李 雪，鄭 振,2，洪光輝，徐 超，崔喜平,2，曾 崗，楊 磊

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 分析測試與計算中心，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

拉曼光譜具有高靈敏的分子差異識別能力，同時具備無需制樣、無需標(biāo)記、非接觸、無損傷、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，因此在材料表征分析方面占據(jù)了重要地位.單張散射拉曼光譜包含一個或多個特征峰，每個特征峰又包含峰位、峰強(qiáng)和峰寬等信息，可提供樣品微區(qū)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[1]、成分[2-4]、晶相和形態(tài)[5-6]等信息.而由多張光譜構(gòu)成的拉曼成像則可表征樣品微區(qū)空間上結(jié)構(gòu)、組分、物相、應(yīng)力等直觀分布信息.隨著激光光源的引入、探測器的改進(jìn)和計算機(jī)性能的提高，當(dāng)前拉曼光譜在生物、材料、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、食品等領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用[6].此外，將拉曼與其他儀器的聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于原位檢測，在大大提升檢測效率的同時，也拓寬了拉曼光譜儀應(yīng)用的范疇.因此，拉曼光譜儀已成為材料分析領(lǐng)域的常規(guī)配備.

InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀是英國Renishaw公司生產(chǎn)的高靈敏度、高度自動化的拉曼光譜分析儀器.設(shè)備特點(diǎn)包括：(1) 同時配備了從紫外到近紅外4個波長的激光光源，各激發(fā)波長采用分立光路設(shè)計，去除了各光源間的干擾，最大程度的提高了通光能力.(2) 切換波長時，激光光路采用計算機(jī)控制全自動切換，調(diào)節(jié)方便、快速.(3) 數(shù)據(jù)采集采用數(shù)字化共焦調(diào)節(jié)技術(shù)，極大降低光路調(diào)節(jié)難度，提高了數(shù)據(jù)采集效率.(4) 采用自動瑞利濾波片轉(zhuǎn)臺模塊和位置可調(diào)的透鏡組形式，實(shí)現(xiàn)多光路共存設(shè)計，具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、易于操作和維護(hù)等優(yōu)點(diǎn).

本文從設(shè)備自身特點(diǎn)出發(fā)，對設(shè)備使用方法、常見問題與解決方案、設(shè)備維護(hù)與管理經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)與分析.

1 工作原理

InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀主要由激光發(fā)生器、樣品光路、分光光路、光探測器、數(shù)據(jù)讀取系統(tǒng)和電腦控制系統(tǒng)構(gòu)成.圖1為該設(shè)備光路圖，激光器發(fā)射激光，進(jìn)入光譜儀內(nèi)部，通過反射鏡進(jìn)入顯微鏡物鏡，經(jīng)物鏡入射到樣品待測微區(qū).入射激光與樣品相互作用發(fā)生散射(包括瑞利散射和拉曼散射)，散射光再由顯微物鏡收集，經(jīng)濾光片濾除瑞利散射后得到拉曼散射光，在經(jīng)分光光路進(jìn)行分光，最后聚焦到電荷耦合元件(CCD)入口處進(jìn)行信號收集.最終CCD把所收集到的光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，在電腦中以光譜曲線的形式表示出來.

圖1 InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀光路圖

2 儀器的硬件設(shè)置

InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀是對InVia基礎(chǔ)型號的配置升級產(chǎn)品.光源從一個激光波長增加到4個激發(fā)波長，波段覆蓋了從紫外到近紅外光譜范圍，可選配光致發(fā)光附件、偏振附件、多功能變溫樣品臺附件，實(shí)現(xiàn)更多測試功能.根據(jù)不同試驗(yàn)的測試需求，可選擇合適的激發(fā)波長、濾波片、透鏡組、光柵等光學(xué)元件.因此，需要使用者充分了解儀器的主要部件、構(gòu)造及儀器自身的性能，熟練掌握各部件的正確使用.

3 儀器使用

3.1 開機(jī)與系統(tǒng)校準(zhǔn)

InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀的一般測試步驟如下：開機(jī)-校準(zhǔn)-放置樣品-聚焦樣品-試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置-測試和光譜收集-保存數(shù)據(jù).

開機(jī)順序：先打開光譜儀主機(jī)電源，再啟動軟件進(jìn)行自檢，待自檢完成后打開激光器，激光器預(yù)熱30 min后開始試驗(yàn)，設(shè)備不能頻繁的關(guān)閉啟動，相鄰兩次開啟時間應(yīng)大于1 h.

