郭志強，李鈺艷，許斌兵△

（四川省遂寧市中心醫(yī)院 1.麻醉科 2.內(nèi)分泌科，遂寧 629000）

氧化應激是一種體內(nèi)抗氧化與氧化作用失調(diào)的狀態(tài)，其所致的神經(jīng)元凋亡是阿爾茨海默癥和帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病的重要機制[1-2]。納洛酮（naloxone，NA）是一種人工合成的阿片受體拮抗劑，在臨床用于麻醉鎮(zhèn)痛過量挽救和急性呼吸抑制、急性酒精中毒等的治療[3-4]。既往研究表明，NA可通過抑制或阻斷病理損傷的最后途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用[5]，但其是否通過抗氧化應激損傷減輕神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用并不清楚。過氧化氫（H2O2）是一種強氧化劑，常被用作構(gòu)建氧化應激損傷模型的誘導劑[6-8]。本研究以小鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，旨在探討NA 對H2O2誘導的海馬神經(jīng)元的保護作用機制是否與其抑制氧化應激所介導的細胞凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠海馬神經(jīng)元HT22購于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，貨號：MNCL-010；NA購于上海熹垣生物，貨號：XY-USP-1 453005；H2O2購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號：H1009；DMEM 培養(yǎng)基、放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于上海生工生物工程有限公司，貨號：E600010-0500、C500005、D110016-0100、D751027-0048，胎牛血清、細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、十二烷基硫酸—鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)試劑盒和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)活性檢測試劑盒購于上海索萊寶生物公司，貨 號：F8245-100、ck04、QS1500、CA1020、QS1001、P1320、K106-100；c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化(phospho，p)-JNK抗體購于美國Cell Signaling Technology，貨號：9252S、9255S；p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK) 和 pp38MAPK 抗體購于英國Abcam，貨號：ab31828、ab178867。

1.2 神經(jīng)元培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在濕度為80%、溫度為37 ℃、二氧化碳體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞，待細胞密度達80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗選取長勢良好的第3～5代指數(shù)期細胞進行實驗。

1.3 CCK-8法檢測神經(jīng)元活力（1）H2O2最佳誘導濃度的選?。簩嶒灧譃棰賹φ眨? μmol/L）組：正常培養(yǎng)HT22細胞；②空白組：不接種HT22細胞，只加入等量培養(yǎng)基；③5 個H2O2處理組：加入終濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 和400 μmol/L H2O2處理24 h；其中每組設3 個復孔。（2）NA 最佳作用濃度的選?。簩嶒灧譃棰賹φ眨? μmol/L）組：同（1）；②空白組：同（1）；③5個NA處理組：加入終濃度為0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 和100 μmol/L NA 處理24 h；其中每組設3 個復孔。（3）NA 對H2O2誘導的細胞活力檢測：實驗分為①正常組：正常培養(yǎng)HT22 細胞；②空白組：同（1）；③H2O2組：以200 μmol/L H2O2處理24 h；④H2O2+低、高NA 2 個處理組：以200 μmol/L H2O2和0.1 μmol/L、1 μmol/L NA 共同處理24 h；其中每組設3 個復孔。將指數(shù)期HT22 細胞接種至96 孔細胞板上，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；根據(jù)上述分組對HT22 細胞處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，加入CCK-8 工作液10 μL；室溫孵育2 h 后，采用酶標儀在490 nm 波長處檢測HT22 細胞光密度（optic density，OD）值，并以（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%表示神經(jīng)元活力。實驗重復3次。

1.4 神經(jīng)元上清液中LDH釋放量和SOD、MDA水平檢測 按照“1.3項”中實驗（3）處理HT22細胞后，收集正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA 組細胞上清液，參照LDH試劑盒和SOD、MDA試劑盒說明書檢測各組神經(jīng)元上清液中LDH 釋放量和SOD、MDA水平。實驗重復3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡 收集處理結(jié)束后的正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA組細胞，使用磷酸緩沖液對細胞進行漂洗；300 μL 1×binding buffer調(diào)整細胞濃度后，取含有105個細胞懸液于上樣管中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI；避光雙染15 min后，上機檢測各組神經(jīng)元凋亡情況。實驗重復3次。

1.6 神經(jīng)元Caspase-3活性檢測 處理結(jié)束后的正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA 組細胞，以1 000 r/min離心15 min后，吸去上清液；經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，加入細胞裂解液30 μL裂解10 min后，再次離心棄上清；嚴格參照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書檢測各組神經(jīng)元Caspase-3活性。實驗重復3次。

