王野，劉雪瑩，竇德強*，陳飛谷*

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院·遼寧大連·116600）

心力衰竭(心衰)是一種復雜的臨床癥狀群,是各種心臟病的嚴重階段。根據多年前的流行病學調查,隨著老齡化社會的到來,中國心力衰竭患者數量必將呈逐年增長的態(tài)勢[1]。國際上多用西藥對心衰進行治療,但由于西藥治療常伴隨明顯的不良反應[2],在國內中醫(yī)藥對于心衰治療強調整體辯證,在穩(wěn)定病情、改善心功能、提高生存質量等方面具有優(yōu)勢[3],因此現代中醫(yī)常利用西醫(yī)診斷、中醫(yī)辨證論治的方法對心衰進行治療[4]。人參附子配伍常在用治療心衰的方劑中出現,但不同方劑之間人參附子配伍比例存在相當差異,因此本實驗對不同配伍比例的人參附子水煎液對體外心衰細胞的保護作用進行研究,對人參附子的不同配伍比例進行篩選,尋找對心衰療效較好的配伍比例。

1 試驗方法及材料

1.1 材料與儀器

1.1.1 動物

出生1～3 d SD大鼠的乳鼠,SPF級,雌雄不限,SD大鼠孕鼠由遼寧長生生物技術有限公司提供（許可證號：SCXK(遼)2015-0001）。

1.1.2 藥材

人參藥材與附子藥材（來源于中國中醫(yī)科學院）。

1.1.3 試劑

四甲基偶氮唑藍（MTT）（批號：303H0525；北京Solarbio公司）；二甲基亞砜（DMSO）（批號：520C0313；美國Sigma公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（批號：；美國Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（批號：1830857；美國Gibco公司）；胎牛血清（批號：8166872；美國Gibco公司）；青、鏈霉素（批號：J160035；美國Hyclone公司）；PBS磷酸鹽緩沖液（批號：113I0215；北京Solarbio公司）；Ⅱ型膠原酶（批號：607C1312；北京Solarbio公司）；D-Hank's液（批號：20170706；北京Solarbio公司）；去乙酰毛花苷注射液（批號：161105；上海禾豐制藥有限公司）。

1.1.4 儀器與設備

NU-4750型CO2培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；HD2-BCN-1360B生物潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；Caretium酶標儀（深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司）；AE31EF型倒置顯微鏡（Motic公司）；U570-86 Premium系列超低溫冰箱（-80℃）（美國NBS公司）；TDZ4-WS低速臺式離心機（湘儀離心機）；濾器（0.22μm）（Millex.GP）；細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；96孔無菌培養(yǎng)板（Corning公司）；6孔無菌培養(yǎng)板（Corning公司）；24孔無菌培養(yǎng)板（Corning公司）；HH-4電子恒溫水浴鍋（金壇市億通公司）；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；200目孔徑不銹鋼濾網（北京Solarbio公司）；眼科剪與眼科鑷。

1.1.5 主要試劑的配制

10%高糖DMEM培養(yǎng)液：取適量高糖DMEM培養(yǎng)基,并加入1%雙抗10%于56℃滅活胎牛血清,0.22μm濾膜過濾,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

0.8%戊巴比妥鈉：用不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基溶解戊巴比妥鈉粉末(現配現用),將濃度稀釋為0.8%。

1.1.6 待測物藥液的配制

人參藥材與附子藥材分別用粉碎機粉碎后過60目篩,干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

3：1（人參：附子）水煎液：取15g人參粉末與5g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計200mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?：1（人參：附子）水煎液：取10g人參粉末與5g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計150mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5：1（人參：附子）水煎液：取15g人參粉末與5g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計200mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?：1（人參：附子）水煎液：取10g人參粉末與10g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計200mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1：2（人參：附子）水煎液：取5g人參粉末與10g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計150mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞的原代培養(yǎng)