儀器的校準(zhǔn)和調(diào)試：拉曼光譜儀的日常校準(zhǔn)關(guān)系到樣品檢測的準(zhǔn)確性，由于實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等環(huán)境因素的變化，尤其是在切換不同波長的激光器，更換相應(yīng)刻線密度的光柵之后，儀器的靈敏度和準(zhǔn)確度會出現(xiàn)偏差，因此很有必要對光譜儀系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，對光路進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，使儀器的性能狀態(tài)達(dá)到最佳，從而得到高質(zhì)量的光譜數(shù)據(jù).

圖2是使用顯微共焦拉曼光譜儀內(nèi)置的單晶硅片對光譜儀系統(tǒng)校準(zhǔn)的結(jié)果：室溫條件下單晶硅的一階峰位為520.7 cm-1.

圖2 單晶硅的一階拉曼帶(520.7 cm-1)

3.2 樣品預(yù)處理

InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀可分析多種不同類型的樣品，包括固體樣本(粉末、塊體、纖維、薄膜、膠體)、液體、氣體等.但純金屬樣品不能使用拉曼檢測分析.

3.2.1 固態(tài)樣品預(yù)處理

固態(tài)樣品預(yù)處理與分析區(qū)域選擇：塊體樣品盡量選擇上表面平整的區(qū)域，保證表面光潔無污染.粉體樣品可以取少量粉末至于載玻片上，用另外一個載玻片壓平、壓實(shí).對于不規(guī)則形態(tài)固態(tài)樣品進(jìn)行拉曼掃描成像時，需將樣品固定在樣品臺上，最好物理接觸，必要時利用磁條、夾具、膠帶等工具進(jìn)行固定.樣品成像區(qū)域的表面要求水平且平整，確保在掃描成像過程中樣品位置的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性.上表面無法調(diào)節(jié)水平時，可借助三維樣品旋轉(zhuǎn)臺調(diào)節(jié)樣品上表面平度[7].

3.2.2 液體樣品預(yù)處理

無毒、無腐蝕、不易揮發(fā)的液體樣品直接在凹面載玻片上滴一滴，將激光聚焦在液滴中間位置進(jìn)行分析.易揮發(fā)或具有腐蝕性的液體樣品可以使用專用的液體樣品池進(jìn)行分析，也可以將液體裝在密封的玻璃容器中，將激光聚焦在液體中央，得到容器內(nèi)液體高質(zhì)量的拉曼光譜.相比專用的液體樣品池，此方法既方便測試，又可避免污染.

3.2.3 氣體樣品預(yù)處理

由于氣體的分子密度特別低，需要將氣體樣品沖入密閉容器，通過加壓方式增大單位體積的氣體分子密度，選用大功率的激光器，在測試時較大的激光功率參數(shù)，增大入射光的激光強(qiáng)度，以獲得高質(zhì)量的光譜數(shù)據(jù).

3.3 試驗(yàn)測試參數(shù)的優(yōu)化設(shè)置

選擇合適的試驗(yàn)測試參數(shù)可以提高拉曼光譜數(shù)據(jù)采集質(zhì)量和效率，常見參數(shù)設(shè)置包括：(1) 激光功率應(yīng)根據(jù)不同樣品相應(yīng)設(shè)定，對于性質(zhì)不穩(wěn)定的樣品、生物類樣品以及拉曼信號很強(qiáng)的樣品，應(yīng)選用小功率激光激發(fā).曝光時間通常設(shè)定10 s左右，可根據(jù)樣品情況和信號表現(xiàn)做適應(yīng)性調(diào)整.(2) 光譜采集范圍應(yīng)根據(jù)實(shí)際待觀測樣品特征峰峰位置，合理調(diào)整波數(shù)采集范圍，提高采集效率.為了在短時間內(nèi)得到最佳的拉曼光譜圖，可以先使用靜態(tài)取譜模式進(jìn)行預(yù)掃描，通過預(yù)掃描情況和測試需求平衡曝光時間、信號強(qiáng)度和測量精度等相關(guān)參數(shù)，最終進(jìn)行正式測試.

