韓枝彤，陳自佳，王素梅，吳欣瑜

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100078；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

抽動障礙是一種以身體任何部位的一組或一群肌肉發(fā)生的不自主、快速、重復(fù)的收縮和(或)發(fā)聲為主要特征的綜合征[1]。抽動障礙大多數(shù)起病年齡為2～15歲，以5～10歲最多見，其病情通常在10～12歲最為嚴重，男孩明顯多于女孩，男女比例可達(3～4)∶1[2]。根據(jù)患兒發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)、病程長短和是否伴有發(fā)聲抽動主要分為短暫性抽動障礙、慢性運動或發(fā)聲抽動障礙、抽動穢語綜合征(TS)。據(jù)報道，抽動障礙患病率達0.5%～1%[1]，共患注意缺陷多動障礙、強迫障礙、抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)困難、適應(yīng)困難等精神障礙的發(fā)生率是正常兒童的5～10倍[3]，共患率可高達85.7%[4]。19世紀60年代以前抽動障礙一直被視為原因不明、罕見、可自愈性疾病，但隨著其患病率的增加，正成為危害兒童健康的常見嚴重慢性疾病之一。抽動障礙目前病因及發(fā)病機制尚未完全明確，亦缺乏特異性診斷指標(biāo)，為其進一步研究及臨床治療帶來一定的影響。本實驗運用代謝組學(xué)方法對抽動障礙患兒尿液特異性生物標(biāo)記物進行分析，揭示抽動障礙患兒獨特的代謝圖譜，客觀闡述抽動障礙發(fā)病的實質(zhì)和內(nèi)涵，從而為抽動障礙的研究、藥物開發(fā)等提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年10月—2020年3月北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院兒科門診明確診斷為抽動障礙的患兒30例作為抽動障礙組，其中男23例，女7例，年齡3～12(7.3±3.2)歲。入選患兒均符合美國精神醫(yī)學(xué)學(xué)會出版的《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第5版(DSM-Ⅴ)中抽動障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，家屬知情并同意參加本研究(10歲以上的患兒需經(jīng)本人知情同意)；排除合并風(fēng)濕性舞蹈病、手足徐動癥、癲癇等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，合并嚴重的心、腦、肝、腎、造血等系統(tǒng)疾病者，正在參加其他藥物的臨床試驗者。選擇同一時期在醫(yī)院體檢、與患兒無血緣關(guān)系的健康兒童30例作為正常組，男19例，女11例，年齡(6.6±2.7)歲。2組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2儀器和試劑 UPLC-Q-TOF-MS(Synapt G2，Waters，USA)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)。甲醇、乙腈和甲酸為MS級，購自美國Fisher公司。采用Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)制備純化水。

1.3尿樣采集及處理 采集2組受檢者中段晨尿5 mL，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。將凍存的尿液在室溫下復(fù)蘇，取尿液100 μL，加入400 μL甲醇，渦旋混勻后置于混合儀2 000 r/min作用10 min混勻。4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液400 μL氮氣下吹干。殘渣用100 μL甲醇溶解，4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，精密吸取上清液70 μL進樣分析。

1.4檢測方法 采用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)和化學(xué)計量學(xué)分析研究技術(shù)對2組受檢者尿液進行檢測。

1.4.1色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈-甲酸-水體系梯度洗脫：0.1%甲酸水溶液A，0.1%甲酸乙腈B；流速：0.4 mL/min；0～20 min 5%B～95%B；20.1～25 min 95%B；25.1～30 min 5%B。

1.4.2質(zhì)譜條件 毛細管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度設(shè)置500 ℃，脫溶劑氣流速800 L/h，亮氨酸腦啡肽(LE)進行質(zhì)量校對，正離子556.2771，負離子554.2615。質(zhì)譜正、負離子模式掃描，進樣量2.0 μL。

