韓鸞瑋，牛雪妮，呂重寧，路金才*

（沈陽藥科大學中藥學院·遼寧沈陽·110016）

尚璽膠囊是以葡萄提取物、姜黃提取物、羅布麻提取物、絞股藍提取物、三七提取物、淀粉和硬脂酸鎂為主要原料制成的保健食品,其代表性化學成分是白藜蘆醇和總皂苷。白藜蘆醇(Resveratrol,Res),是從葡萄中提取的重要活性成分,是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物（化學名為三羥基芪）,具有顯著的藥理及生物學作用：抗炎、抗癌、抗氧化、保護心血管、保護腦神經(jīng)、抗衰老、調(diào)節(jié)雌激素、抗增殖、抗突變等[1-7],基于此,本實驗對尚璽膠囊的抗炎活性進行了評估。角叉菜膠誘導急性炎癥導致足腫脹,是篩選抗炎藥的常用測試方法[8]。角叉菜膠引起的足腫脹包括兩個發(fā)展階段：第一階段與組胺、5-羥色胺和激肽的釋放有關,而第二階段與前列腺素的釋放有關[9]。因此,我們通過建立角叉菜膠所致大鼠足腫脹模型,探索尚璽膠囊抗炎活性可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

角叉菜膠（批號：81K1556）購自Sigma；冰醋酸（批號：190304）購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號：190124）和氫氧化鉀（批號：191025）購自天津博迪化工股份有限公司；分析級甲醇（批號：190624）和乙醇（批號：190624）購自天津永達化學試劑有限公司；純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；白藜蘆醇（批號：111535-201703；含量：99.4%）購自中國食品藥品檢定研究院；尚璽膠囊（魯食健生證（臨）字20140008號）購自濟南大醫(yī)科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（WST-1方法；批號190723）和丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA方法；批號190725）購自南京建成生物工程研究所；大鼠白介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（貨號：E-EL-R0012c）和大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（貨號：E-ELR2856c）購自Elabscience。

1.2 實驗動物

SD雄性大鼠40只,體重180～220g,北京華阜康生物技術有限公司,許可證號SCXK（京）2019-0001。

1.3 實驗儀器

醫(yī)用離心機80-2型（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；恒溫數(shù)顯水浴鍋DFD700（天津泰斯特公司）；分析天平BS124S型（賽多利斯公司）；超聲波清洗器KQ5200E型（昆山市超聲儀器有限公司）；全波長多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 尚璽膠囊對角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響

將30只體重為150～200g的SD雄性大鼠隨機分為5組（每組6只）：高劑量給藥組（450 mg·kg-1）,中劑量給藥組（300 mg·kg-1）,低劑量給藥組（150 mg·kg-1）,陽性組（白藜蘆醇10 mg·kg-1）,對照組,詳見表1。稱重,標號。將大鼠在溫度（21±2℃）,相對濕度（20%）和12/12小時的明暗循環(huán)的標準條件下,給予飼料和水。

表1 實驗動物分組與給藥劑量

正常飼養(yǎng)兩天后開始灌胃給藥,模型組每只灌胃等體積2 mL 0.4%羧甲基纖維素鈉溶液,給藥組按相應劑量進行給藥（受試藥以0.4% CMC-Na制成混懸液）。每天灌胃給藥一次,連續(xù)7天,自由進食進水,每日觀察大鼠活動狀態(tài)。在最后一次給藥1小時后,皮下注射角叉菜膠（1% w/v）。進入右后爪的足底表面（0.1 mL/爪）以誘發(fā)炎癥,隨后出現(xiàn)水腫。在注射角叉菜膠之前測量右爪的足周徑（在此劃線以便后續(xù)測量）,然后在0、0.5、1、2、3、4 h分別測量足周徑。并計算腫脹度與抑制百分率,計算公式如下。

在測量致炎后2小時的足周徑之后,每只大鼠眼眶靜脈取血1.5 mL。放置20分鐘后,將其以6000 rpm離心5分鐘,取血清,并儲存在-20℃的冰箱中使用。測量4小時后,通過頸椎脫臼法處死大鼠,沿標記線剪下炎足,脫皮剪碎,在2.5 mL生理鹽水中浸泡24 h,3000轉(zhuǎn)·min-1離心10 min,取上清液,-20℃冰箱冷藏備用。

