韋秀莎，黃金石，吳婭妮，高雨桐，陳 銘，黃仁彬

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

蛞蝓（Limax）屬腹足類(lèi)腹足綱蛞蝓科，一種有肺的軟體動(dòng)物，俗稱(chēng)“鼻涕蟲(chóng)”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》卷四下品、《本草綱目》、《中藥大辭典》等中醫(yī)藥書(shū)籍對(duì)蛞蝓性味歸經(jīng)、功效主治均有記載，主治蜈蚣咬傷、痔熱腫痛、腳脛爛瘡、清熱祛風(fēng)、消腫解毒、破痰通經(jīng)、中風(fēng)歪僻、筋脈拘攣、驚癇、喘息、喉痹、咽腫、癰腫、丹毒、經(jīng)閉、癥瘕等。藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛞蝓提取物具有抗腫瘤、平喘等多方面的作用，且其毒性較低[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，蛞蝓含蛋白、多糖等多種成分。陳亮等[4]研究發(fā)現(xiàn)，蛞蝓抗癌有效成分不是蛋白，有可能是多糖。但目前缺乏對(duì)水溶性蛞蝓多糖的結(jié)構(gòu)及其含量的研究，因此，本組對(duì)水提法獲得的蛞蝓多糖進(jìn)行鑒定，初步確定其結(jié)構(gòu)，測(cè)定其含量，為研究蛞蝓多糖的藥理作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥和儀器

蛞蝓，采自廣西百色，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴(lài)茂祥教授鑒定，確定為腹足類(lèi)腹足綱蛞蝓科蛞蝓（Limax）。低溫高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒一托利多公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上北京譜析TV-1901）；傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)珀金埃爾莫Spectrum 100）。所用到的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 蛞蝓的性狀鑒別與顯微鑒別[5]

根據(jù)《中國(guó)藥典》2020版的項(xiàng)目要求第15項(xiàng)，對(duì)本次實(shí)驗(yàn)采集的蛞蝓全蟲(chóng)大小、顏色、器官、氣味等特征進(jìn)行性狀觀察。將蛞蝓全蟲(chóng)置于4%甲醛溶液中固定，24 h后，進(jìn)行標(biāo)本修剪、漂洗、脫水、透明、透蠟、包埋、切片與展片、烘片，中性樹(shù)脂封片，蘇木精—伊紅（HE）染色后，通過(guò)顯微鏡對(duì)蛞蝓橫切面組織形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.3 蛞蝓多糖的提取

稱(chēng)取蛞蝓全蟲(chóng)1 kg，液料比2∶1加入蒸餾水進(jìn)行破壁勻漿，4 000 r/min低溫離心15 min，棄上層漂浮物和下層沉淀，得粗提液，加80%乙醇醇沉24 h，離心，收集沉淀，低溫真空干燥，研磨均勻，過(guò)40 目篩，得蛞蝓粗多糖[6]。

1.4 蛞蝓多糖的鑒定試驗(yàn)[7]

取200 mg的蛞蝓多糖溶解于10 mL蒸餾水中，超聲助溶30 min，得蛞蝓多糖溶液。采用Molish 反應(yīng)和斐林反應(yīng)鑒定蛞蝓多糖。Molish 反應(yīng)：分別取1 mL 的蒸餾水陰性對(duì)照溶液和蛞蝓多糖溶液于試管中，然后加4滴α-萘酚試劑，搖勻后沿管壁緩緩滴加濃硫酸1 mL，觀察液面交界處是否有紫環(huán)。斐林反應(yīng)：分別取1 mL的蒸餾水陰性對(duì)照溶液和蛞蝓多糖溶液于試管中，再分別往試管滴加事先配好的斐林試劑1 mL，沸水浴10 min，觀察試管底部是否有磚紅色沉淀。

1.5 蛞蝓多糖的組成分析[8-9]

