辛 慧,唐 余,金燕紅,余 從,黃奉善,潘有福

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

腎癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生占全部腫瘤的3%～5%，且呈逐年增長的趨勢。2015年中國腎癌約占所有新發(fā)癌癥病例的1.5%，死亡率約為35%。腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占腎癌90%以上，而透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是RCC的最主要類型,有很強的轉(zhuǎn)移性、異質(zhì)性，預(yù)后較差，對化療不敏感，容易產(chǎn)生抗藥性[1-4]。早期發(fā)現(xiàn)的原位RCC可以通過部分或根治性腎切除手術(shù)治療，但是由于三分之一的患者行部分病灶切除后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而轉(zhuǎn)移患者的中位生存率為9～13個月[5-7]，所以探尋更有效的RCC治療方法如基因靶向治療，一直是研究的熱點和難點[8-9]。

我們通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)， ccRCC中LMNA及其家族成員的拷貝數(shù)變異達14%，且多數(shù)為擴增，這提示LMNA可能與ccRCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Lamin A/C由LMNA基因編碼，是V型中間纖維，是核纖層蛋白質(zhì)主要成分，可在核膜內(nèi)側(cè)與其他核纖層成分形成絲狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即核纖層結(jié)構(gòu)。Lamin A/C不僅參與核膜正常結(jié)構(gòu)和功能的維持，還參與染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的組織和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]。

近年來研究表明，lamin A/C不僅在核纖層病中扮演著關(guān)鍵角色[11-12]，也在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著作用。如Lamin A/C在一些肺癌細胞及小細胞肺癌(small cell lung carcinoma，SCLC)中高表達，并被認為是早期肺癌檢測的生物標志[13-14]。在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)中，表達lamin A/C的結(jié)直腸癌患者與lamin A/C陰性患者相比死亡率要高2倍;由于lamin A/C在結(jié)直腸癌中與高侵襲性表型相關(guān)，可作為分子標記物[15-16]。但是也有相反的報道，如Callinice等人對76例成年婦女宮頸涂片分析，結(jié)果顯示lamin A/C不表達組比lamin A/C正常表達組的HPV感染率明顯要高。lamin A/C不表達組中有20%的女性可觀察到宮頸上皮內(nèi)瘤變，因此認為lamin A/C缺乏可能是宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生的獨立危險因素[17]。研究表明，Lamin A/C作為核纖層的主要組分，不但參與維持細胞核的正常形態(tài)，而且可能通過參與細胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞分化、細胞凋亡等過程影響疾病發(fā)生和進程。其自身及其部分調(diào)控基因，可作為特定癌癥診斷、治療及預(yù)后的重要生物標志物[4]。

鑒于沒有LMNA在RCC中功能的研究，所以我們研究了敲減LMNA對于腎癌細胞生物學(xué)功能的影響，文章正在評審中。同時，目前尚無lamin A/C對腎癌基因表達調(diào)控方面的報道，所以本研究通過對786-O細胞敲減LMNA后的基因表達譜分析,以期了解LMNA對ccRCC細胞中基因表達調(diào)控的影響以及擾動的主要信號通路，為可能的臨床轉(zhuǎn)化、靶向治療提供有價值的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 腎癌細胞786-O購自中國科學(xué)院細胞庫，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。siRNA-mate及LMNA siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。CDNA合成試劑盒Prime Script TM購自Takara。所用實時熒光定量PCR 試劑盒為SensiFAST SYBR(Bioline)或SYBR green Premix Dimer Eraser(TaKaRa)。其他試劑主要購自博趣生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 786-O細胞于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。主要轉(zhuǎn)染步驟如下：細胞經(jīng)胰酶消化接種于六孔板中，每孔6×105個細胞，當(dāng)細胞密度約為60%時進行轉(zhuǎn)染。將8 μL (20 μM)的各個siRNA(siControl,5個不同的siLMNA)分別加入含150 μL Optiμm培養(yǎng)基的無RNA酶管中，室溫靜置5 min；再與57 μL Optiμm培養(yǎng)基(含8 μL siRNA mate)混合，室溫靜置20 min。將上述復(fù)合物分別加入細胞密度合適的六孔板中，每孔含無雙抗無血清的培養(yǎng)基1.9 mL。8 h后用含青霉素、鏈霉素及10%血清的完全培養(yǎng)基置換。轉(zhuǎn)染72 h后提取總蛋白，經(jīng)Western Blotting檢測敲減效果。選取其中敲減效果最好且重復(fù)性高的1個siRNA(siLMNA-2)同對照siRNA(siControl)進一步轉(zhuǎn)染786-O細胞，每組3個生物學(xué)重復(fù)。對于差異表達基因(DEGs)的驗其中敲減效果最好的2個siRNA(siLMNA-1 和siLMNA-2)進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 h后提取總RNA進行后續(xù)實驗。

