馬 瑞，崔曉萍，李祖昂，鄭 娜，肖新春

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、FSH＞40 IU·L-1和雌激素水平降低，并伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀[1-3]的一種疾病。目前該病的發(fā)病率占1%～3%[4]，并處于不斷上升的狀態(tài)。導(dǎo)致POF的病因復(fù)雜多樣，大體上可將其分為遺傳因素、環(huán)境因素、代謝因素、自身免疫因素、身心應(yīng)激因素、醫(yī)源性因素等幾大類，該疾病在人體研究困難且卵巢組織難以獲取，為進(jìn)一步研究該疾病的治療方案，給更多患者帶來福祉，許多學(xué)者通過建造動(dòng)物模型來深入研究該疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療，本文現(xiàn)將能搜集到的造模方法匯集在一起，旨在為更多研究者建立動(dòng)物模型提供便捷。

1 動(dòng)物模型建立方法

1.1 化學(xué)藥物POF造模法

隨著惡性腫瘤、免疫性疾病化療后患者存活率的提高，加之在女性發(fā)病逐漸年輕化，藥物作用機(jī)體后帶來的生殖問題也不斷涌現(xiàn)，其中以環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、順鉑、雷公藤多甙片和氫化可的松對(duì)卵巢功能影響較為明顯。為提高治療后育齡期婦女的生育功能和生活質(zhì)量，多數(shù)學(xué)者選擇用化療藥物來構(gòu)建POF的動(dòng)物模型。常用藥物及方法如下。

1.1.1 CTX 作為常用化療藥物之一的CTX，具有高度卵巢毒性作用，可作用于細(xì)胞DNA而引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂，以致DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成被抑制[5]，損傷性腺組織。Plowchalk[6]等和Meirow[7]等研究發(fā)現(xiàn)，CTX對(duì)各級(jí)卵泡均有破壞作用，其中以原始卵泡破壞最為嚴(yán)重。張娟[8]等將家兔隨機(jī)分組，分別給家兔注射50 mg·kg-1的CTX 1 d（A組）、50 mg·kg-1連續(xù)注射2 d（B組）、按照8 mg·kg-1連續(xù)注射14 d（首日注射50 mg·kg-1）（C組）三種方法建立模型。經(jīng)注射CTX后，模型組體重與對(duì)照組相比明顯下降，并出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，血清學(xué)檢測、病理學(xué)和形態(tài)學(xué)的改變。其中A組雌激素水平在7 d達(dá)高峰，后整體呈下降趨勢，但在21 d出現(xiàn)小幅度升高，原因可能由于A組劑量所致卵巢損傷是可逆的，卵巢功能沒被徹底破壞。B組雌二醇（E2）值則持續(xù)下降，且在注射CTX后第35天降至最低，比較接近臨床上POF患者低雌激素表現(xiàn)；C組體重下降迅速，且病死率高，不適宜用作造模。最終得出給家兔注射50 mg·kg-1的CTX，連續(xù)2 d是建立POF模型最佳劑量的結(jié)論。

趙雪靜[9]給2～3月齡SD大鼠連續(xù)腹腔注射不同濃度［10、20、30 mg·（kg·d）-1］的CTX 20 d，給藥結(jié)束后高、中劑量組大鼠的體質(zhì)量明顯下降，動(dòng)情周期紊亂，動(dòng)情期及動(dòng)情前期減少，總周期數(shù)較少，主要表現(xiàn)為持續(xù)的動(dòng)情間期；卵巢濕重減輕并出現(xiàn)病理組織、血清學(xué)的改變。低劑量組大鼠的病理學(xué)和形態(tài)學(xué)表現(xiàn)則不明顯，血清學(xué)及動(dòng)情周期與對(duì)照組相比無改變。各組大鼠其他器官均無損傷，也保證了造模過程中大鼠生命體征的平穩(wěn)，最終得出CTX20mg·（kg·d）-1的實(shí)驗(yàn)劑量最符合臨床POF的內(nèi)分泌特征的結(jié)論。

