樓佳明, 郝樹林, 方佳琪, 杜曉華

(浙江工業(yè)大學(xué) 催化加氫中心，浙江省綠色農(nóng)藥清潔生產(chǎn)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省綠色農(nóng)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310014)

嗜球果傘素 (Strobilurin) 類化合物自1969 年Musílek 等[1]發(fā)現(xiàn)其具有殺菌活性以來，已開發(fā)出嘧菌酯、肟菌酯、吡唑醚菌酯等20 余種農(nóng)用殺菌劑，形成了一個(gè)重要的殺菌劑類別。此外，經(jīng)過不斷的結(jié)構(gòu)改造，部分Strobilurin 類化合物在除草[2]、殺螨[3]、抗病毒[4]及抗癌[5]等方面也具有很好的活性。本課題組設(shè)計(jì)合成了一系列含嘧啶硫醚的Strobilurin 類化合物，表現(xiàn)出了良好的殺螨活性，其中化合物 L1(圖式1) 對朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus幼蟲和卵的活性約為嘧螨酯的2 倍[6]

吡唑酰胺類殺菌劑是近年來迅速發(fā)展起來的一類琥珀酸脫氫酶抑制劑 (SDHI)，如氟唑環(huán)菌胺、苯并烯氟菌唑、聯(lián)苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、氟茚唑菌胺和吡噻菌胺等。

本文以含嘧啶硫醚的Strobilurin 類化合物L(fēng)1為基礎(chǔ)，通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接，將吡唑-4-甲酰胺通過苯環(huán)與嘧啶環(huán)連接，設(shè)計(jì)并合成了16 個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的Strobilurin 類化合物，并進(jìn)行了生物活性測試。目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)和合成路線分別見圖式1和圖式2。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance Ⅲ 500 MHz 核磁共振波譜儀(CDCl3或者DMSO-d6為溶劑，TMS 作為內(nèi)標(biāo))。全部試劑均為市售分析純化學(xué)試劑。柱層析硅膠(篩孔徑為45～75 μm) 產(chǎn)自青島海洋化工廠；5-氟-1, 3-二甲基-1H-吡唑-4-酰氟，純度98%，由紹興好潤有限公司提供。

1.2 化合物合成

1.2.1 中間體2 的合成通法 參考文獻(xiàn)[7-8]方法進(jìn)行。在50 mL 三口燒瓶中依次加入5.24 g(30 mmol) 1c 和15 mL 甲苯，在室溫?cái)嚢柘戮徛渭?7.8 g (150 mmol) 氯化亞砜和0.1 mL DMF，升溫回流4 h。待燒瓶內(nèi)再無氣泡產(chǎn)生時(shí)，減壓蒸餾出甲苯和過量氯化亞砜，得到4.7 g 2c 中間體。同法合成2a 和2b。2a～2c 均為棕色液體。

1.2.2 中間體5 的合成通法 參考文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。在1 L 三頸燒瓶中依次加入84 g (0.5 mol) 對硝基苯甲酸和500 mL 乙腈，在25 ℃下機(jī)械攪拌0.5 h 后，分批加入97 g (0.6 mol) 羰基二咪唑(CDI)，繼續(xù)室溫?cái)嚢? h，作為反應(yīng)液A 備用。

在另一個(gè)2 L 三頸燒瓶中依次加入119 g(0.7 mol)丙二酸單乙酯鉀鹽和500 mL 乙腈，于25 ℃下機(jī)械攪拌0.5 h，依次加入73 g (0.725 mol)三乙胺和69 g (0.725 mol) 無水氯化鎂，繼續(xù)室溫?cái)嚢? h 后，冷卻到0 ℃。將反應(yīng)液A 緩慢滴加入上述反應(yīng)體系，通過薄層色譜監(jiān)測至硝基苯甲酸原料點(diǎn)消失時(shí)，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為6～7，減壓蒸餾脫去大部分乙腈后，加入700 mL 水和1 L 乙酸乙酯進(jìn)行萃取，依次用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)層，減壓蒸餾脫去溶劑，得到117.16 g 對硝基苯甲酰乙酸乙酯 (化合物5)，黃色固體，收率為99 %，熔點(diǎn)72.5～73.8 ℃ (文獻(xiàn)[10]71～73 ℃)。

