潘慧青，張炎達(dá)，楊榮平，趙齊

摘要：為獲得具有除臭功能的養(yǎng)殖用微生態(tài)制劑備用菌株，從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便富集培養(yǎng)后分離的乳酸菌中，篩選出一株除臭乳酸菌BDLC-3，經(jīng)16S rDNA測(cè)序分析，鑒定為短乳桿菌（lactobacillus brevis），通過(guò)大鼠經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株安全無(wú)毒。對(duì)菌株發(fā)酵制備獲得的菌劑進(jìn)行應(yīng)用效果檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，菌劑BDLC-3以3%的接種量處理新鮮豬糞7d可達(dá)到最優(yōu)的除臭效果，對(duì)氨氣和硫化氫的去除率分別為73.8%±2.6%和55.8%±3.1%。結(jié)果表明該菌株具有良好的生長(zhǎng)性能、安全性和除臭性能，具備在畜禽養(yǎng)殖中作為益生、除臭一體微生態(tài)制劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;除臭;氨氣;硫化氫

Isolation of a Deodorizing Lactic Acid Bacteria and its Application Effect

PAN Huiqing， ZHANG Yanda*， Yang Rongping， Zhao Qi

（Municipal Enterprise Technical Center of Fujian Beidi Pharmaceutical Co.， Ltd.， Ningde， Fujian， 355300）

Abstract： In order to obtain probiotics strains for breeding with deodorization function， a deodorizing lactic acid bacterium BDLC-3 was selected from the lactic acid bacteria isolated from the feces of livestock farms. According to the analysis of 16S rDNA gene sequencing， strain BDLC-3 were identified as Lactobacillus brevis. The results of oral toxicity test in rats showed that the strain was safe and non-toxic. Application effect test of the bacteria BDLC-3 agent showed that the treatment of fresh pig manure with 7 d at 3% inoculation， with the removal rates of ammonia and hydrogen sulfide were 73.8%±2.6% and 55.8%±3.1%， respectively. The results showed that the strain had good growth performance， safety and deodorization performance， and had potential application value as probiotic and deodorizing probiotics in livestock breeding.

Key words：Lactobacillus; deodorization; NH3; H2S

隨著近年來(lái)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)生的糞污成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來(lái)源，產(chǎn)生的惡臭氣體不僅對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生危害，更嚴(yán)重影響周邊環(huán)境和人體健康，由此帶來(lái)的環(huán)境污染成為限制產(chǎn)業(yè)綠色、高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，是整個(gè)產(chǎn)業(yè)需要重點(diǎn)控制的核心問(wèn)題[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)惡臭氣體主要采用物理、化學(xué)和生物法進(jìn)行處理[2]，其中生物法主要利用微生物除臭，具有低投資、高效率和生態(tài)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)[3-5]。與此同時(shí)，微生態(tài)制劑在畜禽健康養(yǎng)殖過(guò)程中具有促生產(chǎn)和促生長(zhǎng)，提高飼料利用率和養(yǎng)殖效益等作用，也可使糞污顯著減量[6-10]。因此，既具備益生菌功能又兼具除臭效果的微生物菌劑的研究和開(kāi)發(fā)受到重視。乳酸菌是最常用的益生菌，具備產(chǎn)酸抑制腐敗微生物生長(zhǎng)的性能，也可有效去除惡臭氣體，是益生除臭菌研究和應(yīng)用的重點(diǎn)[11-13]?；诖?，本研究從福建寧德規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)糞污中富集、分離乳酸菌，并從中篩選具備較好除臭性能的菌株，為適于區(qū)域畜禽養(yǎng)殖用多功能微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇位于福建省寧德市和柘榮縣的兩個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)，從堆積的糞便中間和底層共采集約30g樣品，裝入無(wú)菌自封袋后置于冰盒中保存，3h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，用于目標(biāo)菌株分離和篩選。

1.2 菌株的分離和篩選

取5g采集的樣品于裝有100mL無(wú)菌水的250mL三角瓶中，放入搖床中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速200r/min的條件下處理2h后取出，靜止1h。取上清液5mL于裝有50mL MRS培養(yǎng)基[13]的250mL三角瓶中，放入搖床中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速120r/min的搖床中處理48h。