1.2.2 總RNA提取及RNA-Seq實驗 RNA提取采用TRIzol (Invitrogen,CA,USA)，根據(jù)廠商提供的操作方案對總RNA進行分離和純化。然后用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop,Wilmington,DE,USA)對RNA的量與純度進行質(zhì)控。再通過Bioanalyzer 2100(Agilent,CA,USA)對RNA的完整性進行檢測，同時通過瓊脂糖電泳進行驗證。所有樣品的濃度>50 ng/μL，RIN值>7.0，OD260/280>1.8，total RNA>1 μg，可滿足下游實驗。

使用oligo(dT)磁珠[(Dynabeads Oligo (dT),Thermo Fisher,USA)]通過兩輪的純化對mRNA進行特異性捕獲。將捕獲到的mRNA在高溫條件下利用鎂離子打斷試劑盒(NEBNext? Magnesium RNA Fragmentation Module,USA)進行片段化，94 ℃ 5～7 min。將片段化的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen SuperScriptTMII Reverse Transcriptase,CA,USA)合成cDNA。然后使用E.coli DNA polymerase I(NEB,USA),與RNase H(NEB,USA)進行互補鏈合成，在轉(zhuǎn)化成DNA雙鏈同時摻入dUTP (Thermo Fisher,CA,USA)。將雙鏈DNA的末端補齊為平末端，同時在其兩端各加上一個A堿基，使能夠與末端帶有T堿基的接頭進行連接，再利用磁珠對其片段大小進行篩選和純化。經(jīng)過擴增，制備成片段大小為(300±50)bp的文庫。最后，使用Illumina NovaseqTM6000 (LC Bio Technology CO.,Ltd.Hangzhou,China)按照標準操作對其進行雙端測序。

1.2.3 RNA-Seq分析流程 使用cutadapt (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable)軟件對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭處理，然后去除低質(zhì)量序列和重復(fù)序列，再使用HISAT2 (https://daehwankimlab.github.io/hisat2)將得到的數(shù)據(jù)(CleanData)比對到基因組上(Homo sapiens,Ensembl v96)。隨后使用StringTie (http://ccb.jhu.edu/software/stringtie)對基因或轉(zhuǎn)錄本進行初組裝，將所有樣本的初組裝結(jié)果進行合并，并用gffcompare (http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml) 處理得到最終組裝注釋結(jié)果。使用ballgown包進行FPKM定量。使用R包edgeR (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)及DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) 對樣本進行顯著差異分析，將差異倍數(shù)FC>2倍或FC<0.5倍且P<0.05的基因定義為差異基因(DEGs)，并對其進行GO和KEGG富集分析。

1.2.4 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR) 用Trizol試劑(Solarbio)從細胞中分離總RNA。采用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa)進行cDNA合成。以 GAPDH 為內(nèi)參，用SensiFAST SYBR(Biolin) 或SYBR green Premix DimerEraser(TaKaRa)進行熒光定量PCR 驗證。反應(yīng)程序為:95 ℃ 2 min ; 然后 95 ℃ 5 s ，60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,共進行40個循環(huán); 然后65 ℃ 5 s,95 ℃ 5 s,4 ℃ 保溫。對于得到的CT值通過 2-ΔΔCT法計算基因的相對表達水平。所用引物(見表1)。

表1 實驗所用相關(guān)基因引物序列

1.2.5 DEGs的GO和KEGG通路分析 Gene Ontology(GO)為功能富集研究的常用分析方法，可對基因的分子功能( Molecular function，MF) 、細胞組分(Cellular component，CC) 和 生 物 過 程 ( Biological process，BP)3大類進行富集分析。而 KEGG 是了解基因功能和生物系統(tǒng)的實用程序數(shù)據(jù)庫，可對擾動的信號通路進行分析。本研究使用聯(lián)川生物的分析平臺進行基因注釋、GO及 KEGG 通路分析。