取出生1～3 d SD大鼠的乳鼠若干用于實驗,超凈臺下進行以下操作：乳鼠經75%酒精消毒后斷頭處死,立即使用眼科剪與眼科鑷開胸取出心臟,將跳動的心臟在夾持到盛有預冷PBS平衡溶液的無菌EP管中使心臟自動泵出血液,操作過程中盡量注意防止損傷心臟。將心室部分剪下放入D-Hank's液中沖洗3次。將心肌組織轉移至離心管中,將心室肌部分用眼科剪剪成1mm3的組織塊,然后加入0.25%胰蛋白酶溶液及0.5%Ⅱ型膠原酶按1：1比例混合成消化酶3mL加入已剪碎的心肌組織中,吸管吹打,置于CO2培養(yǎng)箱（37℃,5% CO2,95%空氣）中消化5 min,棄去上層混懸液。再次加入消化酶3 mL消化5 min,收集上清液,并加入培養(yǎng)液終止消化。重復消化3次并收集上清液（若心肌組織未消化徹底,可增加消化次數,消化總時間應盡可能小于30 min）。將細胞混懸液經200目孔徑不銹鋼濾網過濾,離心機離心后,得到心肌細胞,接種于培養(yǎng)瓶中,然后置于CO2培養(yǎng)箱中,差速貼壁1.5 h。取差速貼壁后細胞懸液用臺盼藍染色計算細胞存活率,倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)后將純化后的細胞懸液種至各規(guī)格培養(yǎng)板中,于37℃5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),隔天換培養(yǎng)液,待細胞生長成熟(5 d)后,進行實驗[5-8]。

1.2.2 藥物濃度篩選

取差速貼壁后細胞懸液,每孔100μL接種于96孔板中,當細胞生長成熟(5 d)后,每孔分別加入終濃度為10、5、1、0.5、0.1 mg/mL的比例為1.5（人參）：1（附子）的人參附子水煎液及終濃度為80、40、20、10 mg/mL的去乙酰毛花苷注射液,同時設置陰性對照組（只接種細胞）和空白對照組（不接種細胞,只加培養(yǎng)液）。24 h后,每孔加入10μL濃度為5 mg/mL的MTT,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,吸出含MTT的培養(yǎng)液,每孔加入100μL的DMSO,震蕩10 min,在酶標儀492 nm處檢測吸光度（參考波長為630 nm）,并計算細胞增殖抑制率。

增殖抑制率（%）=[（1-（A實驗組-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）]×100%

1.2.3 戊巴比妥鈉致心肌細胞心衰模型建立

將0.8%戊巴比妥鈉加入到種有心肌細胞的培養(yǎng)板中,作用7 min,得到心衰模型細胞。造模成功標準為:于顯微鏡下觀察心肌細胞,搏動停止,原本梭形兩端變細中部變圓,且有脫壁傾向。

1.2.4 藥物對心衰模型細胞離子轉運相關酶活力的影響

取差速貼壁后細胞懸液接種于6孔板,每孔2mL,按照2.3下操作進行造模,造模成功后,棄去造模液。實驗分為以下幾組：

①空白對照組；

②模型組；

③陽性（去乙酰毛花苷）對照組（20mg/mL）；

④3：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑤2：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑥1.5：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑦1：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑧1：2組（人參：附子0.5mg/mL）；

各組分別加入相應的藥液,每組3個復孔,每孔1mL。將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,收集細胞:用0.25%EDTA胰酶消化,收集消化液于離心管中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,以1000r/min離心5min收集細胞,生理鹽水洗2遍以除掉殘留的培養(yǎng)液或磷酸緩沖鹽溶液,棄上清,留下層細胞,用生理鹽水制備106～107/ml的細胞懸液（500μl）,經超聲波細胞破碎機破碎細胞后（功率10%,4s/次,間隔8s,重復8～10次）,按超微量ATP酶測試盒說明書進行測定,得到Na+-K+ATPase的活力,同時檢測細胞總蛋白濃度。

破碎后按照試劑盒說明書測定細胞Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶與總ATP酶的活力。

1.2.5 細胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量的測定

取差速貼壁后細胞懸液接種于24孔板中,每孔1mL,按2.3項下方法分組、造模與給藥,每組6個復孔,每孔0.5mL。給藥作用1 h后,棄去藥液,用PBS清洗細胞1次,然后每孔加入140μL不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)液,采用ELISA法按照相關試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中腦鈉肽(BNP)與腫瘤壞死因子(TNF-α)含量。

1.2.6 數據處理

使用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0處理數據,組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）,結果以均數±標準差（±s）表示

2 實驗結果

2.1 細胞形態(tài)觀察

臺盼藍染色計算細胞存活率達96%。在倒置顯微鏡下觀察,剛接種的心肌細胞尚未貼壁,呈圓形,懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)72h后,心肌細胞已全部貼壁生長,細胞核凸出明顯,貼壁后心肌細胞為梭形、菱形或多角形,伸出偽足,出現自發(fā)性節(jié)律性搏動,詳見圖1。

