羅長軍，熊 思，張 敬，孫一帆，蔣 磊，譚 寧

［1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院&柳鐵臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，廣西柳州 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院&柳鐵臨床醫(yī)學(xué)院超聲科，廣西柳州 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院&柳鐵臨床醫(yī)學(xué)院檢驗科，廣西柳州 530021；4.廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；5.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080］

提要：非編碼RNA 包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）等，均已被證明會影響心肌缺血再灌注損傷，同時，這些非編碼RNA 將有可能成為一個有吸引力的潛在治療靶點。在此，本文回顧了非編碼RNA 通過調(diào)控缺血預(yù)處理和缺血后處理影響缺血再灌注損傷的機制；同時探討缺血再灌注損傷后非編碼RNA 是如何介導(dǎo)線粒體功能從而影響心肌缺血再灌注損傷，及不同的非編碼RNA 之間如何發(fā)生相互作用從而調(diào)控心肌缺血再灌注損傷。本文將對上述非編碼RNA 在心肌缺血再灌注損傷中的作用機制進行歸納，以求在未來的研究工作中更好地理解非編碼RNA 在心血管疾病進展中的功能及機制。

缺血是指由于動脈血流受阻而導(dǎo)致組織供血不足，眾所周知，缺血會導(dǎo)致組織損傷，但對缺血所導(dǎo)致的相關(guān)疾病的分子病理學(xué)進行深入研究后，人們發(fā)現(xiàn)缺血所導(dǎo)致的損傷并非如此單一，目前有充分證據(jù)支持，除缺血過程外，缺血后血流再灌注可以意外地促進和加重組織損傷及壞死，從而產(chǎn)生了“缺血/再灌注（缺血再灌注）損傷”的概念［1］，這種損傷在對氧高度依賴的心肌細胞尤為敏感。在缺血過程中，無氧代謝占據(jù)優(yōu)勢從而導(dǎo)致細胞內(nèi)pH 值下降，而作為防止氫離子積聚的保護機制，Na+/H+交換泵會泵出額外的氫離子，而導(dǎo)致鈉離子大量流入［2］。此外，缺血減少了三磷酸腺苷的儲存，導(dǎo)致三磷酸腺苷酶失活，活性鈣釋放減少，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制鈣離子的再吸收。這一級聯(lián)事件導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生，從而導(dǎo)致細胞損傷或死亡。另一方面，缺血會引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的暴露，隨后會進一步導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰，三磷酸腺苷合成受損。所有這些機制都會導(dǎo)致細胞及組織損傷，其程度取決于血流阻塞的程度和缺血時間的長短［3］，而缺血引起的生化系統(tǒng)紊亂可通過血液供應(yīng)重建后氧氣和其他血液成分的運輸而加劇，進而引發(fā)一系列事件，使組織損傷加劇［4］。在這些機制發(fā)生的過程中，非編碼RNA 發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用，其中非編碼RNA 主要包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA），本文將對上述非編碼RNA 在心肌缺血再灌注損傷中的作用機制進行歸納，以求在未來的研究工作中更好地理解非編碼RNA 在心血管疾病進展中的功能及機制。

