趙恒奎,尹亞東,孫中磊,劉英富

(1.棗莊礦業(yè)集團(tuán)滕南醫(yī)院 外三科，山東 濟(jì)寧 277606；2.棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 棗莊 277000；3.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，滄州納米技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 滄州 061001)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腦腫瘤，由于其高侵襲性和增殖能力，無論是手術(shù)切除還是聯(lián)合放化療都不能徹底治愈[1-2]。隨著對腦膠質(zhì)瘤分子機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)某些特定基因和蛋白質(zhì)的變化對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后和生物學(xué)特性有很大的影響[3]。環(huán)指蛋白187(RNF187)，也稱為RING域AP-1共激活因子1，是一種包含RING域的泛素E3連接酶[4]。RNF187是生長因子信號的c-Jun共激活劑，對于AP-1在細(xì)胞增殖中的功能至關(guān)重要[5]。最近的研究表明，泛素連接酶與肝癌、膠質(zhì)瘤等多種癌癥相關(guān)[6-7]。泛素化是指翻譯后再修飾，調(diào)節(jié)一系列生物過程，其功能障礙與腫瘤發(fā)生有關(guān)[8]。Notch1通路在從細(xì)胞翻譯復(fù)制到分化的各種生物學(xué)過程中起著基礎(chǔ)性的作用，改變Notch1通路不僅會(huì)導(dǎo)致多系統(tǒng)發(fā)育缺陷，還會(huì)導(dǎo)致多種類型的癌癥的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。而且，Notch1信號途徑促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。因此，本研究推測在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RNF187的E3泛素化可能與Notch1通路存在某些聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251(上海中科院細(xì)胞庫)；RNF187沉默腺病毒表達(dá)載體AAVrh.10 RNF187 siRNA與無表達(dá)基因腺病毒衣殼AAVrh.10 Negative(廣州云舟生物科技有限公司)；RNF187、Notch1(abcam公司)；MTT、Trizol及去RNA酶試劑(Cayman Chemical公司)；RT-PCR引物(賽默飛世爾科技有限公司)；Tranwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)板及計(jì)數(shù)板(康寧公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Gibco公司)；其它試劑如非特殊說明均由當(dāng)?shù)卦噭┥烫峁?/p>

1.2 標(biāo)本來源及分組 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本來源于2015年1月至2018年10月我院神經(jīng)外科首次住院并行手術(shù)治療的患者，根據(jù)術(shù)后病理49例腦膠質(zhì)瘤患者納入本次研究。49例患者中，男24例(49%)，女25例(51%)；年齡為(39.5±7.5)歲；腫瘤最大徑為(4.5±2.1)cm。隨訪時(shí)間為(41±15)個(gè)月(27～63個(gè)月)。根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級，將Ⅰ級和Ⅱ級腫瘤分類為低度惡性腦膠質(zhì)瘤組(LM組，n=18例)，將Ⅲ級和Ⅳ級的腫瘤分類為高度惡性腦膠質(zhì)瘤組(HG組，n=31例)，商業(yè)購買正常非腫瘤性大腦組織用于正常對照(Control組)。本研究獲得棗礦集團(tuán)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號：201504001)，所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 U251細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組：對照組(Control組)、陰性對照組(Negative組)和RNF187沉默組(RNF187 siRNA組)。Negative組和RNF187 siRNA組U251細(xì)胞分別加入等滴度純化的腺病毒表達(dá)載體AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF181 siRNA，Control組加入等體積PBS，共培養(yǎng)12 h。根據(jù)細(xì)胞的密度進(jìn)行換液或者傳代。將一部分細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另一部分凍存保種。

1.4 RT-qPCR試驗(yàn) 使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈，利用RT-qPCR試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)各蛋白mNRA的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列如表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR中使用的引物序列

1.5 免疫沉淀 用裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min，然后4 ℃離心純化 15 min，在4 ℃下抗體孵育1 h，然后用蛋白質(zhì) A 珠在 4 ℃下共孵育2 h， 2×SDS 緩沖液洗脫附在珠中蛋白(100 ℃，10 min)，樣品離心用于Western blot 分析。

1.6 Western blot檢測 分別破碎腫瘤組織和細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜。封閉后4 ℃孵育一抗體Notch1(1∶10 000)、RNF187(1∶10 000)和GAPDH(1∶10 000)過夜。膜清洗后與二抗在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測免疫反應(yīng)性條帶，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J 1.42q軟件程序分析圖像。

1.7 MTT增殖試驗(yàn) 取細(xì)胞懸液約100 μL，37 ℃ 5% CO2條件下，在具有完全培養(yǎng)基的96 孔板中培養(yǎng)至約2×105/孔。用20 μL的MTT處理后，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加150 μL DMSO終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處的吸光值。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 取各組重懸細(xì)胞(1×104/mL)200 μL加入Transwell小室中，培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉簽擦去小室薄膜上層細(xì)胞后，結(jié)晶紫染色薄膜下層細(xì)胞后，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)拍照。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤中RNF187和Notch1的mRNA 與蛋白表達(dá)水平 如圖1所示，LM組RNF187和Notch1的mRNA 與蛋白表達(dá)水平高于對照組，而HM組RNF187 mRNA 與蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HM組與LM組相比，RNF187 mRNA 與蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1A～C)。

*：與Control組相比， P <0.05；#：與LM組相比，P<0.05。圖1 腦膠質(zhì)瘤中RNF187和Notch1的mRNA與蛋白表達(dá)水平