1.1.2 雷公藤多甙片 雷公藤多甙是提取自中藥雷公藤的一種物質(zhì)，目前臨床多用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病等自身免疫性疾病，該藥長期服用對(duì)卵巢功能會(huì)有所損害。郝娟等[10]用生理鹽水配制的雷公藤多甙片懸浮液給大鼠灌胃50mg·（kg·d）-1，連續(xù)14d，自灌藥第4天起，每日進(jìn)行陰道涂片、觀察動(dòng)情周期，2d測1次體質(zhì)量，給藥結(jié)束后24h，大鼠給予10%水合氯醛麻醉后眶周取血，處死大鼠后觀察到子宮和卵巢的質(zhì)量均較對(duì)照組明顯減輕，卵巢病理組織學(xué)和血清學(xué)檢測發(fā)生改變；子宮黏膜層明顯變薄，腺體減少，肌層變薄；動(dòng)情周期延長，出現(xiàn)持續(xù)的動(dòng)情間期或動(dòng)情期延長至3d。

1.1.3 順鉑 順鉑是常用的腹腔化療藥物，其作用類似于烷化劑，主要通過干擾腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制、與核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合來達(dá)到治療腫瘤的作用[11]，在抗腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)機(jī)體全身系統(tǒng)造成損害。齊聰[12]給6周齡大鼠腹腔注射2mg·（kg·d）-1順鉑×5d，總劑量為10mg·kg-1（A組）、4mg·（kg·d）-1×5d（B組）、2mg·（kg·d）-1×10d（C組），B、C兩組總劑量均為20mg·kg-1，D組僅注射生理鹽水2mL·d-1×10d。其中順鉑溶液（0.5mg·mL-1）經(jīng)生理鹽水稀釋為總量2mL一次性腹腔注射。給藥后觀察到大鼠卵巢的病理學(xué)及血清學(xué)檢測發(fā)生改變，劑量大的B、C組更為明顯，得出了隨著劑量的增大、給藥時(shí)間的延長，藥物對(duì)卵巢功能的損傷越大的結(jié)論。張麗娟等[13]分別給大鼠腹腔注射4mg·kg-1和6mg·kg-1順鉑注射液，每周1次，連續(xù)2周，第2次注射7d后取材。給藥過程中觀察到大鼠體重有不同程度減輕、行動(dòng)緩慢，喜蜷縮、弓背，體毛晦暗無光澤，高劑量組更為顯著。除此之外，還觀察到大鼠卵巢組織的形態(tài)學(xué)、病理學(xué)，血清學(xué)檢測發(fā)生變化。兩組大鼠的動(dòng)情周期出現(xiàn)紊亂，其中低劑量組間期延長，動(dòng)情期縮短，停藥后可有所恢復(fù)；而高劑量大鼠則長期停在動(dòng)情間期，停藥后不會(huì)恢復(fù)，最終得出高劑量組模型更為理想的結(jié)論。

1.1.4 氫化可的松 氫化可的松為腎上腺皮質(zhì)激素類藥，常用于腎上腺皮質(zhì)功能減退癥的替代治療及先天性腎上腺皮質(zhì)功能增生癥的治療，也可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性發(fā)熱、痛風(fēng)、支氣管哮喘、過敏性疾病及嚴(yán)重感染和抗休克等治療。其不良反應(yīng)除了出現(xiàn)庫欣綜合征外，還可對(duì)女性生殖方面產(chǎn)生不利影響。江瑜[14]等對(duì)2~3月齡雌性大鼠的后腿肌肉注射氫化可的松（10mg·mL-1），每日注射1次，連續(xù)14d，給藥后大鼠動(dòng)情周期紊亂，病理組織及血清學(xué)檢測均明顯改變。王凱[15]等給8~9周齡的雌性大鼠后下肢肌肉注射氫化可的松［32mg·（kg·d）-1］，每日1次，連續(xù)12d，給藥后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮、怕冷，毛無光澤、拱背少動(dòng)，飲食減少，體重減輕，反應(yīng)遲鈍等癥狀，動(dòng)情間期持續(xù)或延長，卵巢指數(shù)降低，血清生殖激素異常，其中促卵泡成熟激素（FSH）/黃體生成激素（LH）在停止造模第1天升高，第15天略有下降。

