楊 卓，楊曉杰，付學(xué)鵬

(1.齊齊哈爾市藥品檢驗(yàn)中心，黑龍江 齊齊哈爾 1610001；2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蘆葦屬(Phragmites)植物是禾本科多年生草本植物，是濕地廣泛分布的重要物種。蘆葦濕地在抵御洪水、調(diào)節(jié)徑流、防風(fēng)固沙、凈化水質(zhì)及維持物種多樣性等方面具有很高的生態(tài)價值[1-2]。在世界范圍內(nèi)蘆葦有10個種，中國有3個種，即卡開葦[P.karka(Retz.) Trin. ex Steud](大蘆)、日本葦(P.japonicaSteud.)和普通蘆葦[P.australis(Cav.) Trin. ex Steud.][3]，普通蘆葦適應(yīng)性廣，在淡水、輕鹽性、堿性的濕地及干旱沙丘中均有分布。在長期的演化過程中，蘆葦為了適應(yīng)不同的生境，變異成不同的生態(tài)型，且不同生態(tài)型蘆葦在形態(tài)、生理等方面的特征均表現(xiàn)出較大的差異。黑龍江省地處我國東北部，濕地蘆葦資源主要分布在松嫩平原、興凱湖平原、三江平原等低濕積水地帶[4]。大面積的蘆葦濕地現(xiàn)主要分布在扎龍自然保護(hù)區(qū)、三江自然保護(hù)區(qū)、洪河自然保護(hù)區(qū)、七星河自然保護(hù)區(qū)、興凱湖自然保護(hù)區(qū)等地。

對蘆葦?shù)难芯枯^多，如蘆葦對水、鹽及重金屬的響應(yīng)[5-9]、蘆葦群落退化[10]及UV-B輻射對蘆葦?shù)挠绊慬5-8]等。筆者在扎龍濕地自然保護(hù)區(qū)前期的考察研究中發(fā)現(xiàn)，同一生境中存在兩種不同表型蘆葦，其中一種是常見的普通蘆葦(P.australis)，另一種莖稈的分節(jié)處顏色為棕紅色，區(qū)別于普通蘆葦?shù)木G色，當(dāng)?shù)厝朔Q之為“鐵稈蘆葦”，這兩種不同表型蘆葦在形態(tài)、經(jīng)濟(jì)價值等方面的差異較大。前人對蘆葦?shù)纳鷳B(tài)型及形態(tài)變異的研究多為分布在不同生境中的蘆葦[7,9]，為探明普通蘆葦和“鐵稈蘆葦”兩型蘆葦?shù)姆肿踊A(chǔ)差異，本試驗(yàn)對分布在扎龍濕地10個不同居群兩型蘆葦?shù)腎TS序列差異進(jìn)行分析，擬闡明普通蘆葦與鐵稈蘆葦?shù)腎TS序列差異，為挖掘扎龍濕地優(yōu)異的蘆葦資源及探討蘆葦?shù)姆N內(nèi)關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 取 材

在扎龍濕地自然保護(hù)區(qū)選擇10個不同居群的蘆葦，其中居群4、8為鐵稈蘆葦，其余居群為普通蘆葦。在2016年5月，取蘆葦幼嫩的莖尖部分，置于冰袋盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室用液氮處理后放置在-80 ℃冰箱中保存，用于DNA的提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取

用DNA試劑盒(上海生工SK 8224)常規(guī)方法提取蘆葦莖尖DNA。

1.2.2PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI查找普通蘆葦?shù)腎TS序列AF 019810作為蘆葦ITS序列的PCR擴(kuò)增引物。引物序列為ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′、TTS 5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

1.2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板，正反向引物各0.5 μL，0.5 μL dNTP，0.2 μLTaq酶，2.5 μLTaqBuffer，19.8 μL水。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共計(jì)35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

1.2.4序列分析

將測得的序列用DNASTAR和MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹及遺傳距離的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

扎龍濕地10個不同居群蘆葦PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

圖1 扎龍濕地10個不同居群蘆葦?shù)腜CR電泳圖Fig.1 PCR electrophoretic of 10 different populations of P. australis in Zhalong wetland

2.2 ITS序列堿基含量

扎龍濕地10個不同居群蘆葦ITS序列堿基含量見表1，圖2。

表1 扎龍濕地10個不同居群蘆葦ITS序列長度及G+C含量Table 1 ITS sequence length and G+C content in 10 populations of P. australis in Zhalong wetland

由圖2可知，A堿基含量在1、2、3、5、6、7、9、10居群中相近，在17.0%～17.8%之間，富含A/T；在居群4和居群8中A堿基含量為12.3%，A/T含量較少；顯示鐵稈蘆葦與普通蘆葦?shù)膲A基含量具有明顯差異。10個不同居群蘆葦中，ITS序列長度在648～685 bp之間，存在一定的保守性，不同居群間存在一定的差異，見表1。

