劉 智，王曉紅，于曉松，賈 娜，李 林，田宇航，張明生

(貴州大學生命科學學院，山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴陽 550025)

半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit.]為天南星科(Araceae)半夏屬(PinelliaTen.)多年生宿根草本植物，以干燥塊莖入藥，味辛、性溫、有毒，歸脾、胃、肺經，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結等功效[1]。用于濕痰寒痰，咳喘痰多，痰飲眩悸，風痰眩暈，痰厥頭痛，嘔吐反胃，胸脘痞悶，梅核氣，外治癰腫痰核[2]。藥理學研究表明，半夏具有止咳平喘、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜止嘔等作用[3-5]。半夏主要生長于溪邊、田野、林下和陰濕山坡，在我國海拔2 500 m以下的大部分地區(qū)均能生長[6]。

半夏為我國常用大宗中藥材，已有2 000多年的藥用歷史，在200多種中成藥中都是不可或缺的成分，市場需求量極大[7]。近年來，半夏產業(yè)面臨種質資源保護力度不夠、種質資源流失、栽培用種成本高、人工投入大等問題[8-9]。尤其是突破半夏人工種子技術將是解決半夏種子產業(yè)化的一個新的有效途徑[10-11]，而人工種子生產至關重要的一步就是利用組織與細胞培養(yǎng)獲得可供包埋的懸浮培養(yǎng)物[12]。關于半夏懸浮培養(yǎng)物的研究中，吳愛民等[13]最早以掌葉半夏為材料，經過誘導振蕩培養(yǎng)產生大量的體細胞胚；羅成科等[14]研究了懸浮培養(yǎng)過程中體細胞胚的發(fā)生及植株的再生，觀察到球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚等不同的胚狀體發(fā)育形態(tài)；毛春娜等[15]以三葉半夏疏松愈傷組織為材料，研究低溫處理對半夏懸浮培養(yǎng)細胞同步化的影響，表明低溫處理可以明顯影響半夏懸浮培養(yǎng)細胞的同步化，初步探明了半夏組織與細胞培養(yǎng)所需條件。大量研究發(fā)現(xiàn)，在植物組織與細胞培養(yǎng)過程中體細胞無性系變異是普遍存在的現(xiàn)象[16]，目前僅胡鵬[17]使用RAPD標記技術驗證了在珍珠半夏試管苗15代以內DNA分子上沒有發(fā)生變異，而關于半夏體細胞無性系變異的其他相關研究未見報道。

本研究通過探索不同因素對半夏組織培養(yǎng)各階段的影響，以優(yōu)化建立其疏松愈傷組織誘導條件及游離塊莖懸浮培養(yǎng)體系，并采用SSR標記技術鑒定組培游離塊莖體細胞無性系的遺傳穩(wěn)定性，進而為半夏人工種子技術、良種選育與保存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用半夏由貴州省赫章縣半夏種植基地提供。

1.2 實驗方法

1.2.1愈傷組織誘導

將半夏植株置于流水沖洗3 h后轉移至超凈工作臺，依次經過以下消毒程序：無菌水沖洗4～5次，75%酒精浸泡35 s，無菌水沖洗4～5次，0.1%升汞浸泡10 min，無菌水沖洗4～5次。將半夏葉柄剪切成0.5～1.0 cm小段，接種于MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+0.6%瓊脂的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，30 d左右形成大量愈傷組織。

1.2.2愈傷組織繼代獲得疏松愈傷組織

以半夏愈傷組織為材料，以MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的蔗糖(20、30、40 g·L-1)、2,4-D (1.0、2.0、4.0 mg·L-1)和6-BA (0.5、1.0、2.0 mg·L-1)進行L9(33)正交試驗，篩選愈傷組織增殖的適宜培養(yǎng)基，以此培養(yǎng)基繼代愈傷組織3～4次，每次繼代間隔15～20 d，獲得疏松愈傷組織。

