劉妍罕 王相金 胡安東 曾茂芹 楊穎 溫貴蘭 程振濤 文明

摘 要：為明確含DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌在鴨免疫器官中的分布動(dòng)態(tài)，本研究將重組減毒沙門氏菌口服接種鴨（即重組細(xì)菌組），同時(shí)設(shè)立重組質(zhì)粒組、弱毒疫苗組和空白對(duì)照組，于免疫后第7、14、21、28、35、42和49天時(shí)，捕殺試驗(yàn)鴨，采集鴨脾臟、胸腺、法氏囊和哈德氏腺等免疫器官，采用間接免疫熒光法進(jìn)行DEV-gB抗原檢測(cè)觀察，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組鴨免疫器官在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到DEV-gB抗原信號(hào);免疫后，重組細(xì)菌組、弱毒疫苗組和重組質(zhì)粒組鴨免疫器官均能檢測(cè)到DEV抗原陽(yáng)性信號(hào)，但含DEV抗原陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞數(shù)量從多到少的組別順序是弱毒疫苗組、重組細(xì)菌組和重組質(zhì)粒組，且重組細(xì)菌組與弱毒疫苗組差異不顯著（P>0.05）;檢出含DEV抗原陽(yáng)性信號(hào)的免疫器官先后順序是脾臟、法氏囊、哈德氏腺和胸腺，而含DEV抗原陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞數(shù)量從多到少的免疫器官順序是脾臟、法氏囊、胸腺和哈德氏腺。由此可見(jiàn)，本研究構(gòu)建的攜帶DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌能在鴨免疫器官中得到良好的表達(dá)，為該重組細(xì)菌疫苗的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：DEV;重組減毒沙門氏菌;鴨;表達(dá)動(dòng)態(tài)

中圖分類號(hào)：S8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2021）06-0037-07

國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.06.005

Abstract：To determine the distribution dynamics of recombinant attenuated salmonella carring DEV-gB gen in the immune organs of ducks，and inoculated with recombinant bacteria，recombinant plamid，attenuated vaccine and sterile PBS silution （blank control），respectively.The experimental ducks were killed at the 7th，14th，21th，28th，35th，42th and 49th day after immunization，and the spleen，thymus，F(xiàn)abricius bursa and Hardy's gland were collected，and detected for DEV-gB antigen by indirect immunofluorescence method.The results showed that no signal of DEV-gB antigen was detected in duck immune organs of blank control group at every time-point，but positive signal presented in the other three groups.And the cell number with DEV-gB positive signal in the recombinant bacteria group was ，the most，followed by attenuated vaccine group and recombinant plasmid group，but there was no significant difference between the recombinant bacteria group and the attenuated vaccine group.The order of the immune organs detected with positive signal of DEV-gB antigen were respectively spleen，F(xiàn)abricius bursa，Hardy's gland and thymus，while the cell number with DEV-gB positive signal in spleen were the most，followed by Fabricius bursa，thymus and Hardy's gland.Therefore，the recombinant attenuated Salmonella ?carrying DEV-gB gene could be well expressed in duck immune organs，laying a theoretical basis for the clinical application of the recombinant bacterial vaccine.

Keywords：DEV;recombinant attenuated Salmonella;duck;expression dynamics

鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE）亦稱鴨瘟（Duck plague），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起鴨、鵝和多種雁形目禽類發(fā)生一種以血管損傷、體腔溢血、消化道出血性壞死和淋巴器官受損為特征的急性、熱性、敗血性傳染病[1]。DVE流行廣泛，傳播迅速，具有較高的發(fā)病率和死亡率，常給養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病主要以疫苗接種預(yù)防為主，且多采用肌肉或皮下接種，極不方便。因此，研發(fā)新型疫苗，尋求簡(jiǎn)便的接種途徑，是鴨病毒性腸炎防控的重要方向之一[2]。通過(guò)基因工程減毒的沙門氏菌能攜帶外源基因，可通過(guò)飲水等途徑，將外源基因直接攜入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答效果，特別適用于規(guī)?；B(yǎng)殖的群體免疫[3]。

DEV屬于皰疹病毒科，基因組大小約為150 kb，可編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白，其中編碼的gB蛋白是一種囊膜糖蛋白，為病毒感染和復(fù)制所必需，具有良好的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)室前期成功構(gòu)建了DEV-gB基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DEV-gB，并轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207，得到基于DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌疫苗[4-5]。本研究在此基礎(chǔ)上，將該重組疫苗免疫注射鴨，采用免疫組化法分析其在鴨免疫器官中的表達(dá)動(dòng)態(tài)，以期為該重組疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)和臨床示范應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒、重組減毒沙門氏菌、鴨瘟疫苗及試驗(yàn)用鴨

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DEV-gB和含重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DEV-gB減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207，由貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心構(gòu)建并保存。鴨病毒性腸炎弱毒疫苗，購(gòu)于遼寧益康生物制品有限公司。試驗(yàn)用鴨為1日齡四川內(nèi)江白鴨160只，購(gòu)自四川省內(nèi)江市某種鴨場(chǎng)，經(jīng)血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)為DEV抗體和核酸陰性。