化學(xué)藥物造模法成本低，操作簡單、方便，容易實(shí)施，建立的模型也更為穩(wěn)定，可控性強(qiáng)，適宜劑量保證了動(dòng)物生命體征的穩(wěn)定，目前深受國內(nèi)研究者們的歡迎，其中CTX應(yīng)用最為廣泛。

1.2 放射療法POF造模法

放射療法是利用大量的輻射所產(chǎn)生的能量可破壞細(xì)胞的染色體，使細(xì)胞停止生長，從而消滅可快速分裂和生長的癌細(xì)胞，常作為直接或輔助治療癌癥的方式。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，放療在破壞癌細(xì)胞時(shí)也會(huì)損傷各級(jí)卵泡，其中以原始卵泡最為敏感。賀宇恒等[17]用RS2000系列生物輻射儀對(duì)小鼠進(jìn)行不同程度（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy）的單次全身輻照，劑量率為1.2Gy·min-1，距離為50cm，7d后取材，可觀察到小鼠卵巢的損傷程度隨著輻射劑量的增加逐漸加重，并得出4Gy劑量是造成小鼠POF的最低適宜劑量。為進(jìn)一步研究出小鼠造模的最佳時(shí)間，又觀察4Gy劑量時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)（14d、21d、28d和42d）小鼠的表現(xiàn)：隨著輻照時(shí)間延長，小鼠動(dòng)情周期的動(dòng)情后期和動(dòng)情間期在總周期所占比例延長，動(dòng)情期逐漸縮短（正常規(guī)律情況下動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間10～14h，動(dòng)情間期持續(xù)時(shí)間60～70h，動(dòng)情期持續(xù)時(shí)間9～15h），42d表現(xiàn)為持續(xù)動(dòng)情間期；卵巢的病理學(xué)、形態(tài)學(xué)改變及血清學(xué)檢測指標(biāo)變化更加明顯。與0Gy組比較，7d時(shí)原始卵泡數(shù)下降約85%，14d下降約92%，42d時(shí)卵巢內(nèi)僅剩閉鎖卵泡，最后得出小鼠接受單次全身4Gy輻照后7～14d能夠建立POF理想模型的結(jié)論。該造模方法操作簡單，病死率低，容易成功，可重復(fù)性強(qiáng)，但與化學(xué)藥物相比較，該方法成本相對(duì)較高，并在干預(yù)過程中對(duì)其他器官也會(huì)產(chǎn)生損傷，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。

1.3 自身免疫性POF造模法

1.3.1 透明帶（ZP）3多肽（pZP3） ZP是包圍在哺乳動(dòng)物的卵細(xì)胞的一層支持其生長的糖基化基質(zhì)，其中ZP3為其中之一。1992年Rhim等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠和人ZP3蛋白具有67%的同一性，且pZP3可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗ZP3抗體，與卵巢ZP3結(jié)合引起自身免疫性卵巢炎，從而引起類似于人類POF的表現(xiàn)。朱玲[19]等將由2 mg ZP3+5 mL三蒸水配成0.4 mg·mL-1的溶液與費(fèi)氏完全佐劑按1∶1比例配成的免疫試劑（0.15 mL）對(duì)小鼠雙腳后掌進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，2周后將用2 mg ZP3+5 mL三蒸水配成0.4 mg·mL-1的溶液與弗氏不完全佐劑按1∶1比例配制成免疫強(qiáng)化試劑（0.15 mL）進(jìn)行腹腔注射，5周后同法再次加強(qiáng)免疫。在免疫后的第35天，模型組小鼠出現(xiàn)易激惹、大便干結(jié)，動(dòng)情周期紊亂，在第4周、第8周時(shí)卵巢生長卵泡比率降低、應(yīng)用免疫組化、Western Blot檢測的GDF-9、Smad2蛋白表達(dá)明顯下降。王佩娟等[20]將由弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）配成含有5 mg·mL-1結(jié)核桿菌H37Ra（美國BD Difco公司）的完全弗氏佐劑和用ZP3330-342氨基酸系列的多肽片段配制成1 mmol·mL-1的溶液按等比例混合配成免疫乳化劑，在第0天和第14天分別用0.1 mL乳化劑皮下注射B6AF1小鼠的腳掌和尾根。進(jìn)行免疫后小鼠精神狀態(tài)明顯煩躁易怒、精神萎靡不振、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)遲緩，脾臟指數(shù)升高，胸腺、卵巢、子宮指數(shù)均下降。上述兩種造模雖不太一樣，但其大體方向一致，都可建立免疫性動(dòng)物模型，該技術(shù)目前在國內(nèi)較為成熟，但所需成本相對(duì)較高，并且在溶液配置過程中需要精準(zhǔn)無誤。