1 微小RNA 在缺血再灌注損傷中的作用

miRNAs作為一種大小約為18～24個核苷酸的小調(diào)控轉(zhuǎn)錄物，調(diào)節(jié)與細胞生命功能、應(yīng)激反應(yīng)、增殖和凋亡等相關(guān)的關(guān)鍵功能［5］。而在缺血再灌注損傷中，miRNAs 的作用主要是通過介導(dǎo)與壞死、凋亡、炎癥、纖維化和新生血管生成相關(guān)的關(guān)鍵信號通路［6］。由于缺血再灌注是因為組織供氧量的短暫減少引起的繼發(fā)于急性動脈閉塞，隨后迅速恢復(fù)血液流動，這會引發(fā)一連串的心肌細胞功能損傷和死亡。最初的缺血引起組織缺氧損傷，隨后第二種損傷模式以再灌注后活性氧爆發(fā)為主要特征，同時伴隨著活性氮和繼發(fā)性炎癥爆發(fā)以及線粒體功能失調(diào)［7-9］。在缺血之前，有幾種潛在的治療方式可通過靶向miRNA 減少心肌梗死的面積：缺血預(yù)處理（IPC）與遠程缺血預(yù)處理（RIC）。缺血預(yù)處理是通過誘導(dǎo)激發(fā)自身保護機制而保護心臟的一種形式，特指在心肌長期缺血前進行亞損傷性缺血事件發(fā)作，此后，當(dāng)真正發(fā)作缺血性事件時，心肌細胞損傷會因為早期“預(yù)處理”而顯著減弱［10］?，F(xiàn)有研究表明，在體外有兩種主要miRNA 介導(dǎo)缺血預(yù)處理：miRNA-21 和miRNA-451［11］。小鼠和大鼠模型中，miRNAs 被證明具有明顯的心肌保護及對抗缺血損傷作用，其中miRNA-451的心臟保護作用是通過減少氧化應(yīng)激信號通路的激活，而miRNA-21 的保護作用被認為是通過調(diào)節(jié)PDCD4 而介導(dǎo)心肌細胞凋亡的減少從而保護心肌［12-13］。

遠程缺血預(yù)處理是一種類似于缺血預(yù)處理的心肌保護，但是在遠程缺血預(yù)處理中，亞損傷性缺血事件遠離心臟本身，因此機制更為復(fù)雜［14］。目前研究表明，這種機制包括3 個步驟：在遠程缺血點激活信號通路隨后通過某種方式影響缺血后心臟［11］。目前還沒有報道明確的miRNA可通過該種方式在缺血部位的表達從而形成遠程調(diào)節(jié)。但是，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)心肌組織中有miRNA 可通過血液循環(huán)的作用作為遠程缺血預(yù)處的信號傳感器發(fā)揮作用［15］。學(xué)者Li 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-144 在心肌缺血再灌注后的血漿和心臟中的表達明顯改變，并發(fā)揮著重要保護作用，其機制可能就包含遠程信號傳感作用。還有許多其他miRNAs 在動物模型中被證明具有不同的心肌缺血后保護作用，例如，在永久性冠狀動脈閉塞模型中，miRNA-21、miRNA-144 或miRNA-126 的改變會導(dǎo)致梗死面積增加，表明這些miRNAs 的保護作用［17-19］。

目前，已有報道證實miRNAs 可通過介導(dǎo)葡萄糖缺乏途徑（OGD）從而影響心肌細胞功能，例如miRNA-132 在心肌細胞株H9c2 細胞的糖代謝，而調(diào)控miRNA-132 后可影響葡萄糖缺乏途徑從而誘導(dǎo)這些心肌細胞的生命活性和凋亡激活。此外，miRNA-132 還能通過調(diào)節(jié)p21、p27 和p27 的表達從而阻止G0/G1 細胞凋亡及細胞周期蛋白D1表達，達到減輕葡萄糖缺乏途徑誘導(dǎo)的心肌損傷的目的。此外，F(xiàn)OXO3A 已被證實為miRNA-132 的直接下游靶基因。綜上所述，miRNA-132 可靶向抑制FOXO3A 從而保護心肌細胞在葡萄糖缺乏途徑誘導(dǎo)下的損傷，而葡萄糖缺乏途徑是缺血再灌注損傷的主要通路之一，miRNA-132 有望在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。