1.2 主要檢測(cè)試劑和儀器

核酸提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;粘片劑多聚賴氨酸，購(gòu)自武漢博士德生物工程公司;伊文思藍(lán)，購(gòu)自Sigma公司;兔抗DEV-gB-IgG和FITC-羊抗兔IgG等，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;石蠟切片機(jī)（KH-Q2016），湖北闊海醫(yī)療科技有限公司;熒光顯微鏡（BFM-330），上海比目?jī)x器有限公司。

1.3 試驗(yàn)分組與免疫動(dòng)物

試驗(yàn)鴨飼養(yǎng)7 d觀察無(wú)異常，隨機(jī)分為4組即重組質(zhì)粒組、重組細(xì)菌組、弱毒疫苗組和空白對(duì)照組，每組40只。免疫前禁水禁食4 h，重組細(xì)菌組口服接種含重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DEV-gB減毒鼠傷寒沙門氏菌，108 CFU/只;重組質(zhì)粒組肌肉注射重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DEV-gB，200 μg/只;弱毒疫苗組皮下注射弱毒疫苗，0.5 mL/只;空白對(duì)照組肌肉注射滅菌PBS緩沖液，0.5 mL/只。至鴨21日齡時(shí)再如上方法加強(qiáng)免疫1次。

1.4 樣本采集與處理

于第1次免疫后第7、14、21、28、35、42和49天，每組隨機(jī)挑取試驗(yàn)鴨3只，頸靜脈采血致死，剖解無(wú)菌采集鴨脾臟、胸腺、法氏囊和哈德氏腺，于4%多聚甲醛溶液固定一定時(shí)間后，適當(dāng)修塊，自來(lái)水漂洗30 min，于系列梯度乙醇中脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)切片，取蠟片置于多聚賴氨酸處理號(hào)的載玻片上展平，60 ℃烤箱烘烤2 h，備用。

1.5 間接熒光法檢測(cè)DEV-gB抗原表達(dá)動(dòng)態(tài)

取上述含蠟片的載玻片，常規(guī)甲苯脫蠟和低滲復(fù)水后，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，以3% H2O2-甲醇封閉組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和非免山羊血清封閉非特異性抗原位點(diǎn)后，加入兔抗DEV-gB-IgG孵育過(guò)夜，PBS-T洗絳3次;加入FITC-羊抗兔IgG，37 ℃避光作用1 h，PBS-T洗滌3次，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察，SPOT-ADVANCE軟件拍照。

1.6 結(jié)果判定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

于光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)有無(wú)黃綠色熒光及其細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定：若視野下無(wú)黃綠色熒光，判為陰性（-）;黃綠色熒光細(xì)胞數(shù)量少于5%，判為弱陽(yáng)性（+）;黃綠色熒光細(xì)胞數(shù)量為5%～50%，判為陽(yáng)性（++）;黃綠色熒光細(xì)胞數(shù)量大于50%，判為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。同一時(shí)間段每份組織觀察3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)和計(jì)算呈現(xiàn)黃綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白對(duì)照組DEV-gB抗原在鴨免疫器官中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

經(jīng)觀察，空白對(duì)照組鴨在第7、14、21、28、35、42和49天時(shí)，其脾臟、胸腺、法氏囊和哈德氏腺均未呈現(xiàn)黃綠色熒光為陰性。

2.2 試驗(yàn)組DEV-gB抗原在鴨脾臟中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

經(jīng)觀察，重組細(xì)菌組鴨免疫后第7天時(shí)，脾臟可見(jiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性信號(hào)（圖1-a），至第35天時(shí)，脾臟呈強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)（圖1-b），之后均呈強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。重組質(zhì)粒組鴨免疫后第7天時(shí)，脾臟亦呈現(xiàn)弱陽(yáng)性信號(hào)（圖1-c），至第21天時(shí)，脾臟呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)（圖1-d），之后均呈強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。弱毒疫苗組鴨免疫后第7天時(shí)，脾臟呈現(xiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性信號(hào)（圖1-e），至第28天時(shí)，脾臟呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)（圖1-f），之后均呈強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。

2.3 試驗(yàn)組DEV-gB抗原在鴨胸腺中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

經(jīng)觀察，重組細(xì)菌組鴨免疫后21 d時(shí)，其胸腺呈現(xiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性（圖2-a），至42 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖2-b），之后陽(yáng)性信號(hào)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。重組質(zhì)粒組鴨免疫后28 d，其胸腺可見(jiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性（圖2-c），至42 d時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)（圖2-d），之后均呈強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。弱毒疫苗組鴨免疫后21 d，其胸腺可見(jiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性（圖2-e），至42 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖2-f），之后陽(yáng)性信號(hào)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.4 試驗(yàn)組DEV-gB抗原在鴨法氏囊中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