1.2.3 中間體6 的合成通法 參考文獻(xiàn)[11-13]方法進(jìn)行。在500 mL 三頸瓶中依次加入65 g (0.96 mol)乙醇鈉和270 mL 無水乙醇，在25 ℃下攪拌0.5 h，加入95 g (0.4 mol) 化合物5 和90 g (0.8 mol) 硫脲，加熱升溫至回流，通過薄層色譜 (V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 2 : 1) 監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束。減壓蒸餾脫去乙醇。加入1 000 mL 水溶解反應(yīng)液，用鹽酸調(diào)節(jié) pH=2～3，析出固體，抽濾，濾餅用500 mL水洗滌3 次，收集并烘干得到81 g 化合物6，黃色固體，粗產(chǎn)品未進(jìn)行提純投入下一步反應(yīng)。

1.2.4 中間體7 的合成通法 參考文獻(xiàn)[14-15]方法進(jìn)行。在250 mL 三頸瓶中依次加入20.0 g(80 mmol) 化合物6、15.5 g (112 mmol) 碳酸鉀和100 mLN,N-二甲基甲酰胺 (DMF)，室溫下攪拌0.5 h 后，加入11.6 g (96 mmol) 3-溴丙烯，繼續(xù)室溫?cái)嚢? h。冷卻至室溫，向反應(yīng)液中加入200 mL水，滴加鹽酸調(diào)節(jié)至中性，抽濾，將濾餅用100 mL 水洗滌3 次后烘干，得到21.8 g 化合物7a，不經(jīng)提純投入下一步反應(yīng)。

7a 和7b 表征數(shù)據(jù)如下。

7a：淡黃色固體，m.p. 191.1～192.5 ℃。1H NMR(600 MHz, DMSO),δ: 12.86 (s, 1H), 8.35 – 8.28 (m, 4H), 6.87(s, 1H), 6.05?5.95 (m,1H), 5.37(dd,J= 17.0, 1.4 Hz, 1H), 5.15(dd,J= 10.0, 1.4 Hz, 1H), 3.94 (d,J= 6.9 Hz, 2H)。HRMS:C13H11N3O3S[M?H+]，計(jì)算值288.044 8，測試值288.044 2。

7b：白色固體，m.p. 195.5～196.7 ℃。1H NMR(600 MHz, DMSO),δ: 12.82 (s, 1H), 8.37–8.28 (m, 4H), 6.91(s, 1H), 6.43 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 4.02 (t,J=7.5 Hz, 2H)。HRMS: C13H9Cl2N3O3S[M?H+]，計(jì)算值355.966 9，測試值355.966 1。

1.2.5 中間體8 的合成通法 參考文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行。在2 5 0 m L 三頸瓶中依次加入1 7.4 g(60 mmol) 化合物7a、16.8 g (300 mmol) 鐵粉、100.8 g (0.6 mol) 六氟異丙醇、60 mL 鹽酸和540 mL 水，室溫下反應(yīng)30 min，向反應(yīng)液中加入飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，用50 mL乙酸乙酯萃取3 次，合并有機(jī)相，用無水硫酸鎂干燥，抽濾除去固體殘?jiān)?，濾液減壓脫除溶劑，得到的粗產(chǎn)品，再經(jīng)硅膠柱層析 (V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 1 : 1) 分離純化后得到15.6 g 化合物8a，收率98 %。

8a 和8b 表征數(shù)據(jù)如下。

8a：黃色固體，m.p. 201.4～201.8 ℃.1H NMR (500 MHz, DMSO),δ: 12.44 (s, 1H), 7.80 (d,J= 8.0 Hz, 2H),6.63 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.98 (dd,J= 16.8,9.5 Hz, 1H), 5.96 (s, 2H), 5.34 (d,J= 17.1 Hz, 1H), 5.14 (d,J= 9.9 Hz, 1H), 3.91 (d,J= 6.2 Hz, 2H)。HRMS: C13H13N3OS[M?H+]，計(jì)算值258.070 7，測試值258.070 4。

8b：黃色固體，m.p. 190.2～192.4 ℃.1H NMR (600 MHz,DMSO),δ: 12.42 (s, 1H), 7.79 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 6.62 (d,J=8.3 Hz, 2H), 6.46 (s, 1H), 6.39 (t,J= 7.3 Hz, 1H), 5.74 (s, 2H),3.96 (d,J= 7.3 Hz, 2H)。HRMS: C13H11Cl2N3OS[M?H+]，計(jì)算值325.992 7，測試值325.991 1。