2 長鏈非編碼RNA 在缺血再灌注損傷中的作用

有證據(jù)表明，調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)可能是LncRNA 抑制細胞凋亡的一個重要機制［21］，目前已有報道LncRNAs 參與了調(diào)控心肌缺血再灌注損傷中線粒體分裂［22-23］。例如，CARL（心臟凋亡相關(guān)lncRNA）能靶向干擾miRNA-539 功能，而miRNA-539 自身可干擾prohibitin2 蛋白發(fā)揮關(guān)鍵功能，prohibitin 家族蛋白主要位于線粒體內(nèi)膜，其作用是充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和脂質(zhì)調(diào)節(jié)線粒體代謝的支架［24］，過表達心肌組織中prohibitin2 能通過減少線粒體分裂和細胞凋亡從而有效抑制大鼠心肌缺血再灌注的梗死范圍。因此，CARL可以通過干擾miRNA-539 而維持prohibitin2 功能從而減輕缺血再灌注后心肌細胞凋亡［22］。同時，該團隊還報道了另一個線粒體動力學(xué)相關(guān)lncRNA-MDR，同樣能在缺氧條件下調(diào)控心肌細胞線粒體的分裂，MDRL 通過發(fā)揮內(nèi)源性海綿體作用吸附miRNA-361，從而抑制線粒體降解和細胞凋亡達到減輕缺氧復(fù)氧的心肌細胞損傷［23］。另有學(xué)者報道，最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤中的LncRNA-HOTAIR（HOX 反義鏈上的基因間RNA），Li 等［25］發(fā)現(xiàn)抑制它的表達后可以加劇氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2 細胞凋亡，而過表達HOTAIR 后則可起到保護心肌細胞應(yīng)激損傷的作用，HOTAIR 作用機制被認為與miRNA-125/MMP-2蛋白軸有關(guān)。另一方面，Meng 等［26］學(xué)者還證明了HOTAIR 可以通過激活細胞保護激酶AMPKα 從而抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的H9c2 細胞凋亡。

在lncRNA 生物學(xué)的主要分子作用機制中，現(xiàn)有證據(jù)表明其ceRNA 作用（或miRNA 海綿）作為關(guān)鍵作用方式介導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷，前文已提及相關(guān)的ceRNA-miR?NA-mRNA 相互作用參與調(diào)節(jié)缺血再灌注心肌細胞損傷。通常情況下，一個LncRNA 可拮抗一個或多個miRNAs，而miRNAs 則通過經(jīng)典作用方式抑制下游靶基因的功能，從而促進mRNA 降解或阻礙翻譯來抑制靶基因的表達達到調(diào)控細胞功能的目的［27］。因此，lncRNA 的增加有望增加其靶基因的蛋白質(zhì)表達，除非在某些特殊情況下miRNA可增強基因表達。但有趣的是，我們注意到心肌細胞中的lncRNA 可能影響具有類似生物學(xué)效應(yīng)的多個靶點（例如MALAT1 和Gas5）［28-29］，在這種情況下，我們推測最終的細胞功能狀態(tài)變化會由其具體影響的不同路徑而決定［30］。另一方面，一些LncRNAs 被證明與兩個miRNAs 相互作用對細胞有沖突的影響（例如H19）。這仍需學(xué)者進一步研究其具體功能變化［31-32］。

目前已有一系列體內(nèi)及體外實驗明確了LncRNAs 在心肌細胞缺血再灌注過程中的功能，這些研究表明，LncRNAs 明確參與缺血再灌注損傷后的細胞壞死、凋亡、以及自噬，而這些LncRNAs 既可能發(fā)揮細胞保護作用也可能加重細胞損傷。值得一提的是LncRNA 的缺血再灌注研究絕大部分均是通過小動物模型進行驗證，而LncRNA測序結(jié)果顯示LncRNA 在物種中保守性較差，除了少數(shù)LncRNA，如MALAT1［33］。盡管如此，越來越多的研究表明LncRNA 的功能不僅僅是由一級核苷酸序列決定，其二級結(jié)構(gòu)和時空表達模式也極為關(guān)鍵。因此，盡管序列保守性不一定高度一致，但一個LncRNA可能因為其二級結(jié)構(gòu)和時空表達模式類似而在不同物種間發(fā)揮相似的功能［34］。

