辛正琦， 何會(huì)流

(1.西南大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院 b.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400715； 2.重慶城市管理職業(yè)學(xué)院， 重慶 401331)

0 引言

顛茄(AtropabelladonnaL.)是茄科顛茄屬多年生草本植物，整株均可入藥，藥材氣微辛，味微苦.在臨床上，顛茄的次生代謝物被廣泛作為一種抗膽堿類藥物，靶向作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng)，在市場(chǎng)上缺口較大，商業(yè)價(jià)值高[1].在中國(guó)，顛茄主要種植在山東、上海和浙江等國(guó)內(nèi)沿海大中城市和地區(qū)，而上述區(qū)域由于地理因素影響土地鹽漬化程度廣泛，對(duì)顛茄的生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)了很大的危害.

鹽脅迫下植物生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)被抑制，一般認(rèn)為是由于鹽脅迫導(dǎo)致了光合作用效率的降低而造成的.鹽脅迫能夠破壞PEP羧化酶和RuBP羧化酶的活性，從而造成葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)受損，不利光合色素的合成與積累，進(jìn)而影響光合作用的進(jìn)行[2].植物將自然界的光能轉(zhuǎn)化為自身的化學(xué)能，主要是利用光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)發(fā)揮的作用，其中光系統(tǒng)Ⅱ表現(xiàn)出對(duì)NaCl脅迫更加敏感，故常作為研究人員研究植物響應(yīng)鹽脅迫的重點(diǎn)[3].李陽(yáng)等[4]發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫處理后，棉花葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、qP、Fv/Fm等均顯著下降，表明鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致PSⅡ受損，從而影響植物的光合作用.

油菜素內(nèi)酯(brassionolide，BR)作為一種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)逆境脅迫響應(yīng)等方面具有重要作用，因此在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用[5].2,4-表油菜素內(nèi)脂(EBR)是常見(jiàn)的人工合成高活性油菜素內(nèi)酯類似物.科學(xué)研究已經(jīng)表明，BR可以穩(wěn)定保持植物植株內(nèi)的葉綠素濃度處于較高水平，從而有效提高植物葉片的光合速率[6]，且EBR對(duì)鹽脅迫下刺槐和香樟[7]、垂絲海棠[8]等植物的光合能力具有積極的調(diào)節(jié)作用.但是目前關(guān)于外源EBR是否能調(diào)節(jié)鹽脅迫下顛茄的光合能力尚未有報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)以顛茄為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在室內(nèi)模擬NaCl脅迫環(huán)境，設(shè)置4種不同濃度的外源EBR，研究在NaCl脅迫下外源EBR對(duì)顛茄的葉綠素含量及熒光特性的影響，探討EBR在鹽脅迫下對(duì)顛茄幼苗光化學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，為拓展對(duì)EBR生物學(xué)功能的認(rèn)知以及農(nóng)林栽培中改善鹽害問(wèn)題提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)于西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行，顛茄(AtropabelladonnaL.)種子購(gòu)自湖南省永州市.篩選飽滿、健康的種子，用0.05 mol·L-1赤霉素浸泡2 d，再均勻?yàn)⒃跐駶?rùn)的濾紙上，使其萌發(fā).種子萌發(fā)約2周后，移栽到裝有土、珍珠巖、蛭石(比例為3∶1∶1)的盆缽中生長(zhǎng)，每個(gè)處理組6缽，每缽2、3株幼苗.待顛茄幼苗株高達(dá)到10 cm左右時(shí)進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn).

取一定量NaCl固體，溶于稀釋十倍的MS營(yíng)養(yǎng)液中，配置為100 mmol·L-1NaCl溶液，每7 d澆灌一次土壤以模擬鹽脅迫環(huán)境條件.不同濃度的EBR處理采用對(duì)顛茄葉面噴施的方式，每日固定時(shí)間噴灑.本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置6個(gè)處理組：CK(0 mmol·L-1NaCl+H2O)、T0(100 mmol·L-1NaCl+H2O)、B1(100 mmol·L-1NaCl+0.05 mg·L-1EBR)、B2(100 mmol·L-1NaCl+0.1 mg·L-1EBR)、B3(100 mmol·L-1NaCl+0.2 mg·L-1EBR)、B4(100 mmol·L-1NaCl+0.4 mg·L-1EBR).每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理第5 d，10 d，15 d時(shí)，進(jìn)行下列指標(biāo)的測(cè)定.