1.4.3方法學(xué)考察 質(zhì)量控制樣本(Quality Control，QC)由所有尿液樣品中取5 μL進行等量混合，渦旋混勻后置于混合儀2 000 r/min作用10 min混勻。4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取離心后的上清液混勻制得。儀器精密度考察：取QC樣品，按尿液樣品前處理項下方法制備尿液樣品，通過同一份樣品平行進樣6次，考察儀器的精密度(峰面積A、保留時間tR和質(zhì)荷比m/z)，當(dāng)RSD≤10%時，說明儀器精密度良好。 操作重復(fù)性考察： 取QC樣品，依據(jù)尿液樣品前處理項下方法，平行制備6份尿液樣品，每份樣品進樣一針，計算特征離子色譜峰保留時間、質(zhì)核比和提取離子色譜峰峰面積的RSD值，考察操作的重復(fù)性。當(dāng)RSD≤15%時，說明操作重復(fù)性良好。 系統(tǒng)穩(wěn)定性考察 ：取QC樣品，按尿液樣品前處理項下方法，平行制備多份尿液樣品，通過連續(xù)5次測定QC樣品，使系統(tǒng)達到平衡后，每隔10個樣品進樣一針，計算各個特征離子色譜峰保留時間、質(zhì)核比和提取離子色譜峰峰面積的RSD值，考察系統(tǒng)穩(wěn)定性。當(dāng)RSD≤20%時，說明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。

1.5數(shù)據(jù)處理 通過尿液樣本的UPLC Q-TOF/MS譜分析，獲得正、負離子檢測模式的UPLC Q-TOF/MS原始數(shù)據(jù)。釆用Waters公司UPLC Q-TOF/MS系統(tǒng)軟件，將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入操作軟件MassLynx V4.0中的MarkerLynx軟件包行數(shù)據(jù)預(yù)處理，該軟件包能夠自動完成濾除噪聲、峰識別、重疊峰解析、峰對齊、峰匹配等前處理程序。然后將矩陣經(jīng)過離子強度標(biāo)準(zhǔn)化后導(dǎo)入多變量統(tǒng)計軟件EZinfo(Waters Corporation，Milford，MA，USA)進行主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘判別分析FAB(OPLS-DA)篩選潛在生物標(biāo)志物。

1.6差異代謝物鑒定及代謝途徑分析 根據(jù)MSE數(shù)據(jù)采集到的碎片裂解信息及精確質(zhì)量數(shù)尋找可能的差異化合物，經(jīng)HMDB數(shù)據(jù)庫對差異化合物的離子質(zhì)和比進行篩選，表明可能的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)。最后結(jié)合代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫METLIN、KEGG、LIPID MAPS及Chempider進行搜索比對，鑒定篩選出的化合物結(jié)構(gòu)。將最終發(fā)現(xiàn)的差異化合物代入MetaboAnalyst網(wǎng)站用于整合代謝途徑分析。

2 結(jié) 果

2.1生物代謝產(chǎn)物分析結(jié)果

2.1.1抽動障礙組與正常組的PCA得分散點圖正、負離子模式下的樣本均在99%置信區(qū)間內(nèi)。在正、負離子模式下，抽動障礙組和正常組的樣本有分開的趨勢，說明疾病導(dǎo)致體內(nèi)代謝差異出現(xiàn)，且在正離子模式下差異更為顯著。見圖1及圖2。

圖1 基于UPLC Q-TOP/MS數(shù)據(jù)的正離子模式下PCA圖(1為正常組， 2為抽動障礙組)

圖2 基于UPLC Q-TOP/MS數(shù)據(jù)的負離子模式下PCA圖(1為正常組， 2為抽動障礙組)

2.1.2抽動障礙組與正常組的LoadingPlot圖LoadingPlot圖中的點為樣品中的組分產(chǎn)生的信號，越靠外的點表示樣品間含量差異越大。LoadingPlot中的標(biāo)志物在Scores Plot圖中相同位置的樣品中的含量是最高的。見圖3及圖4。