1.2.3半夏游離塊莖分化

將疏松愈傷組織接種到MS液體培養(yǎng)基中，在懸浮培養(yǎng)體系中分別設置不同激素，包括細胞分裂素類(6-BA、KT、ZT、TDZ)和生長素類(2,4-D、NAA、IAA、IBA)，每個激素均設4個濃度梯度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1)共32個處理，每個處理重復4次，統(tǒng)計分化率，得到適宜半夏塊莖分化的細胞分裂素和生長素。在單因素試驗的基礎上，添加不同濃度的蔗糖(10、20、30 g·L-1)、6-BA (0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和IBA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)進行三因素三水平的正交試驗，優(yōu)化半夏塊莖分化的懸浮培養(yǎng)條件。將疏松愈傷組織用優(yōu)化后的分化培養(yǎng)基繼代4～5次，每次繼代間隔15～20 d，最終得到半夏游離塊莖。懸浮培養(yǎng)在恒溫旋轉式搖床上進行，光照強度2 000 lx，光照時間12 h·d-1，溫度25 ℃，搖床轉速90 r·min-1。

1.2.4DNA提取和質量檢測

以誘導獲得的半夏游離塊莖為材料，用北京天根公司植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP 350)提取半夏基因組DNA，具體操作步驟參照說明書，提取好的基因組DNA用超微量分光光度計檢測其純度。

1.2.5SSR-PCR擴增

PCR擴增反應在A 300基因擴增儀中進行，用于檢測的隨機引物16對，擴增反應體系為：Taq Master Mix 12.5 μL、SSR引物2.0 μL、DNA模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。將反應溶液充分混勻，進行PCR擴增，SSR-PCR擴增反應程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，Tm±5 ℃(Tm據(jù)引物而定)退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。擴增完成后，取4.0 μL擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，放置在紫外凝膠成像分析儀觀察并拍照。SSR引物均由上海生工公司合成(表1)。

注：A為以葉柄誘導的愈傷組織；B為愈傷組織第1次繼代；C為繼代3次后得到的疏松愈傷組織。圖1 半夏疏松愈傷組織誘導過程Fig.1 Induction process of loose P. ternata callus

1.2.6數(shù)據(jù)處理

應用Microsoft Excel 2019、Minitab 16、SPSS 21.0、Origin 2018等軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 半夏疏松愈傷組織誘導的影響因素

以半夏葉柄為外植體誘導愈傷組織接種20 d后，漸漸出現(xiàn)淡黃或透明的愈傷組織并緩慢增殖(圖1 A)，將愈傷組織切下接種于愈傷組織繼代培養(yǎng)基中進行第1次繼代培養(yǎng)，得到的愈傷組織較為緊密且呈淡黃色(圖1 B)；繼代培養(yǎng)2～3次后，產生大量淡黃、易碎的疏松愈傷組織(圖1 C)。在半夏疏松愈傷組織誘導的正交試驗中，當蔗糖濃度一定時，隨著2,4-D濃度升高，愈傷增殖倍數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且在全部的處理中，愈傷增殖倍數(shù)也是隨著2,4-D濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，其中在2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時達到最高(表2)；8號處理的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，但從極差分析的結果來看，半夏愈傷組織增殖培養(yǎng)基的適宜組合應是A2B2C1：MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+0.6%瓊脂，經過后續(xù)驗證試驗，結果顯示愈傷增殖倍數(shù)達286.7%，顯著高于正交表中的9種培養(yǎng)基，為半夏愈傷繼代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基(表3)。方差分析結果表明，2,4-D對半夏愈傷組織增殖倍數(shù)的影響達到顯著水平，而蔗糖濃度與6-BA對愈傷組織增殖倍數(shù)的影響不顯著(表4)。

表2 半夏疏松愈傷組織繼代正交設計統(tǒng)計Table 2 Orthogonal design and statistics of subculture of loose P. ternata callus

表3 驗證試驗統(tǒng)計結果Table 3 Verification of test statistical results

表4 半夏愈傷組織增殖倍數(shù)方差分析Table 4 Variance analysis of callus multiplication of P. ternata

