何婷婷，劉 達，柴軍紅

(牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157000)

石斛屬 (DendrobiumSw.)是蘭科(Orchidaceae)第二大屬，全球有1 500～1 600個原生種，中國有74種2變種，主要分布于西南和華南地區(qū)[1]，以云南南部為主。 該屬包含13個組，其中多個種的新鮮或干燥莖可被用于入藥，統(tǒng)稱為“石斛”。石斛(D.nobile)作為常用的道地藥材，在中成藥中具有重要地位，其內(nèi)含的多種活性成分，如石斛多酚等，具有抗氧化、滋陰清肺，生津止渴，養(yǎng)胃除煩等功效[2]。由于石斛的藥用價值不斷被挖掘，使得其活性相關研究日益增多。研究發(fā)現(xiàn)，石斛的品質(zhì)除了取決于多糖類[3]和石斛堿類[4]的種類和含量外，還取決于其他類生物堿[5]。此外，石斛也是重要的花卉植物，與卡特蘭、蝴蝶蘭、萬代蘭同被譽為“四大名蘭”[6]。

ITS基因是細胞核內(nèi)非編碼區(qū)基因，包含ITS 1、5.8 s和ITS 2三部分。由于其進化速度快，核苷酸序列具有高度變異性及長度上的保守性，可以提供豐富的變異位點和信息位點[7-8]，所以，近年來在科內(nèi)、屬間及種間的親緣關系鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關系及遺傳多樣性的研究應用較多[9-10]。目前，ITS基因在多物種中作為條形碼被應用，但在石斛屬中卻未有研究報道。

本實驗利用Genbank中已有的石斛屬植物的ITS序列進行遺傳多樣性的研究，從分子角度確認種間親緣關系，可填補國內(nèi)對于石斛屬分子地位研究的空白，也可為藥用植物市場上石斛品種的鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料共包括石斛屬(DendrobiumSw.)75個種和外類群厚唇蘭屬(EpigeneiumGagnep)1個種。詳情見表1。

1.2 序列來源

所需序列來自于NCBI。登錄NCBI，搜索“Dendrobium+ITS”，保存為“.txt”格式。然后利用在線軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)對序列進行比對，最后根據(jù)比對結(jié)果刪除冗余序列，再次保存。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用ClustalX 1.83軟件對FASTA格式文件進行序列對比，并且保存為.aln格式。然后再利用MEGA 4轉(zhuǎn)化為.meg格式，最后利用該格式文件進行遺傳距離的計算及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛種間序列分析

根據(jù)核苷酸序列比對結(jié)果構(gòu)建圖1和圖3。發(fā)現(xiàn)75個石斛種中，共有顛換位點1 746個，其中劍葉石斛的顛換位點最多，為53個，分別位于28 bp、82 bp、101 bp、423 bp、538 bp等處，占總比的3%；變異位點最少的為晶帽石斛，為3個，分別出現(xiàn)在17 bp、105 bp、200 bp處,占總比的0.2%。

由圖1可以看出，發(fā)生T-A的顛換最多，為403個，其中發(fā)生顛換位點最多的劍葉石斛，T-A顛換所占比例最高，為3.2%，顛換位點最少的晶帽石斛占總顛換個數(shù)的0.4%。發(fā)生C-G的顛換最少，為101個，其中劍葉石斛僅發(fā)生了1個顛換位點，位于221 bp。

轉(zhuǎn)換位點共出現(xiàn)2 529個，藏南石斛的變異位點數(shù)目最多(65個)，占2.6%；黃花石斛的變異位點最少(17個)，分別出現(xiàn)在85 bp、95 bp、166 bp等處，占0.7%。

圖2顯示，C-T轉(zhuǎn)換位點最多，為869個，占34.4%。其中，藏南石斛發(fā)生轉(zhuǎn)換的位點最多，為25個，分布于36 bp、56 bp、62 bp等；喉紅石斛最少，為6個。G-A轉(zhuǎn)換最少，為475個，其中小雙花石斛最多，占總數(shù)的4.8%，兜唇石斛、束花石斛、齒瓣石斛等4種石斛發(fā)生G-A轉(zhuǎn)換最少，均為2個。

