金雷鋼，耿磊落，徐愛民

香港大學 a.生物醫(yī)藥技術國家重點實驗室，b.內科系，c.藥理與藥劑系，香港特別行政區(qū) 999077

1 FGF21的生物學功能

人成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是一類由22個成員組成，具有調節(jié)細胞分化、增殖和代謝等一系列生理功能的細胞因子家族。FGF21是FGF家族成員之一，與FGF19、23同屬于內分泌型FGF亞組[1]。2000年，Nishimura等[2]率先克隆出FGF21基因，但直到2005年，F(xiàn)GF21作為一個新的代謝調節(jié)因子的生物活性才被首次報道：Kharitonenkov等[3]發(fā)現(xiàn)FGF21可通過刺激葡萄糖轉運體1(glucose transporter 1, GLUT1)的表達，促進小鼠3T3-L1脂肪細胞和人原代脂肪細胞的葡萄糖攝取。后續(xù)實驗進一步證實，F(xiàn)GF21這種主要由肝細胞表達的蛋白可明顯提高機體胰島素敏感性，并維持能量代謝平衡。在自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠或高脂飲食誘導的肥胖小鼠中，F(xiàn)GF21同樣具有良好的降血糖和胰島素增敏功效[4]。在2型糖尿病非人靈長類動物模型實驗[5]中，重組FGF21蛋白能夠顯著降低體質量、持續(xù)降低血糖和甘油三酯至正常水平，改善胰島素抵抗，并能減輕脂肪肝病變。在生理狀況下，F(xiàn)GF21能夠感受機體的營養(yǎng)狀況，并調控全身代謝平衡。饑餓或者長時間的禁食可以通過激活核受體過氧化物酶體增殖激活物受體α(PPARα)信號通路，誘導小鼠肝FGF21的表達，上調血液中FGF21的水平，進而依次促進脂肪組織的脂解以及脂肪酸的釋放，肝臟繼而吸收脂肪酸并將其轉化為酮體，從而調控機體能量平衡。此外，F(xiàn)GF21也能夠進入大腦，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，促進皮質酮的釋放及肝糖異生，維持機體的糖代謝平衡[6-7]。最近研究[5,8-10]表明，F(xiàn)GF21還能顯著改善脂質代謝紊亂，包括降低低密度脂蛋白膽固醇、增高高密度脂蛋白膽固醇，在治療肥胖、動脈粥樣硬化以及脂肪肝等疾病過程中有著廣泛的潛力。

傳統(tǒng)的FGF家族通過結合細胞膜具酪氨酸蛋白激酶活性的FGF受體(FGFR)而發(fā)揮作用，但FGF21缺少肝素結合位點，因而能夠從表達器官分泌至血液，作為一個內分泌因子發(fā)揮其生物功效。同時，F(xiàn)GF21本身必須與相關的輔助受體相結合才能通過FGFR來共同行使其生物學功能，F(xiàn)GF21的C-末端與一種叫β-klotho的跨膜蛋白相結合后，其N-端再與FGFR相結合，形成穩(wěn)定FGF21/β-klotho/FGFR復合體后，激活下游相關的分子信號，從而發(fā)揮其生物效應[11]。FGFR1c為FGF21的優(yōu)先受體，在各個組織中廣泛表達；而其輔助受體β-klotho只在肝臟、脂肪、胰腺和中樞神經(jīng)等幾種代謝活躍的組織中有較高表達[12]。脂肪組織是FGF21作用的重要靶器官。最近研究[13]表明，F(xiàn)GF21調控機體血糖平衡、胰島素敏感性和脂質代謝與脂肪細胞產(chǎn)生的脂聯(lián)素(adiponectin)存在密切的關系。FGF21可以通過激活PPARγ信號通路上調脂肪細胞中脂聯(lián)素的表達和分泌。動物實驗[8,13]進一步證實，脂聯(lián)素是FGF21發(fā)揮其維持機體血糖穩(wěn)定，增加胰島素敏感性以及降低肝臟、肌肉中脂肪堆積，抑制肝臟膽固醇合成等相關生物效應的重要下游功能介導因子。