樣品a溶液的制備：稱(chēng)取蛞蝓全蟲(chóng)1 kg，液料比2∶1 加入蒸餾水進(jìn)行破壁勻漿，4 000 r/min 低溫離心15 min，棄上層漂浮物和下層沉淀，得粗提液，冷凍干燥得樣品a 溶液。樣品b 溶液的制備：同“1.3項(xiàng)”。樣品酸水解：于20 mL 具塞試管中，分別加入125 mg 樣品a 溶液和樣品b 溶液，后加入10 mL 2 mol/L的硫酸，混勻，置于105 ℃的烘箱水解4 h，冷卻至室溫，加入碳酸鋇中和水解液，然后離心20 min(10 000 r/min)，吸取上清液，過(guò)濾，分別得樣品a、b水解液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?biāo)準(zhǔn)糖溶液的制備：分別稱(chēng)取100 mg的L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-核糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，加10 mL水，配制成10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液。分別吸取0.5 μL 標(biāo)準(zhǔn)糖溶液，3 μL 樣品a、b 水解液點(diǎn)樣于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇—甲醇—氯仿—冰乙酸—蒸餾水（25∶9∶5∶3∶3）作為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出后待薄層板晾干，噴以苯胺—二苯胺磷酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，于日光下檢視。

1.6 蛞蝓多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)鑒定[6,10]

稱(chēng)取0.5 mg蛞蝓多糖樣品，與110 mg溴化鉀研磨成粉末，混勻，按照儀器條件進(jìn)行測(cè)定。

1.7 含量測(cè)定[11-15]

1.7.1 對(duì)照品與供試品的制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品1.0 mg，加蒸餾水定容至10 mL，得濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：稱(chēng)量50 mg蛞蝓多糖，加蒸餾水定容至10 mL，超聲30 min，過(guò)濾，量取濾液1 mL，定容至10 mL，備用。

1.7.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 以蒸餾水為空白，取葡萄糖對(duì)照品與樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)“1.7.4項(xiàng)”操作，于400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.7.3 顯色條件的考察 6%苯酚用量考察：分別在7個(gè)試管內(nèi)加入對(duì)照品1.0 mL，逐管加入6%苯酚溶液0.6 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL、1.3 mL，搖勻，迅速加入5 mL 濃硫酸，沸水浴15 min，冷卻，測(cè)定波長(zhǎng)485 nm處的吸光度值。濃硫酸用量考察：分別在5 個(gè)試管內(nèi)加入對(duì)照品1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，逐管迅速加入濃硫酸3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，沸水浴15 min，冷卻，測(cè)定波長(zhǎng)485 nm 處的吸光度值。水浴溫度考察：分別在5 個(gè)試管內(nèi)加入對(duì)照品溶液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，分別于水溫為25 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃條件下反應(yīng)15 min，冷卻，測(cè)定最大波長(zhǎng)485 nm 處的吸光度值。顯色時(shí)間的考察：分別在4 個(gè)試管內(nèi)加入對(duì)照品溶液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，分別于沸水反應(yīng)15 min、30 min、45 min、60 min，冷卻，測(cè)定485 nm處的吸光度值。

1.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密吸取葡萄糖對(duì)照品0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，用蒸餾水補(bǔ)足體積至1 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密量取5 mL 濃硫酸滴加入試管，沸水浴15 min，冷卻。測(cè)定波長(zhǎng)485 nm處的吸光度值。

1.7.5 方法學(xué)考察 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取一份蛞蝓多糖，同“1.7.1 項(xiàng)”法制備供試品，分別于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 同“1.7.4 項(xiàng)”法測(cè)定波長(zhǎng)485 nm 處吸光度值，并計(jì)算RSD 值。重復(fù)性試驗(yàn)：取6份同一批次蛞蝓多糖，同“1.7.1項(xiàng)”法制備供試品，同“1.7.4 項(xiàng)”法測(cè)定485 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，并計(jì)算RSD 值。精密度試驗(yàn)：精密稱(chēng)定50 mg蛞蝓多糖，同“1.7.1 項(xiàng)”法制備供試品，同“1.7.4 項(xiàng)”法在485 nm波長(zhǎng)處連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次吸光度值，并計(jì)算RSD 值。加樣回收率：按表2 精密稱(chēng)取6 份已知多糖含量的蛞蝓多糖，同“1.7.1項(xiàng)”法制備成供試品溶液，分別按表2加入不同含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，同“1.7.4項(xiàng)”法測(cè)定485 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)吸光度值，計(jì)算得平均回收率。