3 環(huán)狀RNA 在缺血再灌注損傷中的作用

最近發(fā)現(xiàn)一種新穎的circRNA——circRNA-ACR：Au?tophagy Related RircRNA 具有心臟保護功能［35］，ACR 可通過與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員Dnmt3B結(jié)合從而阻斷Dnmt3B介導(dǎo)的Pink1 啟動子甲基化。因此，ACR 可避免Pink1 啟動子的降解，從而影響FAM65B 的Pink1 依賴性甲基化。Pink1 定位于細胞質(zhì)，作為線粒體功能的相關(guān)激酶并維持線粒體的穩(wěn)態(tài)［36-37］。更關(guān)鍵的是，Pink1 可通過磷酸化作用調(diào)控其下游靶基因［38］。在心肌缺血再灌注期間，自噬活性的改變可能會起到心臟保護作用，有研究證實ACRPink1-FAM65B 可通過級聯(lián)反應(yīng)而抑制自噬，并為治療心肌缺血再灌注損傷的潛在分子機制提供了新的線索［39-40］。

研究還報道了一個線粒體分裂和凋亡相關(guān)的cir?cRNA-MFACR：Mitochondrial Fission and Apoptosis-Related CircRNA（也稱mm9-circ-016597），miRNA-652-3p 有15 個疑似結(jié)合位點與其相關(guān)，當(dāng)它被敲除的時候，海綿體吸附作用消失，miRNA-652-3p 的表達顯著增加，從而能抑制由核基因MTP18編碼的MTP18（線粒體蛋白，18 kDa）的功能［41］。而線粒體膜蛋白MTP18 在各種物種細胞的線粒體分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用［42-43］。MFACR 所參與的CircRNAmiRNA-mRNA 級聯(lián)反應(yīng)能有效減少線粒體分裂和凋亡，保護心肌細胞和心臟組織而減輕缺血再灌注損傷。還有一項研究報道表明，通過經(jīng)典模型過氧化氫處理乳鼠心肌細胞或使小鼠心肌模擬缺血再灌注引起的損傷時，位于ncx1 基因轉(zhuǎn)錄本所轉(zhuǎn)錄的circRNA-circNCX1 在氧化應(yīng)激期間表達量顯著增加，而circNCX1 可通過海綿體吸附作用抑制miRNA-133a-3p 表達量，從而減弱促進細胞凋亡的核基因CDIP1對于心肌細胞缺血再灌注時的負性調(diào)控作用，因此，circNCX1-miRNA-133-3p-CDIP1 軸可能在氧化誘導(dǎo)下發(fā)揮重要作用從而調(diào)控心肌細胞凋亡［44］。此外，學(xué)者Wang 等［45］最近的一項研究表明，在心肌缺血再灌注損傷中，circRNA DLGAP4 可通過靶向miRNA-143 來調(diào)節(jié)BCL2 從而減輕心肌細胞凋亡。

本綜述回顧了幾種非編碼RNA，主要是miRNA、Ln?cRNA 以及circRNA 在心肌缺血再灌注損傷時所發(fā)揮的功能及其作用機制，例如miRNA 主要通過影響缺血預(yù)處理或缺血后處理的關(guān)鍵通路；LncRNA 主要通過影響miRNA或直接通過高級空間結(jié)構(gòu)作用于mRNA 影響心肌缺血再灌注損傷，且線粒體功能是其主要介導(dǎo)位點；而circRNA則主要通過miRNA 的海綿體吸附作用從而影響miRNA 下游靶基因發(fā)揮其調(diào)控作用。除了上述的功能及機制以外，心肌缺血再灌注相關(guān)的非編碼RNA 仍有大量的未知需要我們闡明，而毫無疑問的是，非編碼RNA 對于減輕心肌缺血再灌注損傷，具有重要的治療靶點潛力，學(xué)者們對其進一步研究有望為該領(lǐng)域新藥研發(fā)打下堅實基礎(chǔ)。