1.2 相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1 葉片光合色素的測(cè)定

參考張憲政[9]的試驗(yàn)方法，步驟略微有改動(dòng):用電子天平準(zhǔn)確稱取0.2 g顛茄葉片，置于試管中，加入10 mL的無(wú)水乙醇、丙酮混合液(比例為1∶1)，密封避光保存48 h后，至所有顛茄葉片完全呈現(xiàn)白色，可用于后續(xù)的測(cè)定.取3 ml上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其663、645、470 nm處的吸光值，再利用公式可得出顛茄葉片中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量.

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)通過(guò)PAM-2100便攜式葉綠素?zé)晒鈨x檢測(cè).測(cè)定之前，顛茄植株須預(yù)先進(jìn)行2～3 h的黑暗處理.測(cè)定于較暗的環(huán)境中進(jìn)行，選擇暗適應(yīng)完全，顛茄完整、平展的葉片，放在儀器上進(jìn)行最小熒光(F0)、非光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)(NPQ)、光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)(qP)、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子產(chǎn)量(Yield)、最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)的測(cè)定，每個(gè)處理組進(jìn)行3次重復(fù)平行試驗(yàn)，用3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值進(jìn)行最終的數(shù)據(jù)分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncon多重比較及差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片光合色素含量的影響

植物葉片中光合色素含量是體現(xiàn)植物光合能力的一項(xiàng)主要指標(biāo)，環(huán)境因子的變化也會(huì)導(dǎo)致光合色素含量的改變，從而影響植物光合作用的進(jìn)行[10].鹽脅迫處理后，各個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)，顛茄葉中光合色素含量變化如表1所示，均明顯降低，在15 d時(shí)，T0組葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別較對(duì)照組下降了38.483%，31.807%，36.259%，37.471%.表明鹽脅迫抑制了顛茄葉片光合色素的合成.

為研究鹽脅迫條件下，外源EBR對(duì)顛茄葉光合色素水平的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)應(yīng)用不同濃度的EBR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與T0組相比，外源EBR的參與使葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素的含量都保持在較高的水平上，且在相同處理天數(shù)時(shí)，隨著EBR濃度的提高，處理效果呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì).處理到10 d時(shí)，B3組中顛茄葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素的含量相較于脅迫組(T0)分別升高了28.841%、30.753%、29.322%、45.635%.第15 d時(shí)，當(dāng)EBR濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，即B2組中顛茄葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量相較于T0組分別升高了32.785%、42.049%、35.779%、22.794%，總體效果最好，但光合色素含量仍顯著低于對(duì)照組.說(shuō)明適宜濃度的外源EBR可以減少鹽脅迫對(duì)顛茄光合性能的損害，提高光合色素含量.

表1 不同處理方式對(duì)NaCl脅迫下顛茄葉光合色素含量的影響

2.2 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.2.1 對(duì)暗適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以直接在生長(zhǎng)中的植物葉片上檢測(cè)，而不影響植物的正常生長(zhǎng)，并且可以在短時(shí)間內(nèi)得到大量信息，用以分析植株的光合結(jié)構(gòu)及其功能.因此，葉綠素?zé)晒鈪?shù)是理想的光合作用探針，被廣泛應(yīng)用于植物抗逆抗病研究[11].初始熒光參數(shù)F0表示光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量.植物葉片中的葉綠體類囊體薄膜遭到損傷時(shí)，F(xiàn)0的值會(huì)增大(見(jiàn)圖1).

圖1 不同濃度EBR處理對(duì)NaCl脅迫下顛茄葉片暗適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

如圖1(a)所示，在各個(gè)處理階段內(nèi)，相較于CK組，T0組中鹽脅迫處理均導(dǎo)致F0值大幅增加.表明顛茄光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心遭受鹽脅迫的破壞，光合作用因而遭到抑制.結(jié)果還表明：在各個(gè)處理時(shí)間內(nèi)，外源EBR的加入緩解了F0的升高.處理第5 d時(shí)，隨著EBR濃度的升高，F(xiàn)0逐漸降低.處理后期(10～15 d時(shí))，B2—B4組F0值相較于T0組均顯著降低.表明長(zhǎng)期鹽脅迫處理時(shí)，較高濃度的EBR能夠顯著降低F0，有效緩解鹽脅迫造成的PSⅡ反應(yīng)中心損傷和光抑制.