圖3 基于UPLC Q-TOP/MS數(shù)據(jù)的正離子模式下LoadingPlot圖

圖4 基于UPLC Q-TOP/MS數(shù)據(jù)的負離子模式下LoadingPlot圖

2.1.3抽動障礙組與正常組的S-plot圖 根據(jù)得出的OPLS-DA模型進一步篩選差異化合物，對變量進行標(biāo)準(zhǔn)化后分別得到正、負離子模式下的抽動障礙組和正常組尿液的S-plot圖，見圖5及圖6。圖中每個點代表一種特定的小分子代謝物，代謝物距離中心點的距離與該物在模型中的重要性呈正相關(guān)，即越偏離中心為潛在生物標(biāo)記物的可能性越大。計算OPLS-DA中的各化合物的VIP值，將符合VIP值>1且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的變量根據(jù)MSR得到的碎片信息及精確質(zhì)量數(shù)進行代謝物的鑒定，并通過數(shù)據(jù)庫搜索比對，篩選差異性小分子代謝物。正離子模式下差異物有對羥基苯乙酸、1-甲基組氨酸、4-吡啶氧酸、吲哚乙酸、4-吡啶氧酸、磷酸羥基丙酮酸、L-色氨酸、甘油磷酸乙醇胺等。負離子模式下差異物有N6-乙酰-L-賴氨酸、硫酸吲哚酯、胸腺嘧啶、甘露醇1-磷酸酯、黃原氨酸、皮質(zhì)酮、N-乙酰-7-O-乙酰神經(jīng)氨酸、17β-雌二醇3-硫酸鹽-17-(β-D-葡萄糖醛酸)等。

圖5 基于UPLC Q-TOP/MS數(shù)據(jù)的正離子模式下S-Plot圖

圖6 基于UPLC Q-TOP/MS數(shù)據(jù)的負離子模式下S-Plot圖

2.2代謝通路分析 將差異性小分子代謝物進行代謝通路分析，見圖7及圖8。圖中橫坐標(biāo)重要性，縱坐標(biāo)顯著性，越靠右、越靠上為越具有差異性的代謝通路。正離子模式下的代謝通路：抽動障礙患兒尿液代謝差異物主要涉及組氨酸代謝、半胱氨酸與蛋氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、維生素B6代謝、視黃醇代謝等(圖7從右至左，從上至下)。負離子模式下的代謝通路：抽動障礙患兒尿液代謝差異物主要涉及嘧啶代謝、嘌呤代謝、類固醇激素代謝(圖8從右至左，從上至下)。