1.7 免疫印跡法檢測神經(jīng)元中JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 蛋白表達 收集處理結(jié)束后的正常組、H2O2組和H2O2+低、高NA組細胞，加入RIPA裂解液抽提細胞總蛋白；采用考馬斯亮藍法檢測總蛋白濃度與純度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液充分混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min；將變性后的蛋白樣品行SDS-PAGE 分離后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；采用含5%脫脂奶粉封閉液封閉聚偏氟乙烯膜2 h 后，以1∶2 000 比例稀釋的GAPDH、JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 一抗于4 ℃冰箱孵育過夜；次日，以1∶5 000 比例稀釋的GAPDH、JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 二抗室溫孵育2 h 后，滴加化學發(fā)光劑暗室內(nèi)顯影曝光；以GAPDH 為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析神經(jīng)元中JNK、p-JNK、p38MAPK 和p-p38MAPK 蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2最佳誘導濃度的選取25 μmol/L、50 μmol/L H2O2作用后神經(jīng)元活力雖有所降低，但與0 μmol/L 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而100 μmol/L、200 μmol/L 和400 μmol/L H2O2作用后神經(jīng)元活力較0 μmol/L 明顯降低（均P＜0.05），且200 μmol/L H2O2作用后神經(jīng)元活力為62.65%，故后續(xù)以200 μmol/L H2O2進行實驗，見表1。

表1 不同濃度H2O2作用后神經(jīng)元活力變化n=9，

表1 不同濃度H2O2作用后神經(jīng)元活力變化n=9，

與0 μmol/L比較，*P＜0.05。

2.2 NA 最佳作用濃度的選取 與0 μmol/L 比較，0.1 μmol/L 和1 μmol/L NA 作用下神經(jīng)元活力明顯增強（均P＜0.05）；而10 μmol/L 和100 μmol/L NA作用后神經(jīng)元活力較0 μmol/L 明顯降低（均P＜0.05），對神經(jīng)元產(chǎn)生明顯毒性作用。故后續(xù)以0.1 μmol/L和1 μmol/L NA進行實驗，見表2。

表2 不同濃度NA作用后神經(jīng)元活力變化n=9，

表2 不同濃度NA作用后神經(jīng)元活力變化n=9，

與0 μmol/L比較，*P＜0.05。

2.3 NA 對H2O2誘導的海馬神經(jīng)元活力及LDH 釋放量的影響 與正常組比較，H2O2組神經(jīng)元活力明顯降低，而LDH釋放量明顯升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，H2O2+低NA 組和H2O2+高NA 組神經(jīng)元活力明顯升高，而LDH釋放量明顯降低（均P＜0.05）；與H2O2+低NA 組比較，H2O2+高NA 組神經(jīng)元活力明顯升高，而LDH釋放量明顯降低（均P＜0.05），見表3。

表3 各組神經(jīng)元活力和LDH釋放量比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

2.4 NA對H2O2誘導的海馬神經(jīng)元MDA和SOD水平的影響 與正常組比較，H2O2組神經(jīng)元上清液中MDA 水平明顯升高，而SOD 水平明顯降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，H2O2+低NA組和H2O2+高NA組細胞上清液中MDA 水平明顯降低，而SOD 水平明顯升高（P＜0.05）；與H2O2+低NA 組比較，H2O2+高NA組細胞上清液中MDA水平明顯降低，而SOD水平明顯升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組神經(jīng)元上清液中MDA和SOD水平比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

2.5 NA對H2O2誘導的海馬神經(jīng)元凋亡的影響

與正常組比較，H2O2組細胞凋亡率和Caspase-3活性明顯升高（P＜0.05）；而H2O2+低NA組和H2O2+高NA 組細胞凋亡率和Caspase-3 活性較H2O2組明顯降低（P＜0.05）；H2O2+高NA組凋亡率和Caspase-3 活性較H2O2+低NA 組明顯降低（P＜0.05），見圖1和表5。

表5 各組神經(jīng)元凋亡率和Caspase-3活性比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

2.6 NA 對H2O2誘導的海馬神經(jīng)元JNK/p38MAPK通路的影響 與正常組比較，H2O2組神經(jīng)元中JNK/p38MAPK 通路關(guān)鍵因子JNK 和p38MAPK 磷酸化水平明顯升高（P＜0.05）；而H2O2+低NA組和H2O2+高NA 組細胞中JNK 和p38MAPK 磷酸化水平較H2O2組明顯降低（P＜0.05）；H2O2+高NA 組細胞中JNK和p38MAPK磷酸化水平較H2O2+低NA組明顯降低（P＜0.05），見圖2和表6。