2.2 半夏懸浮培養(yǎng)塊莖分化的影響因素

以半夏疏松愈傷組織為材料進行懸浮培養(yǎng)，可見6-BA對半夏塊莖的分化率明顯高于其他激素細胞分裂素，分化率呈先升高后降低的趨勢，并在濃度為2.0 mg·L-1時達到最高(圖2 A)。在生長素中，IBA對半夏塊莖的分化率明顯高于其他激素，分化率也呈先升高后降低的趨勢，并在濃度為2.0 mg·L-1時達到最高(圖2 B)。在半夏塊莖分化的正交試驗中，極差分析顯示，3種影響因素對半夏塊莖分化率的主次順序為：6-BA>蔗糖>IBA(表5)；4號處理的塊莖分化率最高，但從極差分析的結果來看，半夏塊莖分化的適宜組合應是A2B1C1：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，經過后續(xù)驗證試驗，結果顯示，塊莖分化率達78.4%，顯著高于正交表中的9種培養(yǎng)基，為半夏游離塊莖分化的最適培養(yǎng)基(表6)。方差分析表明，6-BA對半夏塊莖分化率的影響達到顯著水平，而蔗糖濃度與IBA對塊莖分化率的影響不顯著(表7)。在對半夏塊莖的誘導中，疏松愈傷組織經液體培養(yǎng)基初代培養(yǎng)后，其細胞團可形成分散性良好的懸浮細胞系，呈乳白色(圖3 A)。第一次繼代，細胞團明顯變大，顏色呈淡黃色(圖3 B)；第二次繼代，部分細胞團開始分化，形狀近似圓球形，顏色偏嫩綠色(圖3 C)；第三次繼代，越來越多細胞團分化，部分細胞呈綠色，大部分細胞團近似圓球狀(圖3 D)；第四次繼代，細胞團有大有小，部分細胞團形狀變得不規(guī)則，顏色加深，整體呈綠色(圖3 E)；第五次繼代，形成大小不一的綠色游離塊莖(圖3 F)。

圖2 不同外源激素濃度對半夏塊莖分化率的影響Fig.2 Effects of exogenous hormones with concentration on tuber differentiation rate of P. ternata

表5 半夏游離塊莖分化正交設計統(tǒng)計Table 5 Orthogonal design and statistics of free tuber differentiation of P. ternata

注：A為疏松愈傷組織初代培養(yǎng)；B～F為第1～5次繼代培養(yǎng)。圖3 半夏疏松愈傷組織懸浮培養(yǎng)誘導游離塊莖過程Fig. 3 Induction process of free tuber from loose P. ternata callus by suspension culture

表6 驗證試驗統(tǒng)計結果Table 6 Verification of test statistical results

表7 半夏游離塊莖分化率方差分析Table 7 Variance analysis of free tuber differentiation rate of P. ternata

2.3 半夏親本和游離塊莖的SSR分析

將提取的半夏基因組DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和純度，DNA完整度較好且純度高，質量穩(wěn)定，降解少，一致性高，可作為SSR-PCR擴增反應的DNA模板。

16對SSR引物共擴增出9條穩(wěn)定性好、DNA長度在100～2 000 bp之間的清晰譜帶，因此篩選到9對引物可作為后續(xù)實驗PCR擴增引物(圖4)。用該9對引物對種植基地采集的半夏植株和組織培養(yǎng)獲得的半夏游離塊莖DNA進行SSR鑒定。結果表明，供試引物共擴增出18條清晰譜帶，親本與游離塊莖的18條帶全部為單態(tài)帶，沒有條帶顯示多態(tài)性，變異率為0(圖5)，表明半夏組培游離塊莖未發(fā)生體細胞無性系變異，可作為規(guī)?；N植的繁殖材料。

注：M為分子量標記；1481～90083為SSR引物編號。圖4 半夏游離塊莖SSR引物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.4 Detection of free P. ternata tubers based on agarose gel electrophoresis by SSR primer

注：M為分子量標記；9821～10241為SSR引物編號；a為半夏母株，b為半夏游離塊莖。圖5 半夏母株與游離塊莖遺傳變異SSR-PCR檢測Fig.5 Genetic variation detection of P. ternata mother plant and free tuber by SSR-PCR