圖7 正離子模式下代謝通路分析

圖8 負離子模式下代謝通路分析

3 討 論

抽動障礙病因復(fù)雜，機制欠明，其可能是神經(jīng)遺傳、神經(jīng)生物、免疫、心理、社會及環(huán)境、感染等因素單獨或聯(lián)合作用的結(jié)果。目前，從神經(jīng)生物學(xué)角度探討抽動障礙的發(fā)病是研究的主流，而近年來對其的基礎(chǔ)研究則逐漸進入瓶頸狀態(tài)。作為系統(tǒng)生物學(xué)最下游的“組學(xué)”，代謝組學(xué)定量測量生物樣本中全部代謝物的組成以及這些代謝物在內(nèi)外刺激下的動態(tài)改變[5]，是整體性研究生物體系功能變化的重要學(xué)科分支[6]，目前已被應(yīng)用于哮喘、肺炎、肥胖、新生兒腦炎等兒童疾病的早期診斷甚至個性化治療、疾病預(yù)后判斷等方面[7]。本研究首次選取抽動障礙患兒的尿液進行代謝組學(xué)分析，篩選出與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物有50余種，主要涉及氨基酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、類固醇激素代謝等代謝通路。氨基酸在體內(nèi)的代謝主要分為兩個方面：合成機體各組織的蛋白、酶和激素；通過脫氨作用、轉(zhuǎn)氨作用等，形成嘌呤、嘧啶、激素等在肝臟中轉(zhuǎn)化成尿素、尿酸等排出體外，或者轉(zhuǎn)變成糖、脂類或再合成某些非必需氨基酸，也可以經(jīng)過三羧酸循環(huán)氧化成二氧化碳和水，并釋放能量。若氨基酸代謝失調(diào)，其合成蛋白、糖、脂類及排出尿素等過程受阻，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)不能及時地合成利用或者有害物質(zhì)堆積，從而出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、精神運動發(fā)育遲滯、抽搐等。不飽和脂肪酸是人體必需的脂肪酸，在保持細胞膜的相對流動性、酯化膽固醇、降低血液黏稠度、改善血液微循環(huán)等方面均有重要的生理功能。不飽和脂肪酸代謝生成的脂質(zhì)調(diào)控介質(zhì)對炎癥的啟動、發(fā)展、消退均具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。適度的或可控的炎癥對于入侵病原微生物的清除以及受損組織的修復(fù)是必需的，然而過度的或不可控的炎癥往往會導(dǎo)致病理性炎癥反應(yīng)發(fā)生，大大提高了各種感染性和代謝性疾病的發(fā)病風(fēng)險。臨床中發(fā)現(xiàn)很多抽動障礙患兒在感染后出現(xiàn)抽動癥狀，或原有抽動癥狀加重或反復(fù)，推測其發(fā)病、病情反復(fù)與感染后的自身免疫功能改變相關(guān)。亦有研究證實抽動大鼠血清和大腦紋狀體組織中白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性細胞因子含量顯著增加[9]，而免疫功能改變、炎癥因子增加的原因可能就與不飽和脂肪酸代謝異常有關(guān)。不飽和脂肪酸還參與調(diào)節(jié)類固醇代謝的許多關(guān)鍵酶的表達。類固醇激素是一類脂溶性激素，具有調(diào)節(jié)糖代謝和水鹽代謝、抗炎、抗過敏等功能，在機體免疫調(diào)節(jié)等方面有明確的作用。通過尿液代謝組學(xué)研究所篩選的生物標(biāo)記物及代謝通路，從不同的角度影響著抽動障礙的發(fā)生、發(fā)展，是抽動障礙進一步發(fā)作機制研究、藥物開發(fā)的潛在靶點。

中醫(yī)古籍文獻中并無抽動障礙病名的記載，但以本病典型臨床表現(xiàn)進行分類,可以歸結(jié)為“慢驚風(fēng)”“痙病”“抽搐”等范疇[10]。宋代錢乙曾在《小兒藥證直訣》中提到:“凡病或新或久,皆引肝風(fēng),風(fēng)動而止于頭目,目屬肝,肝風(fēng)入于目,上下左右如風(fēng)吹,不輕不重,兒不能任,故目連劄也?！泵鳌ね蹩咸谩蹲C治準(zhǔn)繩·幼科·慢驚》云:“水生肝木,木為風(fēng)化,木克脾土,其癱瘓癥狀,兩肩微聳,兩手下垂,時腹動不已?！闭f明抽動障礙的發(fā)生與肝風(fēng)密切相關(guān)。肝風(fēng)病機復(fù)雜，機體諸臟諸腑均可致肝氣不疏，肝木失和，郁而化風(fēng)。王素梅教授從小兒“脾常不足，肝常有余”的生理特點出發(fā)，首先提出了抽動障礙的主要病機為脾虛肝亢，風(fēng)痰內(nèi)擾。小兒飲食不知自節(jié)，或恣食肥甘厚味，脾胃受損，失于健運，土虛木橫，肝風(fēng)內(nèi)動。故可見患兒形體消瘦、面色萎黃、食欲下降、大便干稀不調(diào)等。此外，王素梅教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗認為抽動障礙本源在肝，但基于中醫(yī)學(xué)“整體觀”思想，其辨證論治不可拘泥于肝、脾二臟，肺、腎二臟當(dāng)考慮其中。肺為華蓋，貯痰之器，外邪侵襲，首襲肺金，升發(fā)失司，外風(fēng)引動內(nèi)風(fēng)，風(fēng)痰膠結(jié)，流竄頭面四肢，發(fā)為抽動，此類患兒常為感冒后反復(fù)或再發(fā)性抽動，抽動部位以頭面部更為突出，如眨眼、挑眉、聳鼻、甩頭、扭脖等表現(xiàn)。抽動障礙病程較長時，王師多考慮與肝腎陰虛有關(guān)?！拔迮K之傷，窮必及腎”，肝氣不疏，肝病及腎，子病犯母；“肝常有余，腎常不足”，腎陰不足，水不涵木，母病及子，最終均導(dǎo)致肝陽上亢，陰虛陽浮，動風(fēng)諸癥。由此可見，“有諸內(nèi)，必形諸外”，肺、脾、腎三臟與肝臟之間相互影響，在內(nèi)機體臟腑有病，在外諸竅發(fā)為抽動。人體是一個內(nèi)外緊密聯(lián)系的整體，外界環(huán)境的變化直接或間接影響著機體相關(guān)臟腑，而臟腑之間也在相互影響。故而對于抽動障礙疾病的發(fā)生發(fā)展既要考慮到本臟，又要注意他臟，即中醫(yī)學(xué)“整體觀”思想。