Fv/Fm表示暗適應(yīng)樣品中光系統(tǒng)Ⅱ的最大量子產(chǎn)量，F(xiàn)v/Fm在植物葉片受到明顯光抑制時(shí)會(huì)顯著降低，是一個(gè)反映植物光系統(tǒng)損傷程度的常用指標(biāo)[12].如圖1(b)所示，鹽脅迫處理后，隨著時(shí)間的增加，F(xiàn)v/Fm逐步降低.處理第5、10和15 d時(shí)，T0組Fv/Fm相較于對(duì)照組分別下降了7.602%、13.254%和16.510%.而不同濃度外源EBR的應(yīng)用，均提高了鹽脅迫下Fv/Fm值.其中，B2和B3處理組的作用效果較好，且二者幾乎不存在顯著性差異.以上結(jié)果表明，NaCl脅迫能夠引起Fv/Fm顯著降低，顛茄葉片光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的量子產(chǎn)量逐漸下降，顛茄葉片光合能力可能受到了抑制.而噴施0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1外源EBR，則可以有效緩解這一現(xiàn)象，從而提高顛茄的光合效率.

2.2.2 對(duì)光適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)qP，代表的是光系統(tǒng)Ⅱ中的色素所吸收的光能被用于光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞的效率，qP值越大，表明光系統(tǒng)Ⅱ中的電子傳遞活躍度就越高[13].非光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)NPQ，表示在綠色植物進(jìn)行光合作用時(shí)，由熱耗散所產(chǎn)生的熒光猝滅，反映了植物把過(guò)剩的光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力[14](見(jiàn)圖2).

圖2 不同濃度EBR處理對(duì)NaCl脅迫下 顛茄光適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

從圖2(a)中可知，NaCl脅迫條件下，qP顯著降低，且隨著處理天數(shù)的增多，降低幅度也越來(lái)越大.說(shuō)明當(dāng)植物遭受鹽脅迫時(shí)，qP值會(huì)顯著降低，且隨著脅迫持續(xù)時(shí)間的增長(zhǎng)影響也越來(lái)越大.不同濃度EBR應(yīng)用后，在各處理組中qP值均有增加.如圖2(b)所顯示，在鹽脅迫條件下，T0組NPQ較CK組明顯升高，且在整個(gè)處理期內(nèi)持續(xù)升高.15 d時(shí)，T0組中NPQ達(dá)到最高，比CK組明顯提高了16.724%.經(jīng)不同濃度EBR處理后，NPQ值顯著減小.除第5 d以外，NPQ隨外源EBR濃度增加呈現(xiàn)先降后升的現(xiàn)象.到15 d時(shí)，當(dāng)EBR濃度為0.1mg·L-1時(shí)NPQ值最小，與對(duì)照組并無(wú)顯著性區(qū)別，相較于T0組降低了12.715%.表明在鹽脅迫期間，葉片光能熱耗散量加大，葉片可能利用非光化學(xué)猝滅提高熱耗散能力來(lái)消耗過(guò)多的激發(fā)能以適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境條件.0.1 mg·L-1EBR能夠顯著消除鹽脅迫下NPQ的升高，降低了鹽脅迫對(duì)光合機(jī)構(gòu)造成的危害.

Yield代表的是植物葉片中光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際量子產(chǎn)量，也反映了光系統(tǒng)Ⅱ在部分反應(yīng)中心關(guān)閉的情況下，植物葉片實(shí)際的光能捕獲效率[15].如圖2(c)所顯示的，在不同時(shí)期內(nèi)，CK組Yield數(shù)值的高低變動(dòng)不大，在鹽脅迫條件下，T0組Yield遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CK組.外加不同濃度EBR處理后，Yield均有不同程度的提高.總體來(lái)說(shuō)，在各處理時(shí)段內(nèi)，B2和B3處理效果更為理想.以上結(jié)果表明，鹽脅迫導(dǎo)致了顛茄葉片的原初光能捕獲效率大大降低，EBR的加入可以有效減弱這一現(xiàn)象，在EBR濃度為0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1時(shí)效果最好.總之，EBR的加入能夠有效增加植物吸收的光能中用于光化學(xué)的比例，加快鹽脅迫下顛茄葉片PSⅡ中的電子傳遞速率，從而提高了植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力.

3 討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，會(huì)遭受到不同的環(huán)境脅迫，例如鹽堿脅迫、過(guò)度紫外線輻射、低溫、高溫、干旱、重金屬和機(jī)械損傷等等，從而產(chǎn)生了一系列復(fù)雜的防護(hù)機(jī)制，來(lái)識(shí)別和適應(yīng)自身所處的自然環(huán)境[16-17].所以，認(rèn)識(shí)植物生長(zhǎng)發(fā)育中的各種生理過(guò)程和防護(hù)機(jī)制對(duì)植物科學(xué)發(fā)展有著重大的意義[17].鹽是植物生長(zhǎng)過(guò)程中常常遇到的非生物脅迫因子，也是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝的一種非常重要的因素[18-19].