圖2 ITS發(fā)生轉(zhuǎn)換位點數(shù)量Fig.2 Number of ITS sites occurred transition

2.2 種間遺傳距離分析

利用MEGA 4對序列進行分析，結(jié)果表明，75個石斛種間遺傳距離在0～0.295之間。其中矮石斛與喉紅石斛的遺傳距離為0，但與其他石斛屬植物的遺傳距離均較遠，在0.076～0.22之間，與藏南石斛的遺傳距離最大，為0.22。晶帽石斛和鼓槌石斛的遺傳距離為0，但和其他石斛屬植物的遺傳距離較遠，其中與單葶草石斛的遺傳距離最遠為0.228。球花石斛和密花石斛的遺傳距離為0，但與其他石斛屬植物差距較大，遺傳距離范圍在0.088～0.217之間。翅萼石斛與黑毛石斛的遺傳距離為0，與其他石斛屬植物的遺傳距離在0.02～0.22之間波動。少花石斛與海南石斛的遺傳距離為0，與其他石斛屬植物的遺傳距離范圍在0.06～0.28之間。草石斛和玫瑰石斛的遺傳距離最大，為0.295。

將圖3的遺傳距離進行統(tǒng)計，并人為分為15個范圍，統(tǒng)計每個遺傳距離范圍內(nèi)的個數(shù)。結(jié)果表明，遺傳距離在各個范圍內(nèi)呈先升高后降低的趨勢，且出現(xiàn)了2個峰值，一個是0.141～0.16范圍內(nèi)，遺傳距離個數(shù)最多，達469個，占總數(shù)的16.5%；其次是0.121～0.14，為445個(15.6%)。個數(shù)最少的遺傳距離范圍是0.281～0.3，為4個(0.1%)(圖3)。

圖3 遺傳距離的分布范圍Fig.3 Distribution range of genetic distance

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用75個石斛種的序列構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4。除圓柱葉組和草葉組基本可以獨自成枝外，其他組與組之間的分界不太明顯。很多不同組的種在分子鑒定中，聚為一支，說明同源性較高，但形態(tài)學中卻將其分類在不同的組中。例如：5號鉤狀石斛、6號重唇石斛均隸屬于瘦軸組(形態(tài)分類)，但圖4中卻與石斛組的多個種聚為一支，其中6號重唇石斛和45號石斛間的遺傳距離僅為0.002。外類群76號厚唇蘭與禾葉組的雙花石斛和小雙花石斛聚為一支，遺傳距離也僅有0.11，說明該外類群沒有較好地將不同的屬分開，該基因不適用于這兩個屬的鑒別。

圖4 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequence

3 討 論

石斛作為重要的中藥材，在中醫(yī)中應用廣泛，對于陰傷津虧、食少干嘔、目暗不明等癥狀均有療效。在道地藥材中，石斛主要是指石斛(D.nobile)、鐵皮石斛(D.officinale)的莖枝，統(tǒng)稱為“石斛”。目前對于石斛的研究多集中在其植株的繁殖[11-12]、活性成分的研究[13]及功能成分的分離鑒定[14]等方面。但由于石斛種類繁多，市面價格昂貴，所以對于石斛不同種的系統(tǒng)地位及其關系的研究就尤為重要，中國植物志中，石斛的系統(tǒng)地位是利用形態(tài)特征(比如根莖葉的特點)來進行分類，將石斛屬分為不同組，進而確認種與種之間的親緣關系遠近，但該分類標準具有一定的主觀性，故本研究利用分子標記輔助選擇技術確定石斛的種間親緣關系，結(jié)果與形態(tài)結(jié)果比較差異性較大，多個組內(nèi)的不同種混合在一起，不能很好地區(qū)分，外類群也與該屬植物混為一支，未達到理想的分類目的。推測可能是石斛栽培品種較多，且繁殖以分枝為主，故而導致多個種的起源相同，分析檢測中核苷酸的差異性小，同源性高，分類結(jié)果不明顯。

另一方面，導致本研究結(jié)果不理想的原因可能是基因的選擇。ITS為細胞核基因，處于核內(nèi)非轉(zhuǎn)錄區(qū)，無法編碼基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯。隨著該基因出現(xiàn)在大眾視野以來，迅速占領了分子標記輔助選擇技術的核心地位，究其原因，是因為該基因的序列較短，擴增重現(xiàn)性好，成本低。正因如此，越來越多的學者將ITS作為區(qū)分屬內(nèi)、屬間或種間系統(tǒng)地位和種間親緣關系的標記之一。目前，該基因已被廣泛應用于動植物和微生物的多個研究領域，對于中藥材的鑒別，新物種的認定，微生物群體的識別等新興研究方向提供了便利。在大多數(shù)研究中，ITS基因均可很好的區(qū)分研究樣本，對于研究結(jié)果較為模糊的實驗，可利用其他標記進行研究。本研究后續(xù)會再利用其他基因標記，比如葉綠體基因，線粒體基因等具有一定變異性的標記進行樣本間的系統(tǒng)發(fā)育關系研究。