4 拉曼測試中常見問題及解決方案

4.1 光譜中的假峰

在測試中有時會出現(xiàn)一些位置隨機(jī)的尖銳的峰(如圖3所示)，這類假峰通常為宇宙射線.宇宙射線隨著曝光時間的增加出現(xiàn)概率增大，多次測量會發(fā)現(xiàn)尖銳的峰會消失，宇宙射線可通過配套軟件去除.如果假峰在相同位置重復(fù)出現(xiàn)，此時應(yīng)排除宇宙射線干擾，可能是外界干擾光源問題，如顯示器、熒光燈、氣體激光器的等離子線等，尤其是在使用長焦鏡頭時更為嚴(yán)重.此種情況可通過關(guān)閉室內(nèi)干擾光源，檢查光源的等離子濾波片等步驟來避免該類假峰的出現(xiàn).

圖3 宇宙射線

4.2 激光損壞樣品

激光功率過大可能會破壞樣品的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致樣品光解、變性或熱分解，造成樣品不同程度的損傷，此時測得的拉曼信號主要是樣品變性后的特征，而不是樣品本身的特征.因此，光譜采集完成后，應(yīng)在顯微鏡下對測量點(diǎn)進(jìn)行仔細(xì)檢查，圖4為激光損壞樣品的白光圖.為避免激光損傷樣品影響試驗(yàn)結(jié)果，測試時一般從小激光功率開始嘗試.對于不穩(wěn)定容易分解的樣品，在降低激光功率的同時，通過擴(kuò)束器擴(kuò)束方式，增大到達(dá)樣品的激光光斑尺寸，降低單位面積上激光功率密度.在獲得滿意光譜的前提下，應(yīng)盡可能使樣品上的激光功率密度最低.

圖4 激光損壞樣品白光圖

4.3 激光強(qiáng)度變化引起拉曼光譜特征改變

進(jìn)行顯微拉曼測試時，激光聚焦到樣品上的光束直徑在1～2 μm范圍內(nèi)，功率密度的增大會使測量點(diǎn)溫度升高.隨著激光強(qiáng)度的變大(但還未達(dá)到損壞樣品的程度)，有些樣品的拉曼特征峰雖然沒有增多或消失，但是特征峰的峰位、峰形和峰寬都產(chǎn)生了改變.產(chǎn)生這類現(xiàn)象的主要原因是：在激光照射下，待測區(qū)域溫度升高，樣品的成分和結(jié)構(gòu)雖然沒有改變，但是結(jié)構(gòu)參數(shù)如原子/離子間距和鍵角等都發(fā)生了微小變化，導(dǎo)致特征峰峰位發(fā)生偏移.例如，對碳納米管進(jìn)行拉曼表征時，隨著激光功率的提高，晶體溫度隨之升高，晶格發(fā)生膨脹，C—C鍵變長，相鄰原子間的相互作用力常數(shù)變小，導(dǎo)致所有振動模拉曼峰都向低波數(shù)移動.而且，碳納米管熱導(dǎo)率低，激光聚焦產(chǎn)生的熱能更容易聚集，熱效應(yīng)增加，峰位更容易發(fā)生偏移.激光聚焦熱效應(yīng)造成的拉曼峰偏移，雖然影響了拉曼的定性和定量分析，但卻有助于研究材料結(jié)構(gòu)變化特性，已有課題組對此進(jìn)行了專門研究，主要包括低維納米半導(dǎo)體材料如碳納米管[8]、量子點(diǎn)ZnO[9]、Si納米線[10]、氮化鎵納米棒[11]等.消除激光強(qiáng)度變化引起的拉曼光譜特征改變影響，可以從兩方面著手：一是使用低功率激光器進(jìn)行激發(fā)，二是使用恒溫設(shè)備(如InVia-Reflex自帶的變溫樣品臺就具有恒溫功能).

4.4 拉曼信號隱藏在強(qiáng)背底信號中

有些發(fā)熒光或磷光的樣品在拉曼測試時會產(chǎn)生很高的熒光背底，這是樣品的結(jié)構(gòu)特性將激發(fā)光轉(zhuǎn)化為熒光的緣故[12]，我們可以采取切換激光波長、光漂白、熒光猝滅、使用共焦模式等措施弱化熒光干擾.

4.4.1 改變激光波長

熒光具有固定的波長范圍，拉曼散射光的波長隨著激發(fā)光的波長的不同而有所變化，因此對有熒光效應(yīng)的樣品，可以選用紫外或近紅外光源激發(fā)來避開熒光干擾.圖5為分別使用532、785 nm激光獲取的有機(jī)凝膠拉曼光譜，可見圖5(a)有明顯的熒光效應(yīng)，圖5(b)中熒光效應(yīng)得到了有效抑制.