富集處理后的樣品，取樣采用10倍稀釋法，從10-3、10-5、10-7、10-9稀釋度下吸取0.1mL于MRS固體平板上涂布，30℃恒溫培養(yǎng)。2d后觀察平板上產(chǎn)生透明圈的不同菌落并采用平板劃線法進(jìn)一步純化，編號(hào)后移入斜面培養(yǎng)基上并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 除臭菌的篩選和鑒定

1）乳酸菌的除臭效果初篩 采用六級(jí)強(qiáng)度評(píng)價(jià)法[14]檢驗(yàn)除臭效果并對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行初篩。分離獲得的乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基在搖瓶中培養(yǎng)48h后備用。取新鮮豬糞200g置于1，000mL廣口瓶中，將待測(cè)菌液以O(shè)D值稀釋一致后，以5%的接種量將菌液與豬糞攪拌均勻，以不接種組為對(duì)照，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。密封廣口瓶，30℃靜止培養(yǎng)7d后評(píng)價(jià)各菌株的除臭效果。

2）除臭菌株的復(fù)篩 經(jīng)初篩獲得的有較好效果的除臭菌，搖瓶發(fā)酵制備菌劑。取新鮮豬糞300g裝入1，000mL的廣口瓶中，按照5%的接種量接入菌液并與豬糞攪拌均勻，在廣口瓶中放置2個(gè)50mL燒杯，分別裝有20mL 2%的硼酸溶液和20mL 0.2%的鋅銨絡(luò)鹽溶液。廣口瓶用膠塞密封并覆蓋雙層保鮮膜后在30℃靜置培養(yǎng)。以不接種組為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)第7天取出吸收液，分別測(cè)定氨氣和硫化氫的釋放量[15]，計(jì)算不同菌株對(duì)氨氣和硫化氫的去除率以確定效果最佳的除臭菌。

計(jì)算公式：降解率=對(duì)照組釋放量-試驗(yàn)組釋放量/對(duì)照組釋放量×100%。

3）除臭菌株的16S測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析 確定的除臭菌株培養(yǎng)收集菌體后提取基因組DNA，并擴(kuò)增16S rDNA。PCR反應(yīng)體系為：含有15mmol/L的Mg2+的10×緩沖液2.5μL，2.5mmol/L的dNTP 2μL，引物27F和1492R（10μmol/L）各0.4μL，DNA模板約30ng，全式金DNA聚合酶0.75U，用ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR條件為：94℃ 4min;94℃ 1min，55℃ 45s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán);最后72℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送交上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將所得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析后，采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 除臭菌的安全評(píng)價(jià)

參照GB15193.3—2014采用大鼠急性毒性試驗(yàn)對(duì)除臭菌的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用最大耐受劑量法進(jìn)行。健康大鼠隨機(jī)分為2組，雌雄各10只，一次經(jīng)口灌胃量為2mL/100g，灌胃后連續(xù)7d觀察大鼠是否有中毒、發(fā)病和死亡現(xiàn)象，并按照LD50劑量分級(jí)表進(jìn)行判定。

1.5 除臭菌的菌劑發(fā)酵

采用既有的乳酸菌液體發(fā)酵規(guī)模生產(chǎn)的配方初步檢驗(yàn)除臭菌的生產(chǎn)性能。所用生產(chǎn)用培養(yǎng)基配方1為：食用紅糖2%;安琪蛋白胨0.4%;安琪酵母浸膏1.8%;磷酸氫二鉀0.2%;硫酸鎂0.05%;結(jié)晶醋酸鈉1.5%;0.5%碳酸鈣。配方2為：葡萄糖1.5%;蛋白胨1.0%;酵母膏2%;磷酸氫二鉀0.4%;硫酸鎂0.05%;碳酸鈉0.5%;0.5%碳酸鈣。以MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每種培養(yǎng)基均為3個(gè)重復(fù)，采用2L的搖瓶在30℃、160r/min的搖床中處理48h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。

1.6 除臭菌劑的應(yīng)用效果試驗(yàn)