1.3.2 胸腺切除 胸腺屬于中樞免疫器官，主要參與T細(xì)胞的分化和發(fā)育，切除易感品系新生期第2～5天小鼠的胸腺可發(fā)生類似人類自身免疫性卵巢疾病的典型卵巢病理學(xué)改變。涂曉娟等[21]摘除出生3 d以內(nèi)雌性小鼠的胸腺，術(shù)后5周血清FSH、LH升高，伴E2下降，卵巢組織中出現(xiàn)較明顯的炎細(xì)胞浸潤及卵泡閉鎖，并且從術(shù)后5周開始，血清中炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）降低，而干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-21（IL-21）升高，顯示造模成功。該方法對(duì)于切除胸腺及縫合的技術(shù)要求較高，難度大，所致動(dòng)物病死率高，目前尚難推行。

1.4 代謝性POF造模法

Guerreero等[22]研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖及其代謝產(chǎn)物過多堆積可導(dǎo)致育齡期女性原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕及POF。包秀芳[23]連續(xù)給9～12周齡的大鼠喂35%半乳糖食物（模型組）和25%的標(biāo)準(zhǔn)食物（對(duì)照組），80 d后發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠體內(nèi)半乳糖含量較對(duì)照組增加，并出現(xiàn)卵巢萎縮、重量減輕，卵巢組織中卵泡發(fā)育受阻。何連利[24]通過給小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖200 mg·（kg·d）-1，6周后發(fā)現(xiàn)小鼠精神萎靡，飲食減少，體毛晦暗無光澤，卵巢系數(shù)降低，單位卵巢面積內(nèi)卵泡數(shù)、黃體數(shù)減少，閉鎖卵泡數(shù)增多，F(xiàn)SH升高，E2及抗繆勒管激素值（AMH）降低。這兩種方法均表明通過增加動(dòng)物體內(nèi)半乳糖的含量，導(dǎo)致代謝物出現(xiàn)蓄積，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體代謝出現(xiàn)較為嚴(yán)重的紊亂可以建立POF的動(dòng)物模型。該方法操作簡便，無須特殊儀器，目前臨床應(yīng)用也較為廣泛。

1.5 過度瘦身POF造模法

高灑灑等[25]、王艷平等[26]給予模型組大鼠每日左旋肉堿灌胃600 mg·kg-1、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（跑臺(tái)坡度為0°，跑速為28 m·min-1，20 min·d-1，運(yùn)動(dòng)6 d，休息1 d）、50%日常攝食量，且灌胃在運(yùn)動(dòng)前30 min進(jìn)行。造模過程中發(fā)現(xiàn)干預(yù)4周和干預(yù)8周的大鼠體質(zhì)量均下降，且干預(yù)8周的大鼠體質(zhì)量下降更為明顯，較原始值下降了23%，較空白組下降了35%，而干預(yù)4周的大鼠體質(zhì)量較原始值下降了17%，較空白組下降了26%。給予恢復(fù)飲食后，造模4周的大鼠體質(zhì)量恢復(fù)至空白組的98%；造模8周的大鼠體質(zhì)量恢復(fù)為空白組的83%。模型組大鼠除體質(zhì)量下降外，還有精神不振，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，煩躁不安，拱背易驚，體毛粗糙無光澤，對(duì)疼痛敏感，動(dòng)情周期紊亂，血清學(xué)檢測發(fā)生改變，表示造模成功。這是近年來新出現(xiàn)的一種造模方法，成本經(jīng)濟(jì)、耗時(shí)也短。