3 討 論

愈傷組織是植物離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生過程中的重要組織形式，而來源于不同植物或同一植物不同組織、器官的細胞經過脫分化形成的愈傷組織，在顏色、結構等方面都可能存在差異[18]。根據(jù)愈傷組織的結構特點可以將其分為致密型與松散型，其中松散型愈傷組織是進行懸浮培養(yǎng)的良好材料，稍經機械振蕩就能在液體培養(yǎng)基中形成大小均一的單細胞或微細胞團[19-20]。因此，進行懸浮培養(yǎng)誘導獲得松散型愈傷組織就顯得尤為重要。在誘導松散型愈傷組織過程中，植物生長調節(jié)劑發(fā)揮著極其重要的作用，其中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分化和脫分化的關鍵物質[21]。本研究通過L9(33)正交試驗，探索蔗糖、2,4-D和6-BA濃度對半夏愈傷組織繼代的影響，結果表明，2,4-D對半夏愈傷組織增殖倍數(shù)的影響顯著，愈傷增殖倍數(shù)隨著2,4-D濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，其中愈傷組織增殖倍數(shù)在2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時達到最高，而蔗糖濃度與6-BA對愈傷組織增殖倍數(shù)的影響不顯著。2,4-D被廣泛用于誘導體細胞胚發(fā)生，并對胚性愈傷組織的產生十分重要；6-BA則與2,4-D共同作用促使半夏愈傷組織增殖，而蔗糖主要是作為能源物質并起到調節(jié)滲透壓的作用。本實驗通過對上述物質的篩選、優(yōu)化，明確了半夏疏松愈傷組織形成的適宜繼代培養(yǎng)條件。

在藥用植物中利用懸浮培養(yǎng)主要是為了獲得次生代謝物質和懸浮培養(yǎng)物[22]，本研究則是為了獲得半夏游離塊莖，為此需要讓疏松愈傷組織在液體培養(yǎng)基中分化形成胚狀體直到形成游離塊莖，而植物激素在細胞分化和形態(tài)建成中起著關鍵作用[23-25]。細胞分裂素促進細胞分裂，影響分化方向，生長素則影響細胞壁強度并促進細胞伸長，二者的不同配比是影響細胞分化的關鍵，而不同的材料因其自身內源激素水平不同，對外源激素的配比要求也不相同[26-28]。本實驗設計了細胞分裂素類和生長素類及其濃度梯度的試驗，并篩選出適于細胞分化的生長調節(jié)物質(6-BA和IBA)，再以此進行正交試驗，探究蔗糖、6-BA和IBA濃度對細胞分化的影響，明確了適宜半夏游離塊莖分化形成的培養(yǎng)條件，其中6-BA對半夏游離塊莖分化率的影響明顯，而蔗糖濃度與IBA不顯著。

在植物細胞與組織培養(yǎng)過程中，利用植物離體器官、組織和細胞進行培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)細胞和再生植株極易受到非生物因子的影響，而發(fā)生體細胞無性系變異[29-30]。體細胞無性系變異普遍存在于植物細胞與組織培養(yǎng)的各個階段，可能會導致組培材料品種優(yōu)良性質丟失，也可能產生新的種質，因此對培養(yǎng)材料進行體細胞無性系變異的檢測顯得尤為重要[31-34]。本研究通過SSR標記將種植基地半夏植株和組織培養(yǎng)形成的半夏游離塊莖對比分析，結果表明，半夏組培游離塊莖與其天然母株DNA一致，未發(fā)生體細胞無性系變異，即該技術可用于半夏種質的離體保存與良種繁育。

4 結 論

半夏愈傷組織繼代形成疏松愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+0.6%瓊脂，利用該培養(yǎng)基可獲得大量松散性好、均一性高、增殖再生能力強、適用于建立半夏游離塊莖懸浮體系的半夏疏松愈傷組織；適于半夏疏松愈傷組織分化形成游離塊莖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，得到的游離塊莖可用于半夏人工種子制作或直接播種；SSR標記結果表明，組培形成的半夏游離塊莖保持其天然母株的遺傳特性。