2 FGF21對肝代謝調控和肝損傷的保護作用

肝組織作為FGF21最主要的內分泌器官，同時也是FGF21作用的重要靶器官。早期研究[4,14]發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，F(xiàn)GF21基因缺失能顯著增加小鼠生酮飲食后的體質量，并明顯加劇肝脂肪變性，損害酮體合成功能。近期研究[15]表明，給予小鼠重組FGF21蛋白能夠抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1的活性，增加肝胰島素敏感性。FGF21也可以通過誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α的表達，促進肝脂肪酸氧化[16]；通過抑制固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c水平，減少肝脂肪生成[17]；此外，外源性FGF21能夠有效抑制衣霉素(tunicamycin)引發(fā)的肝臟內質網(wǎng)應激[18]；也可以通過抑制核因子-κB，改善二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化[19]。另有動物實驗[20]表明，對乙酰氨基酚過量引起的肝損傷和病死率在FGF21基因敲除小鼠中明顯加重，重組FGF21通過誘導肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α的表達，上調抗氧化應激轉錄因子核因子E2相關因子2及其他抗氧化基因的水平，從而改善肝氧化應激和損傷。

盡管FGF21的輔助受體β-klotho在肝組織中大量表達，但由于介導FGF21作用的優(yōu)先受體FGFR1在正常肝細胞中表達很低，肝細胞是否是FGF21直接的作用生理靶點依然存在爭議[12,21]。Gong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，敲低肝內β-klotho的水平將加重肝胰島素抵抗，且FGF21介導的胰島素增敏作用和降血糖效應消失。小鼠給予外源性FGF21后能夠激活肝細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化，調控FGF21下游基因在肝臟中的表達[22]。但另有細胞實驗[16]顯示，當對離體的小鼠肝臟或大鼠原代肝細胞直接給予FGF21刺激后卻沒有任何生物學效應。另外，對肝特異性β-klotho基因敲除小鼠和野生型小鼠給予FGF21處理后，2種小鼠均顯示出了同等程度的血糖和體質量降低、肝脂質堆積改善、胰島素敏感性上調等效應[23]。這些結果提示了FGF21對肝代謝等功能的調控可能是由機體其他組織間接介導的(圖1)。在高脂飲食誘導的脂聯(lián)素缺失肥胖小鼠中，F(xiàn)GF21對肝胰島素增敏、改善肝脂肪變性及保護肝功能的作用均明顯減弱，表明FGF21-脂聯(lián)素信號軸在調控肝代謝上發(fā)揮著重要功效[13]。此外，F(xiàn)GF21可以通過血腦屏障進入大腦，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸發(fā)揮其調控肝糖異生的作用[7]。盡管上述研究闡述了FGF21對肝臟的調節(jié)與保護作用，但對于其調控肝代謝、減輕肝損傷的具體分子機制仍有待進一步探索。

3 FGF21作為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)及肝損傷的生物標志物

盡管FGF21具有多重代謝保護作用，前期研究[24-25]發(fā)現(xiàn)FGF21循環(huán)水平在NAFLD 患者及肥胖誘導的脂肪肝小鼠模型中卻明顯升高。Fisher等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導的NAFLD小鼠肝臟中FGF21 mRNA水平顯著增高。針對歐美人群的橫斷面研究[24,26]顯示，血液FGF21水平在NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中明顯高于正常對照組。上海交通大學賈偉平教授團隊[27]發(fā)現(xiàn)，相比于正常人群，血液及肝臟中FGF21的水平在NAFLD患者中顯著上調，且血液中FGF21水平與甘油三酯呈正相關，而與高密度脂蛋白膽固醇呈負相關。血液及肝臟中FGF21水平隨著肝脂肪變性程度的增加而逐步升高，提示FGF21水平的改變與肝糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗密切相關，并可能參與了肝脂肪性病變的發(fā)生發(fā)展[27]。該團隊隨后對808例上海社區(qū)人群進行了3年隨訪的前瞻性研究[28]，結果顯示FGF21基線水平高者，發(fā)生NAFLD的風險明顯增加，且血液FGF21水平隨著NAFLD病情的發(fā)展而逐步增高。由于NAFLD也是一種慢性的炎癥疾病，肝臟炎癥水平增加是脂肪肝進展的主要標志，最新研究[29]證實，F(xiàn)GF21與NAFLD患者血清中IL-6呈相關性，提示FGF21可能反映疾病的嚴重程度和病理進程。在另一項針對179例NAFLD患者和91例健康正常人群的臨床研究[30]顯示，循環(huán)水平的FGF21與NAFLD的進程呈線性相關，且FGF21水平在NASH患者達到最高值。此外，在NASH患者中，血液FGF21的水平也與肝臟壞死性炎癥、纖維化及細胞角蛋白18水平呈正相關[31]。上述研究成果也提示,FGF21可作為一個敏感的預測NAFLD病情進展的生物學標志物。