光合作用作為綠色植物機(jī)體內(nèi)主要的新陳代謝過(guò)程，能夠影響植物生根發(fā)芽、開花結(jié)果、產(chǎn)出及對(duì)周圍環(huán)境的適應(yīng)性.光合色素作為植物光合作用的載體，其含量的多少體現(xiàn)出植物進(jìn)行光合作用效率的高低，直接影響光合速率和光合產(chǎn)物的積累[20].環(huán)境因子的改變也會(huì)引起光合色素含量改變.本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致顛茄幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素降解加速或合成遭到抑制，特別是葉綠素b對(duì)脅迫反應(yīng)更為敏感.光合色素含量顯著降低，從而影響了光合作用的正常進(jìn)行.這和鹽脅迫下半夏[21]、玉米[22]和沙棗苗木[23]的研究基本一致.光合色素主要存在葉綠體的基粒中，層層堆疊的基粒片層是類囊體的重要組成部分，在本試驗(yàn)中，EBR能夠有效促進(jìn)顛茄葉片光合色素含量增加，表明外源EBR有助于緩解鹽脅迫對(duì)葉綠體膜系統(tǒng)的傷害，提高光合色素的合成效率，減少光合色素的分解，減緩葉綠體老化、基粒片層數(shù)目減少，保證葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，有效提高了顛茄的光合效率及其耐鹽性.這和EBR處理紫花苜蓿[24]、樟樹[25]后的結(jié)果一致.

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是植物體內(nèi)葉綠素含量變化的重要指標(biāo)，它和植物光合中的各項(xiàng)化學(xué)反應(yīng)變化有關(guān)聯(lián)，涉及多種光合作用信息，非常容易受到植物逆境脅迫的影響.由于葉綠素的含量也影響著PSⅡ的光能利用效率[26]，所以鹽脅迫在影響植物葉綠素含量的同時(shí)，也對(duì)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生了相應(yīng)的影響.鹽脅迫條件下，植物葉綠體光合機(jī)構(gòu)會(huì)遭到損傷，PSⅡ光能利用率減小且PSⅡ的潛在活性被抑制[27].本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫使得顛茄葉片F(xiàn)v/Fm降低，意味著發(fā)生了光抑制.F0升高、qP、Yield降低，表明葉綠體類囊體薄膜和PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生了損害，電子傳遞功能被嚴(yán)重抑制.應(yīng)用一定濃度的外源EBR后，F(xiàn)v/Fm、Yield和qP明顯增加，F(xiàn)0降低，說(shuō)明外源EBR可以減弱鹽脅迫條件下顛茄幼苗葉片光合機(jī)構(gòu)和PSⅡ反應(yīng)中心受到的影響，從而提高葉片中電子傳遞速率，改善光合作用效果.同時(shí)，鹽脅迫導(dǎo)致NPQ顯著升高，這是由于逆境脅迫使得PSⅡ反應(yīng)中心受損，光合效率降低，進(jìn)而導(dǎo)致光合色素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的份額減少，更多的光能被熱耗散掉，這種耗散機(jī)制可能是顛茄對(duì)鹽脅迫的一種防御響應(yīng).另外周丹丹[28]通過(guò)研究鹽脅迫對(duì)樸樹和速生白榆的葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懙贸隽讼嗨频慕Y(jié)論.而EBR處理后NPQ顯著降低，表明外源EBR能夠有效減少逆境脅迫下顛茄葉片中光能的熱耗散，有利于光合作用的正常進(jìn)行.這與王舒甜等[29]在香樟葉片中的研究結(jié)論基本一致.

4 結(jié)論

綜上所述，NaCl脅迫使顛茄葉片中光合機(jī)構(gòu)受到破壞，光合色素含量明顯減少，同時(shí)葉綠素?zé)晒鈪?shù)F0、NPQ明顯增加，而Fv/Fm、qP、Yield則明顯下降.0.1 mg·L-1EBR處理，可以有效提高顛茄葉片光合色素的產(chǎn)生和積累，減少鹽脅迫條件對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心造成的損傷，從而提高植物的光合能力，增加植物的耐鹽性，進(jìn)而減少鹽脅迫對(duì)顛茄生長(zhǎng)發(fā)育的抑制.在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，也可以考慮外施適宜濃度的EBR，來(lái)處理顛茄栽培過(guò)程中可能出現(xiàn)的鹽害問(wèn)題，從而增加其抗逆能力，保護(hù)植物正常生長(zhǎng).但是，關(guān)于外源EBR對(duì)顛茄幼苗鹽脅迫的內(nèi)部反應(yīng)機(jī)制的作用還需進(jìn)一步研究.