1.7.6 蛞蝓多糖含量測(cè)定 取1 mL 供試品溶液，同“1.7.4項(xiàng)”法在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算以葡萄糖計(jì)的多糖百分含量。

2 結(jié)果

2.1 蛞蝓性狀鑒別與顯微鑒別

蛞蝓呈長(zhǎng)梭狀，兩頭小，中間大，體長(zhǎng)30～55 mm，體寬6～12 mm；體表呈灰褐色，同時(shí)伴有零星又細(xì)小的褐色斑點(diǎn)，體表光滑有黏液；頭部有兩對(duì)觸角，前端一對(duì)各有眼一個(gè)，后端一對(duì)較長(zhǎng)，觸角可以自由伸縮；其右側(cè)附近有橢圓形生殖孔，氣腥味咸，見(jiàn)圖1。通過(guò)顯微鏡對(duì)蛞蝓橫切面組織形態(tài)進(jìn)行觀察，可以看到蛞蝓最外層為表皮組織，緊貼著是大量的粘液腔，還有大而散列的消化腔，泄殖腔器官明顯，見(jiàn)圖2。

圖1 蛞蝓外觀圖

圖2 蛞蝓HE染色圖（×200）

2.2 蛞蝓多糖的鑒定試驗(yàn)

蒸餾水的Molish 反應(yīng)雖然有分層，但無(wú)紫環(huán)，而蛞蝓多糖液面交界處有清晰可見(jiàn)的紫環(huán)；蛞蝓多糖的斐林反應(yīng)有明顯有磚紅色沉淀，而蒸餾水的斐林反應(yīng)呈現(xiàn)與斐林試劑相同的顏色，無(wú)沉淀，提示提取物是含有還原糖的多糖，見(jiàn)圖3。

圖3 蛞蝓多糖的鑒定試驗(yàn)

2.3 蛞蝓多糖的組成分析

通過(guò)薄層色譜分析蛞蝓多糖的單糖成分，觀察到蛞蝓多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成，見(jiàn)圖4、表1。

表1 蛞蝓多糖水解物和標(biāo)準(zhǔn)單糖的Rf值

圖4 蛞蝓多糖薄層色譜圖

2.4 蛞蝓多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)鑒定

該樣品在4 000.00～600.00 cm-1區(qū)域內(nèi)具有多糖類(lèi)物質(zhì)的一般特征。3 420.17 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰是糖分子中—OH 的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 961.37 cm-1和2 930.63 cm-1分別為C—H 的2 個(gè)伸縮振動(dòng)吸收峰；1 648.05 cm-1處的強(qiáng)吸收峰說(shuō)明蛞蝓多糖含有糖醛酸；1 545.63 cm-1處出現(xiàn)振動(dòng)吸收是N—H鍵的彎曲振動(dòng)；1 401.23 cm-1處吸收峰為=CH2的變形吸收峰；1 385.24 cm-1處的吸收峰是C—H 變角振動(dòng)峰；1 240.15 cm-1處吸收峰是C—O 伸縮振動(dòng)峰；在1 077.69 cm-1處的吸收峰是吡喃糖環(huán)羥基的變角振動(dòng)吸收峰；929.12 cm-1處吸收峰說(shuō)明含有α和β-吡喃環(huán)型糖苷鍵，見(jiàn)圖5。以上結(jié)果表明，蛞蝓多糖是含有吡喃環(huán)型糖苷鍵和酰胺鍵的酸性多糖。