1.2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成與主要富集集群分析 將分析得到的89個DEGs，通過 STRING進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks，PPI)構(gòu)成分析。對STRING 軟件(v11.5)分析構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)涉及 的節(jié)點和邊緣進行聚類分析和顯著性分析。

1.2.7 DEGs在臨床樣本中的表達及與OS相關(guān)性分析 對于部分鑒定到的DEGs,利用GEPIA2軟件進行了臨床樣本表達水平的分析(Expression DIY)。 同時也進行了表達水平與病人總生存期(OS)的相關(guān)性分析[18]。

2 結(jié)果

2.1 基因表達文庫的制備及差異表達基因(DEGs)的鑒定 將設(shè)計合成的siRNA轉(zhuǎn)染786-O細胞，其敲減效果如圖1A、B所示。然后選取siLMNA-5(重命名為siLMNA-1)、siLMNA-6(重新命名為siLMNA-2)與siControl進行后續(xù)實驗。重命名的siLMNA-2與siControl用于表達文庫制備。重命名的siLMNA-1、siLMNA-2與siControl用于qRT-PCR驗證。得到測序數(shù)據(jù)后，將獲得的所有基因表達數(shù)據(jù)，經(jīng)過標準化處理后做散點圖，以直觀反映兩樣本間差異表達基因的分布情況(見圖1C)。

A：不同siLMNA敲減效果的Western Bloting檢驗；B：不同siLMNA敲減效果的qRT-PCR檢驗; C:兩組樣本間DEGs的分布情況；橫坐標代表基因在不同樣本中表達的倍數(shù)變化的對數(shù)值(siLMNA/siControl)，縱坐標代表基因表達量變化差異的P值對數(shù)。藍點表示實驗組與對照組相比基因表達顯著上調(diào)，紅點表示基因表達顯著下調(diào)。圖1 siLMNA敲減效果的檢驗及兩組樣本間DEGs的分布情況

我們共鑒定到DEGs89個，其中46個上調(diào)，43個下調(diào)。按照基因表達幅度排序前10位(上調(diào)前5/下調(diào)前5)的基因，包括RPL36A-HNRNPH2，AC245033，AC117378，AC131160，ABCF2，CELF6,PTGES3L-AARSD1,FAM47E-STBD1，PECC1L-ADORA2A，AC006064 (見表2)。

表2 按照基因表達倍數(shù)變化上調(diào)及下調(diào)排序前10位的DEGs

2.2 選取DEGs進行qRT-PCR驗證 用重命名的siLMNA-1、siLMNA-2、siControl轉(zhuǎn)染人腎癌786-O 細胞，提取總RNA，進行cDNA合成，采用qRT-PCR 檢測LMNA敲減后8個DEGs的轉(zhuǎn)錄水平，驗證是否與基因表達譜中變化趨勢一致。最后選取8個基因(UTP14C、FKTN、NUDT16、MSC-AS1、MIEF1、GGT2、SPIN1、ADORA2A) 進行qRT-PCR驗證。

倍數(shù)變化中，正值表示實驗組與對照組相比表達上調(diào)，負值表示實驗組與對照組相比表達下調(diào)。

由圖2可知，兩個針對不同LMNA基因區(qū)域的siRNA敲減效果相當(dāng)。 8個基因的qPCR結(jié)果與RNA-seq中的變化趨勢基本一致，即LMNA敲減可以抑制ADORA2A、NUDT16、GGT2、MSC-AS1基因的表達，而促進FKTN、MIEF1、UTP14C基因的表達。這表明所鑒定的大部分DEGs可能是LMNA的調(diào)控基因，并可用于進一步的分析。

A:對選取的DEGs進行qRT-PCR驗證，敲減組和對照組比較進行差異顯著性分析， * :P<0.05; **:P < 0.01；B:對qRT-PCR結(jié)果和RNA-seq結(jié)果進行比較。 圖2 DEGs的RT-PCR驗證以及與RNA-seq結(jié)果的比較分析