在針對其他肝損傷的臨床研究中，急性病毒性肝炎患者血液中FGF21水平顯著升高，且與ALT和AST水平呈正相關[32]。此外，Ye等[33]通過檢測肝移植缺血/再灌注患者血液中FGF21水平及其他肝功能指標后發(fā)現(xiàn)，相比于正常對照組，血液中的FGF21在缺血/再灌注發(fā)生后的2 h即顯著升高，而ALT、AST的活性在24 h后才明顯上調。相較于轉氨酶的滯后反應，F(xiàn)GF21的高靈敏度也為肝移植缺血/再灌注患者的早期診斷和病程干預提供了可能性，具有潛在的臨床應用價值。

4 FGF21用于治療NAFLD的臨床試驗現(xiàn)狀

FGF21是FGF家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一沒有促有絲分裂功能的家庭成員，這種獨特的生物學特性也大大降低了其在臨床用藥上的誘癌風險。然而，由于天然的人FGF21生物學特性有諸多不足，難以發(fā)展其成為臨床藥物。這些缺陷包括: 首先，F(xiàn)GF21藥代動力學性能較差，生物半衰期一般只有0.5～1 h[5]；其次，F(xiàn)GF21蛋白保存在溶液中很容易被降解、在體外易聚集，構象上的非常不穩(wěn)定使其在大規(guī)模表達和純化的過程中也會存在困難[34]。基于上述原因，研究人員運用生物工程技術開發(fā)了許多長效的FGF21類似物和針對FGF21受體復合物(FGFR1/β-klotho)的激動劑。盡管發(fā)展這些FGF21類似物及受體激動劑的主要初始目的是用于治療肥胖或糖尿病，但近期數(shù)項臨床試驗卻意外發(fā)現(xiàn)其對NAFLD的良好療效。

4.1 PEG化人FGF21類似物： Pegbelfermin(BMS-986036)

Pegbelfermin (BMS-986036)是百時美施貴寶公司研發(fā)的一種聚乙二醇化的人FGF21類似物。此前一項Ⅱa期臨床研究(NCT02097277)[35]顯示，2型糖尿病伴NAFLD患者在給予pegbelfermin后，血糖控制指標——糖化血紅蛋白并未明顯改善，但血液中肝纖維化的生物標志物——Ⅲ型膠原N-末端前肽(PRO-C3)卻顯著下降。因而，最近的一項Ⅱa期臨床研究(NCT02413372)[10]進一步評估了pegbelfermin在NASH患者中的安全性和有效性，結果表明pegbelfermin可有效改善NASH患者(F1～3期，肝脂肪含量≥10%)的肝纖維化程度及其他相關代謝指標。在這項多中心、隨機、雙盲Ⅱa期研究中，納入的75例NASH患者隨機接受每日1次皮下注射pegbelfermin (10 mg)或每周1次pegbelfermin (20 mg)或安慰劑，共16周。與安慰劑組相比，接受pegbelfermin治療的患者癥狀在8周即出現(xiàn)改善；16周后實驗組患者血清中的PRO-C3、ALT、AST 水平顯著降低，脂聯(lián)素水平明顯升高，肝脂肪絕對含量明顯下降。接受10、20 mg pegbelfermin組的患者肝脂肪絕對分數(shù)分別減少6.8%和5.2%，而安慰劑組僅為1.3%。目前正在進行的另2項平行的Ⅱb期臨床研究(NCT0348689，NCT03486912)預計于2021年底完成，用以評估pegbelfermin在更多NASH和肝硬化患者中的有效性和安全性。