1.6 基因敲除POF造模法

基因敲除是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的分子生物學(xué)技術(shù)。目前研究較多的就是敲除PTEN和FOXL2基因。PTEN基因是通過影響脂質(zhì)磷酸酶的活性，抑制PI3K-Aktm TOR通路，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和能量代謝[27]，Reddy[28]發(fā)現(xiàn)，小鼠去除PTEN基因2 d時(shí)無明顯原始卵泡，同時(shí)，F(xiàn)SH和LH明顯升高，對(duì)照組則仍有62.9%的卵泡為原始卵泡；Pisarska等[29]研究FOXL2基因在鼠卵巢中卵泡發(fā)育和成熟階段的表達(dá)，提出野生型FOXL2的顯性負(fù)突變可能會(huì)增加中、小卵泡中StAR和其他卵泡分化基因的表達(dá)，從而加速卵泡發(fā)育，導(dǎo)致休眠卵泡的初始募集增加出現(xiàn)POF表型。Uda等[30]通過發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)FOXL2基因被破壞后，小鼠顆粒細(xì)胞停止發(fā)育，卵母細(xì)胞逐漸閉鎖，8周時(shí)原始卵泡池耗竭，16周時(shí)卵巢無正常的卵母細(xì)胞和卵泡，致使小鼠不孕，表明了FOXL2基因與卵泡的發(fā)育有關(guān)。本方法有助于我們了解某特定基因?qū)τ赑OF的作用，但一種模型僅能研究一兩個(gè)基因的作用，而POF的發(fā)生并非幾種基因改變所致，對(duì)于其病因?qū)W的研究有所限制，并且操作起來難度大、成本高。

1.7 應(yīng)激型POF造模法

應(yīng)激是指機(jī)體在遇到各種不利的刺激后，會(huì)通過調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)而產(chǎn)生一系列反應(yīng)，會(huì)擾亂生理或心理狀態(tài)?，F(xiàn)代社會(huì)中女性正承擔(dān)著越來越多的責(zé)任及壓力，機(jī)體常處于應(yīng)激狀態(tài)，常出現(xiàn)月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)、不孕等疾病。阿卜力孜·克熱木等[31]通過給予大鼠濕寒和強(qiáng)光環(huán)境，即溫度為（7±1）℃、濕度為（85±5）%，每日晚8點(diǎn)至早8點(diǎn)持續(xù)同等強(qiáng)度光照（40W日光燈直射，距離2.5 m），早8點(diǎn)至晚8點(diǎn)放置黑暗環(huán)境，避免一切光照，連續(xù)20周后，觀察到大鼠血E2、β-EP水平降低FSH、LH的水平顯著升高，卵巢組織中未見明顯的初級(jí)、次級(jí)卵泡，偶見原始卵泡，囊狀閉鎖卵泡增多，空泡樣變化多，說明卵巢水腫嚴(yán)重，間質(zhì)腺增生且伴有纖維化，得出持續(xù)慢性應(yīng)激可誘發(fā)POF。該方法經(jīng)濟(jì)易行，容易操作，但造模周期相對(duì)較長，需要對(duì)大鼠生活的環(huán)境嚴(yán)格調(diào)控，也是近年來比較熱的一種造模方法。

綜上所述，各類造模方法各有特點(diǎn)，本文通過查閱近10年文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前應(yīng)用最為廣泛的是CTX、雷公藤多甙及注射ZP3建立的POF模型，其中CTX和雷公藤多甙兩種模型建立時(shí)更經(jīng)濟(jì)便捷，且用時(shí)短，建立的模型更穩(wěn)定。應(yīng)激和過度瘦身造模是近年來新出現(xiàn)的方法，操作簡單，更切合臨床中當(dāng)今廣大女性的生活方式。而基因敲除、胸腺切除的造模方法在操作過程中難度極大，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件要求也高，目前采用的較少?？傊⒗硐氲膭?dòng)物模型有諸多困難，研究者在具體實(shí)驗(yàn)研究時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)條件選擇合適的模型則非常重要，期待日后有更多對(duì)于POF的病因、病機(jī)及治療的完善的研究。