4 RSV抑制宮頸癌細胞中ROS的產生

20 μmol/L 的RSV 處理宮頸癌細胞HeLa 48 h后，流式細胞儀檢測結果顯示，DMSO 組細胞中ROS相對熒光強度為1.00±0.02，RSV組細胞中ROS相對熒光強度為0.44±0.08，與DMSO 組相比，RSV組宮頸癌細胞中ROS 產生顯著降低(t=11.760,P=0.000)，見圖4。

圖4 RSV對HeLa細胞中ROS產生的影響

2.5 RSV 調控ADAM9 基因對宮頸癌細胞增殖能力的影響

與RSV 組和RSV+NC 組比較，RSV+sh-ADAM9 組細胞增殖能力降低，RSV+oe-ADAM9 組細胞增殖能力增加，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 RSV調控ADAM9基因對宮頸癌細胞增殖能力的影響

2.6 RSV 調控ADAM9 基因對宮頸癌細胞遷移能力的影響

RSV 組、RSV+NC 組、RSV+sh-ADAM9 組和RSV+oe-ADAM9組穿膜細胞數分別為55.67±6.28、53.33±7.81、26.33±5.96、80.33±7.04，與RSV 組和RSV+NC組相比，RSV+sh-ADAM9組細胞遷移能力明顯降低，RSV+oe-ADAM9 組細胞遷移能力明顯升高(均P＜0.05)，見圖6。

圖6 Transwell檢測RSV調控ADAM9基因對宮頸癌細胞遷移能力的影響

2.7 RSV 調控ADAM9 基因對宮頸癌細胞HeLa ROS的影響

RSV 組、RSV+NC 組、RSV+sh-ADAM9 組和RSV+oe-ADAM9 組ROS 相對熒光強度分別為1.00±0.02、0.98±0.03、0.41±0.05、2.31±0.19，與RSV組 和RSV+NC 組相 比，RSV+sh-ADAM9 組 細 胞ROS 產生明顯降低，RSV+oe-ADAM9 組細胞ROS產生明顯增加(均P＜0.05)，見圖7。

圖7 流式細胞儀檢測RSV調控ADAM9基因對宮頸癌細胞ROS產生的影響

3 討論

研究顯示，雙氫青蒿素、三氧化二砷等為代表的傳統中藥具有來源廣泛、毒副作用較小及療效顯著等優(yōu)勢在抗腫瘤中日益顯現，為改善腫瘤患者臨床效果和延長患者壽命帶來了新希望[4,12]。RSV（3、4、5-三羥基-反式-二苯乙烯）是一種天然的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、蔓越莓、花生和紅酒中，由于其抗氧化劑的特性，RSV具有多種有價值的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌和心血管保護作用[13]。RSV 的抗腫瘤作用也逐漸被發(fā)現，目前RSV 在實體腫瘤和血液系統腫瘤中的抑癌作用均被報道，能顯著抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移、化療耐藥及誘導細胞凋亡等腫瘤生物學過程[5,14]。Sun等[5]研究發(fā)現，RSV通過抑制HeLa和Ca Ski細胞中HPV E6 蛋白和視網膜母細胞瘤蛋白誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯抑制宮頸癌進展。

本研究通過CCK8 實驗和Transwell 實驗發(fā)現，RSV 顯著抑制宮頸癌HeLa 細胞增殖和遷移能力，表明RSV 能抑制宮頸癌的惡性進展，與Sun 等[7]的報道相一致。同時，Sun 等[7]報道RSV 通過調控STAT3 信號通路降低STAT3 磷酸化狀態(tài)、上皮—間質轉化分子標記蛋白質水平和細胞外基質降解酶，以抑制宮頸癌細胞的增殖和轉移能力。細胞外基質降解酶通過降解細胞外基質以促使血管生成是腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟之一，研究顯示，金屬蛋白酶（ADAM）家族是細胞外基質降解酶的重要蛋白，其通過將膜錨定的蛋白質在胞外域脫落的過程中將其胞外域分離，而在細胞增殖、粘附、遷移和侵襲中起關鍵作用[10]。Lin 等[11]發(fā)現RSV 通過抑制ADAM9蛋白的表達在肺癌和食管癌中發(fā)揮抗癌作用。

ADAM9 是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其結構包含一個用于脫落的金屬蛋白酶域和一個用于粘附的雙整合蛋白域。ADAM9在多種類型的惡性腫瘤中過表達，增強包括乳腺癌、肺癌和食管癌等細胞的生長、遷移和轉移能力，因此ADAM9 是候選癌基因，是抗腫瘤治療的潛在靶標[15]。在宮頸癌中ADAM9同樣被發(fā)現高表達，并與患者預后差相關[10]。本研究發(fā)現，RSV 能顯著抑制宮頸癌細胞中ADAM9 蛋白的表達。為了進一步驗證RSV 是通過調控ADAM9抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移能力，我們構建ADAM9 過表達和敲減質粒，結果顯示，ADAM9 敲減增強了RSV 對宮頸癌細胞增殖和遷移的抑制作用，ADAM9 過表達減弱了RSV 對宮頸癌細胞增殖和遷移的抑制作用，表明ADAM9 能促進宮頸癌細胞增殖和遷移能力，且RSV 通過抑制ADAM9 的表達在宮頸癌中發(fā)揮抗癌作用。

ROS是由氧氣形成的幾種活性物質的總稱，是由一些氧分子以單價還原形式產生的。ROS 是重要的信號分子，通過調節(jié)血管的結構和功能，影響細胞的蛋白質、脂質和核酸在調節(jié)細胞增殖、遷移和分化中發(fā)揮重要作用[16]。在胰腺癌中，RSV 抑制ROS 誘導的腫瘤細胞活化、侵襲、遷移和糖酵解[17]。同時，Dong等[18]報道ADAM9通過增加ROS的產生促使白介素6誘導的肝細胞癌細胞遷移和侵襲。本研究結果發(fā)現，RSV能顯著抑制宮頸癌細胞中ROS的產生，且ADAM9 敲減增強了RSV 對宮頸癌細胞ROS 產生的抑制作用，ADAM9 過表達減弱了RSV對宮頸癌細胞ROS產生的抑制作用，表明RSV通過抑制ADAM9 蛋白的表達減少ROS 的產生進而抑制宮頸癌細胞的惡性進展。

綜上所述，RSV顯著抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移能力，可能是通過抑制ADAM9 蛋白的表達減少ROS 的產生發(fā)揮作用。ADAM9 可能是RSV 抗宮頸癌治療的潛在分子靶點。