圖5 有機(jī)凝膠拉曼譜圖

4.4.2 熒光漂白

在拉曼光譜采集前，對于含有熒光成分的高分子或有機(jī)材料樣品，可先用激光對待測區(qū)域照射一段時間，使熒光基團(tuán)充分吸收光子，經(jīng)過幾個激發(fā)和發(fā)射周期后，樣品的熒光會被不同程度的消減，照射時間從幾秒到幾小時不等.WIRE測試軟件中有樣品光漂白測量模式,根據(jù)樣品和選用的激光情況進(jìn)行設(shè)置即可.

4.4.3 熒光猝滅

在被測樣品中加入猝滅劑，使樣品與猝滅劑發(fā)生反應(yīng)，降低熒光強(qiáng)度，由此可以達(dá)到抑制熒光背景的目的.

4.4.4 共焦模式

在WIRE測試軟件中選擇共焦模式下進(jìn)行測量，采取降低激光輻照區(qū)域方式，也會大大降低熒光背景.

4.5 光譜信噪比低

有時獲得的拉曼光譜信噪比低，使得拉曼特征峰不好辨識，發(fā)生此種情況先進(jìn)行以下排查：首先檢查樣品是否聚焦準(zhǔn)確，對于共焦顯微拉曼光譜儀，樣品不在焦平面上，會影響光譜信號強(qiáng)度，物鏡倍數(shù)越高影響越大.其次檢查顯微物鏡是否被污染，因?yàn)槲廴緯斐赏ü饴氏陆?，尤其要檢查短焦物鏡是否在之前的測試中被污染而沒有及時處理.最后檢查軟件是否設(shè)置了共焦模式.排除以上幾種情況，則應(yīng)歸結(jié)為樣品本身信號較弱，此時應(yīng)適當(dāng)提高激光功率或曝光時間，增加掃描次數(shù)，由此提高光譜信噪比，圖6是提高激光功率前后的拉曼光譜對比.

圖6 提高激光功率前后光譜對比

4.6 光譜信號太強(qiáng)

獲得拉曼光譜有時會出現(xiàn)“沖頂”或特征峰顯示不完整，圖7顯示了兩種典型飽和拉曼光譜，這是因?yàn)闄z測物質(zhì)的拉曼響應(yīng)超出了儀器能夠正常響應(yīng)的范圍.該情況可通過降低激光功率和減少曝光時間來避免.

圖7 兩種典型的飽和拉曼光譜

5 儀器的管理與維護(hù)

5.1 儀器維護(hù)

拉曼光譜儀屬于精密光學(xué)儀器，所在的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求防塵、恒溫和不潮濕.實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)全年24 h維持在20～27 ℃，相對濕度需低于50%.為防止外界振動源的影響，最好配有氣墊光學(xué)防震臺.設(shè)備不要靠近門、窗，以免震動或氣流對系統(tǒng)產(chǎn)生影響，更不能置于空調(diào)出風(fēng)口下，防止劇烈的溫度變化或灰塵污染.為方便信號弱的樣品的測試，實(shí)驗(yàn)室要具備一般暗室的功能.實(shí)驗(yàn)室管理員須根據(jù)天氣變化，利用空調(diào)、除濕機(jī)控制實(shí)驗(yàn)室溫度和濕度變化.要做好防塵工作，盡可能防止灰塵進(jìn)入光譜儀內(nèi)部，在打開光譜儀機(jī)蓋時，必須戴口罩和手套.需更換濾光片、光柵、透鏡組等光學(xué)元件時，須小心謹(jǐn)慎，保證其不受任何污染.灰塵、指印一旦觸及光柵表面，會損害光柵并造成反射率的下降.在更換光柵時，先取下單色儀保護(hù)外殼，插上光柵保護(hù)罩，并使保護(hù)罩不碰到光柵表面，分開時要格外的小心，安裝時如光柵表面不慎蹭有油漬或指紋，需要請專業(yè)人士在專業(yè)環(huán)境下清洗.若光學(xué)元件粘有灰塵，可用吸耳球吹掉或用干燥氮?dú)獯档?顯微鏡物鏡在使用過程中容易被污染和損壞，應(yīng)避免物鏡鏡頭與樣品直接接觸、摩擦或磕碰.揮發(fā)性樣品須密封，不可將物鏡直接暴露在可能產(chǎn)生揮發(fā)物質(zhì)的樣品下，以免造成污染.對于粉體、液體、軟膏、異形樣品可優(yōu)先選用同等放大倍數(shù)的長焦物鏡，物鏡一旦污染要及時處理.處理方式為：順時針旋轉(zhuǎn)物鏡，卸下后倒立輕置在實(shí)驗(yàn)臺上，用鏡頭紙或脫脂棉蘸取少量酒精，朝一個方向輕輕擦拭.激光器在同一天中不建議頻繁的關(guān)閉啟動，待一天的測試工作結(jié)束后再進(jìn)行關(guān)閉，以延長激光器的使用壽命.對于不經(jīng)常使用的紫外氣體激光器，建議定期的開機(jī)，使其工作1～2 h，保持激光腔體內(nèi)部氣壓平衡.光譜儀在工作一年以上之后，應(yīng)在光柵座上的絲杠、滑桿等機(jī)械傳動部件上滴一兩滴輕機(jī)油.如滴油過多，應(yīng)及時使用沒有棉絨的紙或布擦去[13].長期使用和氣候變化等的各種原因會導(dǎo)致儀器性能下降，特別是在供暖和空調(diào)開放前、后室溫一般會發(fā)生較大變化.此時需要對光譜儀的光路進(jìn)行必要的調(diào)整.