1.2.6 中間體9 的合成通法 參考文獻(xiàn)[17-18]方法進(jìn)行。在50 mL 三頸瓶中依次加入2.6 g (10 mmol)化合物8a、2.1 g (15 mmol) 碳酸鉀和10 mL DMF，在25 ℃下攪拌15 min 后，加入3.4 g (12 mmol)2 -溴甲基-α-甲氧基亞氨基苯乙酸甲酯，于85 ℃下攪拌8 h。向反應(yīng)液中加入30 mL 水，用乙酸乙酯 (30 mL × 3) 萃取，合并有機(jī)相，用50 mL 飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，無水硫酸鎂干燥，抽濾除去固體殘?jiān)瑸V液減壓脫除溶劑，得到粗產(chǎn)品，通過硅膠柱層析 (V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 2 : 1)分離純化，得到2.5 g 化合物9b，收率55 %。

9a～9d 表征數(shù)據(jù)如下。

9a：黃色油狀物，1H NMR (600 MHz, DMSO),δ: 7.89(d,J= 8.7 Hz, 2H), 7.66 (s, 1H), 7.53 – 7.47 (m, 1H), 7.37 –7.31 (m, 2H), 7.17 – 7.12 (m, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.67 (d,J=8.7 Hz, 2H), 6.07 – 5.95 (m, 1H), 5.76 (s, 2H), 5.32 (dd,J=17.0, 1.4 Hz, 1H), 5.29 (s, 2H), 5.14 – 5.10 (m, 1H), 3.85 (d,J= 6.8 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.61 (s, 3H)。HRMS:C25H25N3O4S[M+H+]，計(jì)算值464.163 9，測試值464.164 6。

9b：黃色油狀物，1H NMR (500 MHz, CDCl3),δ: 7.90 –7.80 (m, 2H), 7.53 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 7.46 – 7.38 (m, 2H),7.21 (dd,J= 7.5, 1.2 Hz, 1H), 6.68 (d,J= 8.6 Hz, 2H), 6.63 (s,1H), 6.08 ? 6.02 (m, 1H), 5.32 (s, 2H), 5.31 (dd,J= 16.95, 1.4 Hz, 1H)，5.12 (dd,J= 10.0, 1.0 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.86 (d,J= 6.9 Hz, 2H), 3.83 (s, 3H)。HRMS: C24H24N4O4S[M+H+]，計(jì)算值465.159 1，測試值465.157 4。

9c：淡黃色油狀物，1H NMR (600 MHz, DMSO),δ:7.86 (d,J= 8.7 Hz, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.48 – 7.44 (m, 1H),7.36 – 7.29 (m, 2H), 7.16 – 7.10 (m, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.62 (d,J= 8.7 Hz, 2H), 6.31 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 5.78 (s, 2H), 5.26 (s,2H), 3.90 (d,J= 7.5 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.59 (s, 3H)。HRMS: C25H23Cl2N3O4S[M+H+]，計(jì)算值532.085 9，測試值532.085 8。

9d：黃色油狀物，1H NMR (600 MHz, DMSO),δ: 7.85(d,J= 8.7 Hz, 2H), 7.54 (d,J= 7.2 Hz, 1H), 7.49 – 7.39 (m,2H), 7.24 (dd,J= 7.5, 1.0 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.62 (d,J=8.7 Hz, 2H), 6.32 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 5.79 (s, 2H), 5.25 (s, 2H),3.91 (s, 3H)，3.90 (d,J= 7.5 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H)。HRMS:C24H22Cl2N4O4S[M+H+]，計(jì)算值533.081 2，測試值533.081 2。

1.2.7 目標(biāo)化合物10 的合成通法 目標(biāo)化合物的合成采用了兩種反應(yīng)方式：一種是吡唑-4-甲酰氯中間體與胺反應(yīng)；另一種是吡唑-4-甲酰氟與胺反應(yīng)。其中10a～10h 和10m～10p 由吡唑-4-酰氯與胺反應(yīng)得到，10i～10l 由吡唑-4-酰氟與胺反應(yīng)得到。