2.2 RNF187表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤分級和Notch1表達(dá)相關(guān)性比較RNF187 mRNA表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級正相關(guān)(r=0.858，P<0.05)，RNF187 mRNA表達(dá)水平與Notch1 mRNA表達(dá)正相關(guān)(r=0.447，P<0.05)，按照WHO分級分組，4個(gè)分組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤各分組RNF187 mRNA比較

2.3 RNF187表達(dá)水平與總生存期的影響 將患者分為低表達(dá)量RNF187亞組(L組，n=24)和高表達(dá)量RNF187亞組(H組，n=25)，高表達(dá)量RNF187亞組生存率低于低表達(dá)量RNF187亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017，見圖2)。

圖2 RNF187表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者 Kaplan-Meier生存曲線

2.4 RNF187沉默抑制Notch1表達(dá) RT-qPCR和 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 Control組相比， Negative組RNF187和Notch1的 mRNA及蛋白均沒有顯著差別(P>0.05)，與 Control組和 Negative組相比， RNF187沉默組RNF187和Notch1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降(見圖3A～C)。

2.5 RNF181與 Notch1蛋白共表達(dá) 免疫共沉淀(Co-IP)表明 RNF187可能與SHG-44細(xì)胞中的Notch1結(jié)合(圖 4A)。本研究還分析了陰性對照和沉默RNF181的 Notch1蛋白的半衰期，結(jié)果分析表明半衰期分析表明 RNF187沉默顯著抑制了Notch1蛋白的穩(wěn)定性(見圖4B、C)

*：與Control組相比， P<0.05；#：與Negative組相比，P<0.05。圖3 RNF187沉默抑制Notch1表達(dá)

圖4 RNF187與 Notch1蛋白共表達(dá)

2.6 RNF187沉默抑制U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組與Negative組細(xì)胞增殖率沒有差異(P>0.05)，RNF187沉默組細(xì)胞增殖率明顯低于其他兩組(P<0.05，圖5A)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組和Negative組相比穿膜細(xì)胞數(shù)沒有差別(P>0.05)，而RNF187組的U251穿膜細(xì)胞數(shù)較其他兩組明顯降低(P<0.05，見圖5B)。

A：MTT實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞增殖率；B：Transwell實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞穿膜數(shù)，紫色標(biāo)記細(xì)胞核；放大倍數(shù)均為400倍；*：與Control組相比， P<0.05;#：與Negative組相比，P<0.05。圖5 U251細(xì)胞沉默RNF181后細(xì)胞增殖與Transwell實(shí)驗(yàn)

3 討論

雖然已經(jīng)報(bào)道了多種生物標(biāo)記物參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的調(diào)節(jié)，但是目前對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制的理解仍然有限，許多潛在的基因需要探索[12]。有研究表明，RNF187作為RING結(jié)構(gòu)域的泛素E3連接酶，在肝癌中RNF187過表達(dá)不僅預(yù)示著臨床病理特征差、預(yù)后生存期短，還與肝癌的發(fā)生有關(guān)[13]；在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，RNF187的過表達(dá)通過激活MAPK和PI3K信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)EMT，增加細(xì)胞凋亡的抗性[14]。這些研究表明RNF187是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素。本研究旨在分析RNF187在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用，以期為腦膠質(zhì)瘤治療和診斷提供新的方向。

有研究表明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RNF2過表達(dá)，下調(diào)RNF2后促進(jìn)U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其放射敏感性[15]。而本研究中發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中RNF187過表達(dá)，而且，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者RNF187異常高表達(dá)組較低表達(dá)組的臨床預(yù)后更差，總體存活率更低。為了探索RNF187在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用，本研究在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中敲低RNF187，結(jié)果抑制了U251細(xì)胞活力、增殖、遷移和侵襲。這些結(jié)果表明RNF187的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性度相關(guān)，可以用來評估腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后生存。 Notch1通路在從細(xì)胞翻譯復(fù)制到分化的各種生物學(xué)過程中起著基礎(chǔ)性的作用，Notch1異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[9-10]。在前列腺癌中，Notch1沉默可通過基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)抑制侵襲[16]。Notch1過表達(dá)可以通過E-catenin和NF-κB途徑促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。還有研究表明Notch1通路可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療靶點(diǎn)[18]。本研究分析了49例腦膠質(zhì)瘤患者RNF187 mRNA與Notch1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明RNF187的表達(dá)與Notch1的表達(dá)正相關(guān)。因此，本研究推測RNF187作為泛素化酶參與的多種生物過程可能與notch1參與的生物過程部分重合。Notch1和RNF187表達(dá)的結(jié)合可預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后，進(jìn)一步驗(yàn)證了Notch1/RNF187軸的重要性。這與RNF187在肝細(xì)胞癌中聯(lián)合Notch1介導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究結(jié)果一致[19]?？紤]到Notch1和RNF187表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，本研究旨在確定引起Notch1和RNF187表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間相關(guān)性的潛在機(jī)制。沉默RNF187后不僅抑制了Notch1的mRNA和蛋白的表達(dá)，還抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。為進(jìn)一步分析二者之間的聯(lián)系，本研究開展了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)RNF187與Notch1共同表達(dá)，并且沉默RNF187后Notch1的穩(wěn)定性降低，Notch1表達(dá)抑制。這表明RNF187可能是通過維持Notch1的穩(wěn)定性調(diào)控腦膠質(zhì)瘤的惡性度。

綜上所述，RNF187表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性度正相關(guān)，可能是通過Notch1信號途徑引起的，為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的線索。