經(jīng)觀察，重組細(xì)菌組鴨免疫后7 d，其法氏囊可見(jiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性（圖3-a）;至21 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖3-b），之后陽(yáng)性信號(hào)呈下降趨勢(shì)。重組質(zhì)粒組鴨免疫后14 ?d，其法氏囊呈弱陽(yáng)性信號(hào)（圖3-c），至35 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖3-d），之后陽(yáng)性信號(hào)呈下降趨勢(shì)。弱毒疫苗組鴨免疫后7 d時(shí)，其法氏囊呈弱陽(yáng)性信號(hào)（圖3-e），至28 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖3-f），之后陽(yáng)性信號(hào)呈下降趨勢(shì)。

2.5 試驗(yàn)組DEV-gB抗原在鴨哈德氏腺中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

經(jīng)觀察，重組細(xì)菌組鴨免疫后7 d，其哈德氏腺可見(jiàn)黃綠色熒光為弱陽(yáng)性（圖4-a），至35 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖4-b），之后陽(yáng)性信號(hào)呈下降趨勢(shì)。重組質(zhì)粒組鴨免疫后21 d，其哈德氏腺呈若陽(yáng)性信號(hào)（圖4-c），至第35天時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖4-d），之后陽(yáng)性信號(hào)呈下降趨勢(shì)。弱毒疫苗組鴨免疫后14 d，其哈德氏腺可見(jiàn)弱陽(yáng)性信號(hào)（圖4-e），至28 d時(shí)其陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)（圖4-f），之后陽(yáng)性信號(hào)呈下降趨勢(shì)。

2.6 試驗(yàn)組鴨免疫器官含DEV-gB抗原信號(hào)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

采用間接免疫熒光法處理，熒光顯微鏡觀察，對(duì)含DEV-gB抗原信號(hào)的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，同一組織同一時(shí)間觀察計(jì)數(shù)3張切片，每張切片3個(gè)視野后求平均值，結(jié)果如表1所示：免疫后鴨免疫器官均可檢測(cè)到DEV-gB抗原信號(hào)，其中：重組細(xì)菌組鴨免疫器官含陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞數(shù)量與弱毒疫苗組差異不顯著（P>0.05），顯著高于重組質(zhì)粒組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

DEV能夠在鴨群中廣泛傳播，感染力強(qiáng)、速度快，鴨或其他水禽體內(nèi)可以持續(xù)存在，死亡率較高，給養(yǎng)鴨戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。鴨瘟疫苗多采用肌肉或皮下接種，李愛(ài)欣等[6]通過(guò)臨床證實(shí)鴨瘟活疫苗可以誘導(dǎo)鴨呼吸道和消化道局部黏膜產(chǎn)生DEV特異性抗體，滴鼻免疫可以誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生與肌注接近同等的保護(hù)力，為本試驗(yàn)研發(fā)新型疫苗提供接種新途徑。

本研究構(gòu)建的攜帶DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌能在鴨免疫器官中得到良好的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，通過(guò)間接熒光法檢測(cè)DEV-gB抗原在鴨免疫器官中的表達(dá)動(dòng)態(tài)，在鴨脾臟、胸腺、哈德氏腺和法氏囊中，重組細(xì)菌組、弱毒疫苗組和重組質(zhì)粒組都檢測(cè)出陽(yáng)性。免疫器官的三個(gè)組別中，脾臟的陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞數(shù)量最多，說(shuō)明DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌疫苗能夠在脾臟中高效表達(dá)。目前報(bào)道了攜帶不同基因的減毒沙門氏菌在動(dòng)物體內(nèi)比較穩(wěn)定，重組細(xì)菌免疫產(chǎn)生抗體與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），與本試驗(yàn)免疫結(jié)果相似。重組細(xì)菌組與弱毒疫苗組從抗原細(xì)胞數(shù)量上比較差異不顯著，重組細(xì)菌組鴨免疫器官含陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞數(shù)量接近弱毒疫苗組（P>0.05），明顯高于重組質(zhì)粒組（P<0.05），表明DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌疫苗與市場(chǎng)成熟的DEV弱毒疫苗效果相當(dāng)，可以進(jìn)行臨床應(yīng)用[11-12]。重組質(zhì)粒組鴨免疫器官均能檢測(cè)到DEV抗原陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明該疫苗能將重組質(zhì)粒帶至免疫器官并釋放重組質(zhì)粒，使目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)順利進(jìn)行。新型基因編輯已運(yùn)用在疫苗開(kāi)發(fā)中[7-10]，但在應(yīng)用過(guò)程中仍存在脫靶效應(yīng)高等障礙，所以利用免疫組化法分析其在免疫器官中的表達(dá)動(dòng)態(tài)是很有必要的，可以為疫苗的靶向研究提供理論基礎(chǔ)。DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌疫苗能夠在免疫器官中表達(dá)，是否也能改變和調(diào)節(jié)宿主免疫的功能是值得研究的科學(xué)問(wèn)題。

本研究結(jié)果表明，攜帶DEV-gB基因重組減毒沙門氏菌能在鴨免疫器官中得到良好的表達(dá)，并且與弱毒疫苗在表達(dá)效果上差異不顯著，外源基因能夠直接攜入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，為研發(fā)口服疫苗，獲得免疫評(píng)價(jià)效果和臨床示范應(yīng)用打下良好的理論基礎(chǔ)[13-15]。

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