1.2.7.1 吡唑-4-甲酰氯與胺反應(yīng) 參考文獻(xiàn)[19-20]方法進(jìn)行。以目標(biāo)化合物 (E) -2-甲氧基亞甲基-2-(6- (4- (5-氯-1, 3-二甲基-1H-吡唑-4-羰基氨基) -苯基) -2-烯丙硫基-4-氧基甲基) 苯乙酸甲酯 (10m) 的合成為例：將0.20 g (0.43 mmol)9a、0.12 g (0.65 mmol) 2c 和4 mL 乙腈加入到25 mL 三頸瓶中，加入0.07 g (0.86 mmol) 三乙胺作縛酸劑，在室溫下攪拌，通過薄層色譜 (V(乙酸乙酯) :V(石油醚) =1 : 1) 監(jiān)測，待原料點(diǎn)消失時(shí)向反應(yīng)液中加入30 mL 水，用乙酸乙酯 (30 mL × 3) 萃取。合并有機(jī)相，用50 mL 飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，無水硫酸鎂干燥，抽濾除去固體殘?jiān)?，濾液減壓脫除溶劑，得到粗產(chǎn)品，通過硅膠柱層析 (V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 1 : 1) 分離純化得到0.25 g 目標(biāo)化合物10m，收率92 %。

1.2.7.2 吡唑-4-甲酰氟和胺反應(yīng)[21]以目標(biāo)化合物 (E) -2-甲氧基亞甲基-2- (6- (4-(5-氟-1,3-二甲基-1H-吡唑-4-羰基胺基)-苯基) -2-烯丙硫基-4-氧基甲基) 苯乙酸甲酯 (10j) 的合成為例：將0.20 g (0.43 mmol) 9a、0.11 g (65 mmol) 5-氟-1, 3-二甲基-1H-吡唑-4-酰氟和4 mL 氯苯加入到25 mL 三頸瓶中，加入0.07 g (0.86 mmol) 三乙胺作縛酸劑，在140 ℃下攪拌8 h。向反應(yīng)液中加入30 mL 水，用乙酸乙酯 (30 mL × 3) 萃取。合并有機(jī)相，用50 mL 飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，無水硫酸鎂干燥，抽濾除去固體殘?jiān)?，濾液減壓脫除溶劑，得到粗產(chǎn)品，通過硅膠柱層析 (V(乙酸乙酯) :V(石油醚) = 1 : 1)分離純化得到0.20 g 目標(biāo)化合物10j，收率79 %。

1.3 生物活性測試

1.3.1 供試藥液的配制 將供試化合物用含0.1 %吐溫80 的蒸餾水溶液稀釋至試驗(yàn)所需的劑量(200 和500 mg/L)，備用。以蒸餾水為對照(CK)。

1.3.2 試驗(yàn)方法

1.3.2.1 浸葉法 采用文獻(xiàn)[22]的方法測定。供試靶標(biāo)為黏蟲Mythimna separata。將適量玉米葉在配好的藥液中充分浸潤后自然陰干，放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，接入黏蟲3 齡中期幼蟲，10 頭/皿，置于24～27 ℃觀察室內(nèi)培養(yǎng)，2 d 后調(diào)查結(jié)果。以毛筆觸動蟲體，無反應(yīng)視為死蟲。

1.3.2.2 噴霧法 采用文獻(xiàn)[22]的方法測定。供試靶標(biāo)為朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus和苜蓿蚜Aphis craccivoraKoch。分別將接有朱砂葉螨和苜蓿蚜的蠶豆葉片置于Potter 噴霧塔下噴霧處理，處理后將朱砂葉螨置于24～27 ℃觀察室內(nèi)培養(yǎng)，苜蓿蚜置于20～22 ℃觀察室內(nèi)培養(yǎng)，48 h 后調(diào)查結(jié)果。以毛筆觸動蟲體，無反應(yīng)視為死蟲。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的合成

所有目標(biāo)化合物都是通過吡唑羧酸 (或酰氟)、對硝基苯甲酸和2-溴甲基-α-甲氧基亞甲基苯乙酸甲酯經(jīng)過多步反應(yīng)得到。首先對硝基苯甲酸經(jīng)過羰基二咪唑活化和丙二酸單乙酯鉀鹽反應(yīng)得到對硝基苯甲酰乙酸乙酯，然后與硫脲在堿性條件下縮合得到6- (4-硝基苯基) -2-硫代-2, 3-二氫嘧啶-4(1H) -酮，室溫下與不同的鹵代溴丙烯進(jìn)行親核取代反應(yīng)，再經(jīng)過鐵粉還原得到對氨基苯基嘧啶中間體；另一中間體吡唑酰氯則是通過吡唑羧酸氯化得到。然后將對氨基苯基嘧啶中間體與2-溴甲基-α-甲氧基亞甲基苯乙酸甲酯經(jīng)過親核取代，再與吡唑酰氯 (或酰氟) 縮合得到目標(biāo)化合物。其結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)見表1 和表2。