5.2 儀器管理

InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀售價為數(shù)百萬元，屬于大型分析測試儀器，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)管理.凡有意向進(jìn)行自主操機(jī)的人員，都須向設(shè)備管理中心提交培訓(xùn)申請表，經(jīng)儀器管理員審核后確定培訓(xùn)人員名單，符合培訓(xùn)要求的人員都要參加由實(shí)驗(yàn)室管理員組織的專業(yè)培訓(xùn)，通過儀器培訓(xùn)考核合格后方可上機(jī)使用儀器.

獲得自主操機(jī)權(quán)限的用戶，在儀器的操作權(quán)限方面實(shí)行分級,普通的用戶經(jīng)過培訓(xùn)后可進(jìn)行常溫下的單點(diǎn)拉曼光譜采集和拉曼掃描成像測試，高級用戶在普通用戶的基礎(chǔ)上，可進(jìn)行安裝變溫樣品臺、通循環(huán)水、加液氮、更換偏振附件或光致發(fā)光附件等操作，進(jìn)行原位變溫測試、偏振測試、光致發(fā)光測試等.此外還有一些特殊需求的用戶，如自己攜帶電化學(xué)工作站、高壓裝置等進(jìn)行原位測試且耗時較長的用戶，可在非工作時間自行預(yù)約機(jī)時進(jìn)行測試.不能自主操機(jī)的用戶，只能在工作時段進(jìn)行時段預(yù)約，由管理老師進(jìn)行測試.通過上述分級管理形式，既降低了人為造成的機(jī)器故障概率，同時延長了儀器有效測試機(jī)時，從而有效提高了儀器的運(yùn)維效率[14].所有用戶在操作過程中都應(yīng)牢記操作注意事項(xiàng)并謹(jǐn)慎操作，試驗(yàn)結(jié)束后整理好儀器實(shí)驗(yàn)臺桌面，確保衛(wèi)生整潔，帶走樣品及所有相關(guān)物品，不得隨意丟棄垃圾，有毒或有污染的特殊樣品要嚴(yán)格遵守樣品處理辦法，最后在實(shí)驗(yàn)記錄本上登記儀器使用起始時間、儀器使用后狀態(tài)、使用人等信息[15-16].為防止儀器設(shè)備電腦中毒，禁止使用外來U盤拷貝實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以采用空光盤刻錄或由相關(guān)負(fù)責(zé)老師使用E-mail發(fā)送.此外，設(shè)備管理人員應(yīng)定期檢查儀器狀態(tài)，確保儀器穩(wěn)定、高效率的運(yùn)行.

6 結(jié)論

顯微共焦拉曼光譜儀作為經(jīng)典的材料分析測試儀器，其工作原理、使用方法、常見問題和解決方案對于相關(guān)研究人員進(jìn)行拉曼測試具有很好的借鑒作用.本文以InVia-Reflex顯微共焦拉曼光譜儀為藍(lán)本，對上述關(guān)切點(diǎn)進(jìn)行了介紹，特別是激光損傷樣品、激光強(qiáng)度變化引起拉曼光譜特征改變、拉曼信號隱藏在強(qiáng)背底信號中等問題，進(jìn)行了詳細(xì)的成因分析，并給出了多種解決方案.此外，儀器的管理和維護(hù)對于設(shè)備的長期穩(wěn)定運(yùn)行尤為重要，本文對此也進(jìn)行了詳細(xì)闡述.