圖5 蛞蝓多糖紅外光譜圖

2.5 含量測(cè)定

樣品和對(duì)照液的最大吸收波長(zhǎng)均為485 nm，因此本次試驗(yàn)選擇485 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，見(jiàn)圖6。隨著6%苯酚的用量增加，吸光度值先升高后降低，當(dāng)6%苯酚用量為1.0 mL 時(shí)，吸光度達(dá)到峰值，因此，本次實(shí)驗(yàn)6%苯酚的用量為1.0 mL；隨著濃硫酸的用量增加，吸光度值先升高后降低，當(dāng)濃硫酸用量為5.0 mL 時(shí)，吸光度達(dá)到峰值，因此，本次實(shí)驗(yàn)濃硫酸選擇的用量5.0 mL；在40～80 ℃的吸光度值變化趨于平緩，在100 ℃時(shí)，吸光值達(dá)到峰值，故本次實(shí)驗(yàn)選擇的水浴溫度為100 ℃；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值呈下降趨勢(shì)，故本次實(shí)驗(yàn)選擇的沸水浴反應(yīng)時(shí)間為15 min，見(jiàn)圖7。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性回歸方程式A=0.0104C-0.0305（R2=0.9994）。在方法學(xué)考察中，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 值為0.10%（n=6），重復(fù)性試驗(yàn)RSD值為1.75%（n=6），精密度試驗(yàn)RSD 值為0.08%（n=6），加樣回收率為98.70%，RSD為1.13%（表2）。以葡萄糖計(jì)蛞蝓多糖的平均含量為18.47%。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果n=6

圖6 葡萄糖對(duì)照品與樣品的波長(zhǎng)掃描圖

圖7 顯色條件的考察

3 討論

在進(jìn)行多糖的鑒別實(shí)驗(yàn)前，先對(duì)蛞蝓藥材進(jìn)行性狀鑒別，顯微鑒別，保證藥材的可靠性。多糖的常用鑒別方法有Molish 和斐林反應(yīng)。Molish 反應(yīng)雖不具有專(zhuān)屬性，但可鑒別藥品中是否含有糖類(lèi)，斐林反應(yīng)可以鑒別藥品中是否含有還原糖，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知提取物含有還原糖的多糖。薄層色譜實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為了尋找合適的鑒別條件，實(shí)驗(yàn)前期對(duì)展開(kāi)系統(tǒng)、展開(kāi)距離、耐用性進(jìn)行了考察，最終確定展開(kāi)條件為：展開(kāi)劑為正丁醇—甲醇—氯仿—冰乙酸—蒸餾水（25∶9∶5∶3∶3）；上行展開(kāi)距離為8 cm，選擇硅膠G板為薄層板、苯胺—二苯胺磷酸為顯色劑，日光下檢視，25 ℃條件下跑板。在多糖的水解實(shí)驗(yàn)前期探索了氫氧化鈉，強(qiáng)氧化鋇，碳酸鋇的中和效果，發(fā)現(xiàn)碳酸中和得到的斑點(diǎn)比較集中清晰。用碳酸鋇中和水解液，容易降低單糖的濃度，只有含量高的單糖斑點(diǎn)易顯現(xiàn)出來(lái)，為了避免這種情況發(fā)生，本次實(shí)驗(yàn)選擇了2 種樣品水解液進(jìn)行多糖組成成分分析，最終確定蛞蝓多糖主要由半乳糖和葡萄糖組成。紅外光譜技術(shù)在中藥的鑒別中非常重要，本研究通過(guò)傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)，證實(shí)提取物質(zhì)含有吡喃環(huán)型糖苷鍵和酰胺鍵的酸性多糖。在測(cè)定多糖含量前期，已經(jīng)對(duì)6%苯酚的用量，硫酸的用量，反應(yīng)溫度，顯色時(shí)間進(jìn)行考察，最終得出6%苯酚用量為1 mL，濃硫酸用量為5 mL，顯色時(shí)間為15 min，顯色溫度為100 ℃為最佳反應(yīng)條件。選擇苯酚—硫酸法測(cè)定蛞蝓多糖含量，因?yàn)樵摲ê?jiǎn)便，且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

本研究先用觀察法、HE 染色法對(duì)蛞蝓藥材進(jìn)行鑒別，再用molish 反應(yīng)、斐林反應(yīng)、薄層色譜法，傅里葉變換紅外光譜法和苯酚—硫酸法對(duì)蛞蝓多糖進(jìn)行鑒別、組成、結(jié)構(gòu)和含量測(cè)定，可為將來(lái)研究蛞蝓多糖的結(jié)構(gòu)以及藥理作用提供參考。