圖2 扎龍濕地10個不同居群蘆葦ITS序列堿基含量Fig.2 Base contents of ITS sequences in 10 populations of P. australis in Zhalong wetland

蘆葦10個不同居群中，G+C含量最高的是居群5，為71.1%；最低的為居群10，為69.2%。兩型蘆葦?shù)腉+C含量范圍在69.2%～71.1%之間，其中鐵稈蘆葦與普通蘆葦間的G+C含量差異不大。

2.3 ITS序列遺傳距離及變異位點(diǎn)分析

扎龍濕地10個不同群居蘆葦ITS序列遺傳距離見表2。

表2 扎龍濕地10個不同居群蘆葦ITS序列遺傳距離Table 2 Genetic distances of ITS sequences in 10 populations of P. australis in Zhalong wetland

10個不同居群蘆葦?shù)钠骄z傳距離為0.302 6，兩型蘆葦遺傳距離0.905 7～0.909 0。普通蘆葦與鐵稈蘆葦之間遺傳距離較遠(yuǎn)，同型蘆葦之間遺傳距離差異不明顯。

扎龍濕地10個不同群居蘆葦ITS序列位點(diǎn)差異見表3。

表3 扎龍濕地10個不同居群蘆葦ITS序列位點(diǎn)差異Table 3 Differences of ITS sequence loci among 10 populations of P. australis in Zhalong wetland

通過MEGA軟件內(nèi)變異位點(diǎn)的分析，比對序列全長704 bp，鐵稈蘆葦居群較普通蘆葦居群存在287～290個變異位點(diǎn)，所研究居群普通蘆葦只存在3個變異位點(diǎn)，序列較為保守；鐵稈蘆葦與普通蘆葦相比變異較大。

2.4 發(fā)育系統(tǒng)樹構(gòu)建

扎龍濕地10個不同群居蘆葦系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建見圖3、圖4。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育MP樹Table 3 Phylogenetic MP tree based on ITS sequence

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹Table 4 Phylogenetic NJ tree based on ITS sequence

由圖3、圖4可知，10個不同居群的蘆葦ITS序列構(gòu)建的MP樹和NJ樹結(jié)果一致，居群 4與居群8屬于同一支，屬鐵稈蘆葦，居群1、2、3、5、6、7、9、10屬于同一支，屬普通蘆葦。

3 結(jié)論與討論

ITS序列是5.8～28 s rDNA的一段介于600～800 bp之間的序列，這段序列承受壓力很小，同時包含保守和變異位點(diǎn)，在屬內(nèi)相近的種甚至種內(nèi)都可以鑒別出差別，并且植物、真菌等的親緣關(guān)系、分類鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用[10-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鐵稈蘆葦較普通蘆葦堿基含量差異較大，兩型蘆葦?shù)腉+C含量范圍在69.2%～71.1%之間，都屬于較高水平，表明所測定的蘆葦DNA密度高且遺傳信息穩(wěn)定。通過變異位點(diǎn)的分析，比對序列全長704 bp，鐵稈蘆葦居群存在287～290個變異位點(diǎn)，普通蘆葦居群只存在3個變異位點(diǎn)，序列較為保守；通過發(fā)育系統(tǒng)樹的構(gòu)建之后分析其親緣關(guān)系，可以看出居群4與居群8同屬鐵稈蘆葦同一支，居群 1、2、3、5、6、7、9、10同屬普通蘆葦，所構(gòu)建的MP樹和NJ樹結(jié)果一致。Lele等[16]研究證明，表觀遺傳變異與遺傳變異的相互關(guān)聯(lián)有關(guān)，由序列分析及系統(tǒng)樹的構(gòu)建可見兩種不同表現(xiàn)型的蘆葦其遺傳信息有所差別且遺傳距離較遠(yuǎn)，證明蘆葦居群在相似的生境下既保持著遺傳信息的相對穩(wěn)定性，又通過發(fā)生基因的變異而演化出了新的生態(tài)型。目前尚未有學(xué)者對鐵稈蘆葦進(jìn)行過相關(guān)研究，綜上分析可知，鐵稈蘆葦與普通蘆葦存在較大遺傳差異，結(jié)合之前測定形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化指標(biāo)的差異分析，發(fā)現(xiàn)鐵稈蘆葦在纖維特性上更優(yōu)于普通蘆葦，可以作為優(yōu)質(zhì)的造紙資源加以利用，對于改良蘆葦種質(zhì)資源結(jié)構(gòu)，提高蘆葦對環(huán)境的適應(yīng)性更為有利。