2.3 DEGs的GO富集分析 上述DEGs經(jīng)GO分析，即包括生物學(xué)過程(Biological process)、細胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)三大類基因功能相關(guān)性分析。以參與基因的數(shù)目排序，可見這些DEGs主要參與了翻譯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、精子發(fā)生、多細胞生物發(fā)育、蛋白質(zhì)裂解、細胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子運輸?shù)壬飳W(xué)過程。細胞組分的分析表明這些基因的產(chǎn)物首要分布于細胞核中，其次分布于細胞質(zhì)、生物膜系統(tǒng)及一些細胞器中。而分子功能的分析表明，這些基因的產(chǎn)物主要與蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)，其次與金屬離DNA、RNA等的結(jié)合有關(guān)(見圖3)。

2.4 DEGs的KEGG通路分析 對差異表達的基因進行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)敲減LMNA的人腎癌786-O細胞有27個通路被富集。富集的信號通路包括真核生物的核糖體生物發(fā)生(Ribosome biogenesis in eukaryotes)、?；撬岷偷团；撬岽x(Taurine and hypotaurine metabolism)、核糖體(Ribosome)、蛋白質(zhì)輸出(Protein export)、甘露糖型O-聚糖生物合成(Mannose type O-glycan biosynthesis)等。其中前20位富集的信號通路(見圖4)。

DEGs經(jīng)KEGG通路分析后，以富集分數(shù)和P值排序。紅色顯示富集的通路具有統(tǒng)計學(xué)意義；圓面積越大，表示該富集條目中DEGs的數(shù)目越多。圖4 DEGs的KEGG通路分析散點圖

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 用STRING 軟件對所鑒定的DEGs進行了PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測。其中28個基因產(chǎn)物未能匹配數(shù)據(jù)庫，所以只有57個蛋白質(zhì)用于該分析。獲得的PPI 網(wǎng)絡(luò)共涉及 57個節(jié)點和 15 個邊緣，P=0.003 06(見圖5)。

DEGs經(jīng)STRING 軟件分析構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及57個節(jié)點和15個邊緣，P=0.003 06。 圖5 DEGs構(gòu)建的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)的聚類分析顯示，有7個集群(Cluster)顯著富集，主要是鋅指蛋白參與的功能尚不清楚的集群1、Hsp90 ATPase的激活集群2、肽鏈延伸的集群3等，具體如表3所示。其中參與的主要蛋白質(zhì)有ZNF84、ZNF140、NKTR、SRP9、ADORA2A等。

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)中顯著性富集的集群(Cluster)

2.6LMNA與部分DEGs在ccRCC中的表達及與總生存期(OS)的相關(guān)性 由于LMNA及其家族成員在部分ccRCC患者中有拷貝數(shù)變異，多數(shù)表現(xiàn)為擴增，因此我們預(yù)期敲減LMNA后低表達的DEGs可能在ccRCC患者腫瘤組織中高表達，反之，高表達的DEGs可能在ccRCC患者腫瘤組織中低表達。

利用GEPIA我們分析了LMNA及部分DEGs,包括PPI的節(jié)點分子，在ccRCC腫瘤樣本中的表達水平和患者總生存期的關(guān)系。如圖6所示，LMNA、MSC-AS1在腫瘤樣本中高表達，而MIEF1、UTP14C在腫瘤樣本中低表達，這與基于RNA-seq結(jié)果的預(yù)期一致。但是，這4個基因的低表達都與較差的總生存期相關(guān)。

A：部分選取基因在臨床樣本中的表達分析；樣本數(shù)： Tumor=523,Normal=100；B：部分選取基因表達水平與RCC患者的總生存期分析；樣本數(shù)： Tumor=515(or 516)。圖6 LMNA及其部分調(diào)控基因表達水平對RCC患者總生存率影響分析

3 討論

Lamin A/C是核纖層蛋白質(zhì)主要成分，其結(jié)構(gòu)和表達水平的變化不僅與核纖層病相關(guān)，也與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。ccRCC中l(wèi)amin A/C及其家族成員的拷貝數(shù)擴增，與臨床腫瘤樣本中l(wèi)amin A/C的較高水平相一致。而這些表達水平的變化，又會影響到一些其他下游基因表達水平的變化。