在養(yǎng)豬場(chǎng)用30L桶裝入10kg新鮮豬糞，發(fā)酵獲得的除臭菌劑，按照1%、3%和5%的接種量加入并攪拌均勻，上方放置兩個(gè)250mL的燒杯，分別裝有100mL 2%的硼酸溶液和100mL 0.2%的鋅銨絡(luò)鹽溶液。隨后用雙層保鮮膜封口，豬場(chǎng)自然條件下靜置培養(yǎng)，以不接種組為對(duì)照，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別在第7天和第14天取出吸收液，測(cè)定氨氣和硫化氫的釋放量，計(jì)算氨氣和硫化氫的去除率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)和分析采用SPSS 18.0軟件，選擇單因素方差分析，采用Tukey多重比較檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離乳酸菌的除臭效果初篩

經(jīng)MRS培養(yǎng)基富集后，在MRS固體平板上對(duì)產(chǎn)生透明圈的菌落依大小進(jìn)行劃線分離，共獲得5株菌，分別命名為BDLC-1、BDLC-2、BDLC-3、BDLC-4、BDLC-5。通過(guò)六級(jí)強(qiáng)度評(píng)價(jià)對(duì)這些菌株進(jìn)行除臭效果初篩，結(jié)果顯示這些菌株均有除臭效果（表1），其中BDLC-1和BDLC-3除臭能力最強(qiáng)，經(jīng)7d的處理后，臭味等級(jí)均為表示輕微臭味的“+”。

2.2 除臭菌復(fù)篩和菌株測(cè)序分析

通過(guò)對(duì)各菌株去除氨氣和硫化氫的能力進(jìn)行復(fù)篩，各菌株7d的氨氣和硫化氫去除率分別在38.3%～81.7%和33.0%～63.0%之間，對(duì)氨氣的去除率顯著高于對(duì)硫化氫的去除率（圖1）。

所有菌株中，BDLC-1和BDLC-3對(duì)氨氣和硫化氫的去除率顯著高于其它3株，其中菌株BDLC-3對(duì)氨氮和硫化氫的去除率分別為81.7%±1.5%和63.0%±2.5%，顯著高于BDLC-1（P<0.05）?；诖?，篩選獲得的BDLC-3將作為目標(biāo)菌做進(jìn)一步研究。

對(duì)菌株BDLC-3進(jìn)行了測(cè)序分析，培養(yǎng)后提取基因組DNA，擴(kuò)增獲得16S rDNA片段后測(cè)序。測(cè)得的16S rDNA序列經(jīng)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2），確定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

2.3 除臭菌生物安全性評(píng)價(jià)

采用大鼠急性毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)菌株BDLC-3的生物安全性，灌胃后大鼠未出現(xiàn)中毒癥狀，無(wú)死亡。觀察期結(jié)束后處死全部動(dòng)物剖檢未見(jiàn)異常。MTD結(jié)果（表2）顯示，菌劑BDLC-3對(duì)雌、雄性大鼠的最大耐受劑量（MTD）均大于19.75g/kg，根據(jù)GB15193.3—2003中的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬無(wú)毒級(jí)。

2.4 除臭菌劑的發(fā)酵制備

為確定菌株BDLC-3是否具備低成本規(guī)模發(fā)酵制備菌劑的可行性，采用本單位成熟用于乳酸菌液體規(guī)模發(fā)酵的兩個(gè)配方，對(duì)比MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行初步發(fā)酵制備。結(jié)果顯示生產(chǎn)配方1和2的菌數(shù)分別為1.59×109±2.8×107CFU/mL和2.74×109±2.2×108CFU/mL，低于MRS培養(yǎng)基的4.37×109±2.7×108CFU/mL，但處于相同數(shù)量級(jí)。因此，初步確定菌株BDLC-3可以實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)制備菌劑。