圖1 造模前心肌細胞（1×200）

戊巴比妥鈉造模后的乳鼠心肌細胞搏動停止,原本梭形兩端變細中部變圓,且有脫壁傾向,詳見圖2。

圖2 造模后心肌細胞（1×200）

2.2 藥物濃度篩選結果

按上述實驗方法,得到以下結果。1.5：1（人參：附子）水煎液及去乙酰毛花苷注射液對原代心肌細胞的增殖抑制率如表1所示。

表1 藥物濃度篩選結果

高濃度1：1.5比例人參附子水煎液對原代心肌細胞有抑制作用,而0.5 mg/mL與0.1 mg/mL的1：1.5比例人參附子水煎液對原代心肌細胞無抑制作用,因此選取0.5 mg/mL的1：1.5比例人參附子水煎液進行后續(xù)實驗。陽性藥去乙酰毛花苷在20 mg/mL時對原代心肌細胞無抑制作用,故選取20 mg/mL去乙酰毛花苷進行后續(xù)實驗。

2.3 不同比例人參附子水煎液對心衰模型細胞離子轉運相關酶活力的影響

按上述實驗方法,得到以下結果。不同比例人參附子水煎液對心衰模型細胞離子轉運相關酶活力的影響結果如表2所示。

表2 不同比例人參附子水煎液對心衰模型細胞離子轉運相關酶活力影響結果

圖3 不同比例人參附子水煎液對心衰模型細胞離子轉運相關酶活力影響

由上述實驗結果可知,與空白組相比,模型組Na+-K+ATPase活力顯著增強（P＜0.01）,Ca2+-Mg2+ATPase活力有下降趨勢,總ATPase活力顯著降低,心肌收縮力減弱。與模型組相比,陽性藥去乙酰毛花苷組能夠顯著降低由0.8%戊巴比妥鈉所致心衰引起的Na+-K+ATPase及總ATPase活力增強,而對Ca2+-Mg2+ATPase活力影響較小。其他各給藥組均有逆轉由0.8%戊巴比妥鈉所致心衰引起的Na+-K+ATPase及總ATPase活力增強的趨勢,以2：1、1.5：1與1：1這三個配伍比例作用最顯著,具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）。

2.4 不同比例人參附子水煎液對細胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量影響

按上述實驗方法,得到以下結果。不同比例人參附子水煎液對對細胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量影響結果如表3所示。

表3 不同比例人參附子水煎液對細胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量影響結果

注：*P＜0.05,**P＜0.01與模型組比較；#P＜0.05,##P＜0.01與空白組比較

由上述實驗結果可知,與空白組相比,模型組TNF-α及BNP含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比,陽性藥去乙酰毛花苷組能夠顯著降低TNF-α及BNP含量（P＜0.01）。綜合BNP與TNF-α數據統(tǒng)計分析可知2：1（人參：附子）組,1.5：1（人參：附子）組及1：1（人參：附子）組對心衰細胞恢復正常水平具有顯著療效（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。

3 討論

心力衰竭是由各種心臟疾病導致心功能不全的一種臨床綜合征,大多指心肌收縮力下降使心排血量不能滿足機體代謝的需要,導致器官、組織血液灌流不足,同時出現體循環(huán)或肺循環(huán)淤血的表現[9]。

Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase是維持細胞內外離子濃度的重要酶[10],目前研究表明,細胞膜內外各離子濃度具有調節(jié)心肌細胞收縮力的能力,當心衰發(fā)生時,細胞外鈣離子含量高于細胞內,心肌收縮力減弱[11]。當心肌組織缺氧、血流動力學改變時均可促使心肌組織合成TNF-α,TNF-α在心肌重塑和心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展中有重要作用,目前研究表明TNF-α可反映心力衰竭的嚴重程度,是判定心功能及其觀察療效的一項有價值的指標[12]。腦尿鈉肽（BNP）主要由心室肌細胞產生,是一種對機體各組織器官的多種生理功能具有調節(jié)作用的活性多肽[11]。當心室容量負荷過重、室壁壓力增加、心室肌細胞發(fā)生損傷、心室肌細胞受牽拉等因素時會導致BNP分泌增多。目前BNP對于早期診斷和鑒別心衰有十分重要的臨床價值,也是評估預后、危險層次級別劃分、判斷治療心衰效果的“金指標”[13]。

自古以來,人參附子配伍應用與多種方劑方中,如參附湯、人參四逆湯等。目前此類方劑多用于治療心力衰竭、心源性休克等心血管疾病。但不同方劑中其配伍比例存在差異[14],因此,本實驗通過建立體外心衰模型,對不同比例配伍的人參附子水煎液進行優(yōu)選,結果表明2：1（人參：附子）組,1.5：1（人參：附子）組及1：1（人參：附子）組療效較好,能夠顯著降低由心衰引起的TNF-α及BNP水平改變,通過調節(jié)心室肌細胞膜上Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase及總ATPase含量,使心肌的收縮性加強,發(fā)揮抗心衰作用。