通過分析RNA-seq數(shù)據(jù)，我們共鑒定到敲減LMNA的DEGs89個。 qRT-PCR證實大部分DEGs在敲減LMNA后其表達變化與RNA-seq結(jié)果一致。GO分析表明，這些DEGs主要參與了翻譯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、精子發(fā)生、多細胞生物發(fā)育、蛋白質(zhì)裂解、細胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子運輸?shù)壬飳W(xué)過程。KEGG分析表明，這些DEGs主要參與了真核生物的核糖體生物發(fā)生、核糖體(Ribosome)、蛋白質(zhì)輸出(Protein export)等過程。而PPI 網(wǎng)絡(luò)分析進一步鑒定到這些DEGs不但參與了與肽鏈延伸相關(guān)的蛋白質(zhì)作用，而且還有一些功能尚不清楚的相互作用。 這揭示了LMNA基因不僅參與了維持核纖層的結(jié)構(gòu)和核骨架的功能，而且可能通過形成拓撲結(jié)合域，通過調(diào)控核基因組的三維結(jié)構(gòu)，影響了一些基因的表達，擾動了一些信號通路的活性。

通過分析臨床ccRCC樣本發(fā)現(xiàn)，部分DEGs的表達符合來自786-O細胞RNA-seq結(jié)果的預(yù)期。如在ccRCC樣本中MSC-AS1與LMNA呈正相關(guān)高表達，而MIEF1、UTP14C與LMNA呈負相關(guān)低表達。LMNA在ccRCC臨床樣本中雖有較高的表達，與一些文獻報道一致[19-20]，但是較差的總生存期卻與其較低水平的表達相關(guān)。這提示LMNA對ccRCC發(fā)生發(fā)展的作用及其分子機制的復(fù)雜性。LMNA在ccRCC中的作用，還可能與其調(diào)控的下游基因如MIEF1、UTP14C等密切相關(guān)。

MSC-AS1(Long non-coding RNA musculin antisense RNA 1)編碼一個長鏈非編碼RNA分子，對胰腺癌、肝細胞癌、鼻咽癌和結(jié)直腸癌等的發(fā)生發(fā)展中起著促進作用[21-25]。Hu等在RCC細胞中的研究表明，MSC-AS1通過激活miR-3924介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路，促進RCC細胞增殖和侵襲。我們也發(fā)現(xiàn)MSC-AS1在RCC中顯著上調(diào)，但是關(guān)于其與總生存期的關(guān)系，其低表達與RCC患者預(yù)后不良相關(guān)，這與LMNA的情形一樣。其分子機制還需要進一步研究。

MIEF1(Mitochondrial elongation factor 1)或者MiD51(Mitochondrial dynamic protein of 51 kDa),即線粒體延伸因子1或者線粒體51 kDa動態(tài)蛋白，是一個線粒體外膜蛋白，可以促進線粒體的裂殖，同時在線粒體核糖體生物發(fā)生中發(fā)揮作用[26]。MIEF1除了編碼MIEF1蛋白，其外顯子2還編碼一個70個氨基酸殘基的MIEF1微蛋白(MIEF1 microprotein，MIEF1-MP)。MIEF1-MP[27]。最近Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)MIEF1缺失可維持線粒體膜電位，減少線粒體ROS的過度產(chǎn)生，同時也降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而降低細胞凋亡率并減輕了TNFα誘導(dǎo)的細胞死亡。本實驗中LMNA與MIEF1在ccRCC中的表達呈負相關(guān)，且MIEF1低表達與較差的預(yù)后顯著相關(guān)，提示ccRCC中MIEF1的低表達既可能與異常的線粒體增殖有關(guān)，也可能與降低了活性氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細胞凋亡減少有關(guān)，其實際分子機制還需要進一步的研究。MIEF1的異常表達，也與GO分析中核糖體的生物發(fā)生為被擾動的信號通路相一致，表明核糖體生物發(fā)生與ccRCC密切相關(guān)。

UTP14C(Small subunit processome component homolog C)，被認為是與精子發(fā)生相關(guān)的返座基因(Retrogene)[29]。UTP14C位于第13號染色體上，是X -連鎖管家基因UTP14A的無內(nèi)含子拷貝，其功能不詳。

總之，786-O細胞敲減LMNA后的基因表達譜出現(xiàn)明顯變化，這些DEGs有些是新鑒定的蛋白質(zhì)或者功能未知的蛋白質(zhì)，有些已被證明與腫瘤相關(guān)。深入研究這些DEGs無疑有助于進一步揭示腎癌發(fā)生的分子機制，并可能為腎癌的早期診斷和治療提供有用的標志和藥物靶點。