腫脹度與抑制率結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)表明,尚璽膠囊在1至4小時內(nèi)炎癥足爪腫脹度顯著降低。此外,在300 mg·kg-1的劑量下,抑制率在2 h達到峰值,為7.58%（P＜0.05）,與白藜蘆醇相當,后者的抑制率約為8.30%（P＜0.05）；當劑量為450mg·kg-1時,足腫脹抑制效果優(yōu)于白藜蘆醇。這表明尚璽膠囊具有顯著的抗炎作用,并且是劑量依賴性的。

表2 尚璽膠囊對角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹的足周徑和抑制率

2.2 血清中SOD活力、MDA含量測定

取2.1項下的血清并分別按照SOD測定試劑盒和MDA測定試劑盒中的說明書進行測定。結(jié)果見表3。

2.3 炎癥足爪中PGE2含量測定

取2.1項下的炎足上清液0.6 mL,加入0.5 mol/L KOH-甲醇2 mL,50℃水浴異構(gòu)化20 min,甲醇稀釋至5 mL,于278 nm處測PGE2含量。根據(jù)以下公式計算PGE2含量：PGE2含量（μg·g-1）=（E278×13.13×Vt×D）/W。這里,Vt=PGE2測定過程中浸泡溶液的體積,D=稀釋因子,W=炎足的重量（g）,E278=在278 nm處的吸收值。結(jié)果見表3、圖1。

圖1 SOD活力、MDA含量、PGE2含量比較

表3 SOD活力、MDA和PGE2含量測定結(jié)果

結(jié)果表明,與對照組相比,各給藥組MDA、PGE2的含量均降低,SOD活力均提高；其中,中劑量組（300 mg·kg-1）所測各指標變化顯著（但不及陽性藥組）,低劑量組所測各指標變化相對較小。

2.4 血清中IL-1β和TNF-α的含量測定

取2.1項下的血清并參照ELISA試劑盒說明書進行操作,測定血清中IL-1β和TNF-α的含量。結(jié)果見表4。

表4 血清中IL-1β和TNF-α含量測定結(jié)果

結(jié)果表明,與對照組相比,各給藥組TNF-α和IL-1β的含量均降低,其中,中劑量組（300 mg·kg-1）所測各指標變化顯著,低劑量組所測各指標變化相對較小。提示給予大鼠尚璽膠囊300 mg·kg-1劑量具有一定的抗炎作用。

2.5 統(tǒng)計方法

實驗采用SPSS 17.0軟件進行分析,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示,組間比較應用方差分析,P＜0.05即認為統(tǒng)計具有顯著性差異。

3 討論

炎癥是機體對損傷因子所發(fā)生的一種特異性防御反應,與花生四烯酸代謝有直接關系[10]。機體的花生四烯酸主要通過環(huán)氧化酶和脂氧化酶兩條途徑進行代謝,分別產(chǎn)生前列腺素和白細胞三烯等致炎物質(zhì),其中,PGE2是一種重要的炎癥介質(zhì)。在前列腺素的合成過程中伴有氧自由基的生成,且兩者的合成存在協(xié)同效應［11-12]。然而研究表明,大量的自由基可以引起膜脂質(zhì)過氧化增強,破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能,形成一系列脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物MDA,使SOD等清除自由基的酶活性降低,但相關酶活性降低的同時又不能有效降解已產(chǎn)生的大量的自由基,形成惡性循環(huán),加重組織損傷[13]。

由于本品中已知的成分白藜蘆醇具有很好的抗炎活性,因此我們選用角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹模型,并測定其血清中SOD活力、MDA含量和炎性組織中PGE2含量評價了尚璽膠囊的抗炎活性。結(jié)果表明尚璽膠囊在給藥量為300 mg·kg-1時能降低大鼠毛細血管通透性、減少炎癥滲出,對急慢性炎癥反應有顯著抑制作用。另外,它能明顯降低大鼠足爪局部炎癥組織中PGE2含量和血清中MDA含量,這表明尚璽膠囊的抗炎作用可能與減少炎癥組織中PGE2合成和抑制組織炎癥中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成有關。

研究表明,白藜蘆醇抗炎活性的作用機制與減少炎癥因子、抑制COX-2/PGE2信號通路有關[14-15]。而在本研究中,尚璽膠囊在給藥量為300 mg·kg-1時能明顯降低大鼠血清中TNF-α含量,這表明尚璽膠囊能明顯下調(diào)角叉菜膠誘導足腫脹大鼠炎癥因子TNFα的表達,降低大鼠血清中炎癥因子含量,進而改善炎癥癥狀,這對于進一步探究尚璽膠囊抗炎作用的機理提供了重要的依據(jù)。