表1 目標(biāo)10a～10p 的理化性質(zhì)及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Physico-chemical properties and HRMS data of compounds 10a-10p

續(xù)表1Table 1 (Continued)

表2 目標(biāo)化合物10a～10p 的 1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)Table 2 The 1H NMR and 13C NMR data of compounds 10a-10p

續(xù)表2Table 2 (Continued)

在合成中間體7 時(shí)，對于SH 和OH 兩個(gè)基團(tuán)之間的選擇性，根據(jù)硫原子和氧原子親核能力的差異，會與不飽和鹵代烴發(fā)生選擇性取代，通過文獻(xiàn)報(bào)道[15]和反應(yīng)條件的探索，最終選擇以DMF為溶劑、碳酸鉀為縛酸劑，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，高選擇地得到了中間體7，但若反應(yīng)溫度高于60 ℃，則嘧啶4 號位上氧原子與鹵代物的副反應(yīng)產(chǎn)物會明顯增加。

2.2 生物活性

生物活性普篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有目標(biāo)化合物均沒有表現(xiàn)出預(yù)期的殺菌和殺螨活性，在200 mg/L下其對黃瓜白粉病、黃瓜灰霉病、玉米銹病與水稻紋枯病的抑菌活性均小于50% (數(shù)據(jù)見附加材料電子版)；在500 mg/L 下對朱砂葉螨T. cinnabarinus和苜蓿蚜A. craccivora的殺蟲活性均為0。值得注意的是，所有目標(biāo)化合物對黏蟲均表現(xiàn)出一定的殺蟲活性，其中10h～10k 和10m～10p 在500 mg/L下的致死率達(dá)100 % (表3)。初步構(gòu)效關(guān)系表明：R1為甲基、R2為氟和氯時(shí)，對黏蟲的殺蟲活性較好；R1為三氟甲基和二氟甲基、R2為氫時(shí)，殺蟲活性有不同程度的減弱；多數(shù)情況下，R3為氫的活性高于R3為氯的活性，而Q 為肟醚乙酸酯 (Q2)時(shí)的活性高于Q 為甲氧基丙烯酸甲酯 (Q1) 時(shí)的活性。

表3 目標(biāo)化合物10a～10p 在500 mg/L 下對黏蟲殺蟲活性Table 3 Insecticidal activity of target compound 10a-10p against Mythimna separata at 500 mg/L

近年的研究發(fā)現(xiàn)，在嗜球果傘素類化合物中引入不同的結(jié)構(gòu)片段，所得化合物會具有一定的殺蟲活性[23-25]，如引入芐基腙片段會對黏蟲Mythimna separata、桃蚜Myzus persicae、小菜蛾P(guān)lutella xylostella和朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus表現(xiàn)出一定的殺蟲活性[26]，說明了嗜球果傘素類化合物在殺蟲活性方面也具有研究價(jià)值。本文設(shè)計(jì)并合成的目標(biāo)化合物對黏蟲具有殺蟲活性，可能是由于化合物的分子質(zhì)量增大使其物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致其對靶標(biāo)活性出現(xiàn)差異。

3 結(jié)論

本文以含嘧啶硫醚的Strobilurin 類化合物L(fēng)1為先導(dǎo)，通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接，合成了既含有SDHI 類藥效片段，又含有先導(dǎo)化合物Strobilurin結(jié)構(gòu)的新化合物，期望發(fā)現(xiàn)具有兩種作用機(jī)制的新的先導(dǎo)或高活性化合物，然而生物活性測定結(jié)果表明，目標(biāo)化合物并未表現(xiàn)出預(yù)期的殺菌、殺螨活性，但表現(xiàn)出一定的殺蟲活性，其中8 個(gè)化合物在500 mg/L 下對黏蟲的致死率達(dá)100 %，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。