2.5 除臭菌劑的應(yīng)用效果

制備的BDLC-3菌劑在1%、3%和5%的接種量下，對(duì)新鮮豬糞的小試應(yīng)用效果顯示，接種1%菌劑的試驗(yàn)組氨氮和硫化氫的去除率均顯著低于3%和5%的接種量（P<0.05），其中3%接種量的試驗(yàn)組氨氮和硫化氫的去除率均最高，繼續(xù)增加接種量不能顯著提高處理效果。3%接種量的試驗(yàn)組7d和14d的氨氮去除率分別為73.8%±2.6%和78.4%±2.0%，硫化氫的去除率分別為55.8%±3.1%和39.2%±2.8%。各試驗(yàn)組處理14d比7d氨氮去除率的增加不顯著，相反地，各試驗(yàn)組處理14d比7d硫化氫去除率顯著降低（P<0.05）。顯然，菌劑BDLC-3對(duì)新鮮豬糞有快速的處理能力和較好的處理效果。如圖3。

3 討論

微生物除臭在畜禽養(yǎng)殖、垃圾處理、水污染治理、有機(jī)廢棄物處理等領(lǐng)域均有迫切的應(yīng)用需求，從這些環(huán)境中分離篩選適于特定環(huán)境的除臭功能菌已有較好的研究基礎(chǔ)[7，16，17]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)乳酸菌的益生功能和安全性已有足夠的認(rèn)識(shí)，發(fā)掘其除臭功能具有在畜禽養(yǎng)殖中實(shí)現(xiàn)一菌多用的前景。乳酸菌經(jīng)常作為單菌或者復(fù)配菌成分，制備除臭菌劑在實(shí)際應(yīng)用中也取得了較好的效果[4，18，19]。挖掘具有除臭效果的乳酸菌并進(jìn)行評(píng)價(jià)應(yīng)用，是一項(xiàng)長(zhǎng)期的重要工作。已有研究中常見(jiàn)的具有除臭功能乳酸菌如植物乳酸菌（lactobacillus plantatum）、嗜熱鏈球菌（streptococcus thermophilus）、干酪乳桿菌（lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（lactobacillus paracasei）、布氏乳桿菌（lactobacillus buchneri）和發(fā)酵乳桿菌（lactobacillus fermentum）等。本研究分離鑒定的短乳桿菌作為除臭菌在實(shí)際應(yīng)用中尚比較罕見(jiàn)，僅有個(gè)別以該類菌株去除特定惡臭物質(zhì)的試驗(yàn)研究[12]，具有豐富除臭乳酸菌種類，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)菌劑實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

已發(fā)現(xiàn)的除臭乳酸菌制備的菌劑，在實(shí)驗(yàn)室除臭效果測(cè)試中顯示出較好的效果。邱艷君等[13]從泡菜廠污水處理系統(tǒng)中分離的植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌對(duì)氨氮和硫化氫的最大去除率分別達(dá)到54.87%、37.35%和41%、22.47%。許麗娟等[20]從生活垃圾中篩選獲得的一株干酪乳桿菌對(duì)氨氮和硫化氫的最大去除率分別達(dá)到90%和46.8%。本研究獲得的菌株短乳桿菌BDLC-3在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)氨氣和硫化氫的去除率分別為81.7%±1.5%和63.0%±2.5%，針對(duì)兩種主要臭源氣體的綜合除臭性能較好。功能菌株是否能成為具有應(yīng)用價(jià)值的菌劑產(chǎn)品，還涉及安全性、生產(chǎn)成本和實(shí)用效果。菌株BDLC-3經(jīng)生物安全評(píng)價(jià)為無(wú)毒無(wú)害。采用用于菌劑生產(chǎn)的培養(yǎng)配方，仍能獲得較高的發(fā)酵水平，表明其具備低成本生產(chǎn)的潛質(zhì)。而已發(fā)酵的菌劑在現(xiàn)場(chǎng)小試的環(huán)境條件下，對(duì)氨氣和硫化氫的去除率分別為73.8%±2.6%和55.8%±3.1，具有良好的實(shí)用效果。綜合考慮上述因素，本研究分離篩選的菌株BDLC-3具有良好的生長(zhǎng)性能、安全性和除臭性能，在進(jìn)一步研究菌株益生性能，優(yōu)化生產(chǎn)、應(yīng)用條件的基礎(chǔ)上，具有開(kāi)發(fā)成為在畜禽養(yǎng)殖中作為益生、除臭一體微生態(tài)制劑的潛在價(jià)值。

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