表6 各組中JNK和p38MAPK磷酸化水平比較n=9，

與正常組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05；與H2O2+低NA組比較，&P＜0.05。

3 討論

大腦是神經(jīng)系統(tǒng)最高級部分，相對其他組織而言，腦組織耗氧量多、能量代謝旺盛、抗氧化能力差，更易因氧自由基攻擊而發(fā)生氧化應激損傷；大量氧自由基的產(chǎn)生不僅可引起神經(jīng)細胞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等功能的改變，還可激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3 活化；而Caspase-3 活化后可引起一系列的酶級聯(lián)反應，促進神經(jīng)細胞凋亡[9]。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，在記憶和空間定位等過程中發(fā)揮著重要作用；在阿爾茨海默病和帕金森等神經(jīng)退行性疾病中海馬組織中伴隨著大量海馬神經(jīng)元凋亡[2,10-11]，因此，抗海馬神經(jīng)元凋亡是治療神經(jīng)退行性疾病的重要策略。

作為一種強氧化劑，H2O2極易進入細胞產(chǎn)生氧自由基或羥基自由基，促進活性氧的產(chǎn)生，進而引起氧化應激損傷。LDH是一種糖酵解酶，在細胞受損時可從細胞內(nèi)釋放到細胞外，常被作為反映細胞損傷的重要指標[12-13]。SOD是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，可通過病理歧化作用清除過多的氧自由基，減輕細胞損傷；MDA是一種生物體脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，可導致細胞功能損傷；SOD和MDA常被作為反映細胞氧化應激損傷的重要指標[14]。本研究以不同濃度的H2O2誘導小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L H2O2作用后神經(jīng)元活力為62.65%，死亡較少；此外，200 μmol/L H2O2還可誘導神經(jīng)元LDH釋放量、MDA水平、神經(jīng)元凋亡率和Caspase-3活性升高，而SOD水平減少（P＜0.05）。表明H2O2可通過誘導氧化應激損傷引起海馬神經(jīng)元凋亡，H2O2氧化應激損傷模型構(gòu)建成功。

NA是一種對神經(jīng)細胞有保護作用的阿片受體拮抗劑，可通過調(diào)控HSP60-TLR4 途徑介導炎癥反應而抑制小膠質(zhì)細胞活化[2]，也可抑制神經(jīng)細胞凋亡減輕腦缺血再灌注損傷[15]。研究顯示，NA可通過下調(diào)MDA 和上調(diào)SOD 水平發(fā)揮抗氧化作用[16]，但其是否通過抗氧化應激途徑減弱神經(jīng)細胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用并不明確。本研究首先以不同濃度NA作用小鼠海馬神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1 μmol/L和1 μmol/L NA 作用下神經(jīng)元活力增強，無明顯毒性產(chǎn)生；以0.1 μmol/L 和1 μmol/L NA 與H2O2聯(lián)合作用后發(fā)現(xiàn)，H2O2引起的LDH 釋放量、MDA 水平、神經(jīng)元凋亡率和Caspase-3活性升高以及SOD水平減少均明顯逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。結(jié)果表明，NA 可能通過抑制氧化應激損傷減輕海馬神經(jīng)元凋亡。提示NA的神經(jīng)保護作用與其抑制氧化應激損傷所介導的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

MAPK 通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，其中JNK 和p38MAPK 是該途徑的重要組成部分；當受到外界應激刺激時，JNK 和p38MAPK 可通過磷酸化被激活，而激活的JNK/p38MAPK 具有促進細胞凋亡的作用，與神經(jīng)損傷密切相關(guān)[17]。研究顯示，氧化應激誘導劑H2O2可通過激活JNK和p38MAPK通路誘導神經(jīng)細胞凋亡[18]；而NA 具有抑制JNK 和p38MAPK 通路活化的作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L H2O2可誘導神經(jīng)元JNK和p38MAPK磷酸化水平明顯升高，而給予NA作用后，H2O2誘導引起的上述變化明顯受到抑制（P＜0.05）。結(jié)果表明，NA 可抑制H2O2誘導的神經(jīng)元JNK/p38MAPK 通路活化。提示NA抑制氧化應激損傷所介導的神經(jīng)元凋亡可能與其抑制JNK/p38MAPK通路活化有關(guān)。

綜上所述，NA可能通過抑制JNK/p38MAPK通路活化減輕H2O2誘導的海馬神經(jīng)元損傷，進而抑制海馬神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而，NA抑制JNK/p38MAPK 通路活化的詳細機制，還有待后續(xù)進一步深入探討。