代謝組學(xué)把生命體作為一個完整系統(tǒng)來研究，通過全面、定量測定機體體液內(nèi)源性小分子化合物來了解人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病中的變化過程，從而整體、動態(tài)揭示復(fù)雜性疾病的可能發(fā)生機制[11]。代謝組學(xué)的關(guān)鍵在于其整體性和動態(tài)性，這與中醫(yī)學(xué)的整體觀思維頗為相似。中醫(yī)學(xué)整體觀主要從宏觀和主觀上對機體生命活動、病理、生理進行認識，代謝組學(xué)則在微觀和客觀上對機體物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究，系統(tǒng)闡述機體受到病理、生理刺激后代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，揭示機體生命活動代謝本質(zhì)的科學(xué)實質(zhì)[12]。本研究從抽動障礙患兒的尿液中篩選出的主要生物標(biāo)記物包括氨基酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、類固醇激素代謝等代謝通路。氨基酸代謝以肝臟作為樞紐，機體內(nèi)多種糖、脂質(zhì)、激素、氨基酸、蛋白質(zhì)等代謝都是在肝臟中進行的[13]。這一代謝過程在理論上與中醫(yī)學(xué)中肺、脾、腎三臟與肝相互作用相似，脾臟在肺主治節(jié)作用下將飲食水谷轉(zhuǎn)化為糖、脂質(zhì)、激素、氨基酸、蛋白質(zhì)等精微物質(zhì)，后經(jīng)肝臟疏泄于全身，終至腎臟排泄,生成尿液。若“肝失疏泄”即機體內(nèi)多種糖、脂質(zhì)、激素、氨基酸、蛋白質(zhì)等代謝紊亂，則可影響到脾，導(dǎo)致飲食不調(diào)、腹脹便溏等“脾虛”癥狀；到肺，引發(fā)神疲乏力、易于感冒等“肺氣虛”癥狀；亦或到腎，出現(xiàn)面色晦暗、遺尿尿頻等“腎虛”癥狀。

綜上可知，抽動障礙是一種兒童和青少年時期發(fā)病的神經(jīng)精神類疾病，中醫(yī)病因病機上涉及多個臟腑的相互作用，但尚缺乏科學(xué)理論依據(jù)。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的研究組學(xué)，從整體上對生物體的功能水平進行探索，其方法的應(yīng)用為中醫(yī)學(xué)“整體觀念”的科學(xué)內(nèi)涵提供了研究依據(jù)[14]。利用代謝組學(xué)技術(shù)對尿液進行監(jiān)測，可以較為準(zhǔn)確地把握神經(jīng)系統(tǒng)中組織或細胞的代謝異常，為這類疾病的診斷、病理機制研究及治療帶來全面的信息和希望。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。