4.2 Fc與FGF21的融合蛋白： Fc-FGF21 (AKR-001或efruxifermin) 研究人員將人FGF21與人IgG1的Fc片段融合，得到Fc-FGF21蛋白，與野生型FGF21相比，融合蛋白可有效延長FGF21的循環(huán)半衰期，提高生物利用度，同時能抵抗蛋白酶水解，增加穩(wěn)定性[36]。前期動物實驗[36]表明，F(xiàn)c-FGF21能夠顯著降低肥胖獼猴血清中的血糖及甘油三酯水平，改善胰島素抵抗。最近，Akero Therapeutics公司于2020年美國肝病學會年會上匯報了FGF21-Fc融合蛋白efruxifermin(EFX, 舊稱AKR-001)在Ⅱa期臨床研究[37-38](NCT03976401)中的數(shù)據(jù)，證實了EFX具有治療NASH的潛力。80例符合要求的NASH患者隨機接受每周1次皮下注射EFX(28、50、70 mg)或安慰劑16周。結果顯示在接受EFX治療12周后，50例患者肝脂肪含量減少30%；治療16周后，與安慰劑組相比，注射28、50和70 mg EFX的劑量組均達到主要終點(由MRI質子密度脂肪分數(shù)評估的肝脂肪相對于基線的絕對變化)，其肝脂肪相對減少分別為63%、71%和72%。同時，肝脂肪的絕對減少率分別為12%、13%和14%，安慰劑僅為0.3%。研究者隨后對40例肝脂肪相對減少≥30%的受試者進行進一步的肝活檢發(fā)現(xiàn)，8%和28%的治療響應者分別實現(xiàn)了1個級別及2個級別的肝纖維化改善；48%的響應者實現(xiàn)了NASH消退，并且未發(fā)生纖維化的惡化。此外，在所有劑量組中也觀察到胰島素敏感性的上升，脂蛋白譜的改善以及體質量減輕。EFX改善NASH的亮眼表現(xiàn)使其在在研藥物中展現(xiàn)出了極強的競爭力。目前，一項關于EFX的Ⅱb期臨床研究(NCT04767529)也已啟動，用以進一步觀察其在NASH患者中的臨床效果。

4.3 FGF21受體激動劑： BFKB8488A和NGM313(MK-3655) 除上述的FGF21蛋白類似物外，研究人員也發(fā)現(xiàn)幾種FGF21受體激動劑在治療NASH過程中展現(xiàn)出了相當?shù)臐摿Γ⒁堰M入臨床試驗階段。其中比較有代表性的是基因泰克公司研發(fā)的單抗激動劑BFKB8488A和默沙東公司研發(fā)的NGM313 (現(xiàn)稱MK-3655)。最近的一項Ⅰb期臨床研究(NCT03060538)[39]顯示，肥胖伴隨NAFLD的患者在注射BFKB8488A后體質量明顯降低，血液脂聯(lián)素水平增加，心血管代謝指標得到改善。同時，注射BFKB8488A使患者ALT水平下降10%～30%，PRO-C3水平降低約37%±17%，肝脂肪含量降低約38%±5%[40]。目前正在進行另一項Ⅱ期臨床研究(NCT04171765)用以進一步評估其安全性和有效性。NGM313也是最近研發(fā)出的一種人源化FGF21受體單克隆抗體激動劑，可以與β-klotho的特定表位結合，并能夠選擇性地激活FGFR1c受體介導的信號通路。近期公布的Ⅰb期臨床研究(NCT03298464)[41]結果表明，單次注射NGM313可以顯著降低肥胖且伴有胰島素抵抗的NAFLD患者肝脂肪含量，改善多項代謝指標。目前，NGM313的研究已經(jīng)推進到Ⅱb期臨床試驗(NCT04583423)，其便利的給藥方式(每月單次)有可能成為其超越其他同類藥物的突破點。

綜上所述，多種FGF21類似物和FGF21受體激動劑的安全性、耐受性、藥效以及藥代動力學已經(jīng)在臨床上得到初步驗證，然而在臨床試驗中，這些蛋白的不良反應報道也不容忽視。在針對幾種FGF21蛋白變構體的臨床研究中，給予Pegbelfermin和LY2405319 (禮來公司研發(fā)的長效FGF21突變體)后，50%以上的患者體內檢測到抗FGF21的抗體[35,42]。此外，值得注意的是，上述藥物的臨床試驗都停留在短短幾周或數(shù)月的觀察時間，考慮到NAFLD、2型糖尿病等代謝性疾病都屬于慢性病，患者需要長期或者終身給藥治療，長期給藥的安全性及風險依然有待于進一步的臨床研究。

5 總結與展望

FGF21作為一種主要由肝細胞分泌的蛋白，對維持機體內的糖脂代謝平衡具有至關重要的作用。大量的臨床試驗也證實FGF21治療代謝性肝病具有很大的潛力。然而，其在臨床的開發(fā)及應用上依然面臨不少的挑戰(zhàn)。前期的細胞及動物實驗表明FGF21能夠有效促進葡萄糖吸收，在嚙齒類和非人靈長類動物中也具有良好的降血糖效應，而在后續(xù)的臨床試驗中，其調節(jié)機體血糖的功效卻令人失望，F(xiàn)GF21相關藥物治療糖尿病的臨床實驗研究也基本上均止步于一期。在另一方面，前瞻性研究中觀察到血液 FGF21 水平是NAFLD的可靠生物標志物。最近的動物和臨床研究[43]也證實FGF21能夠有效調節(jié)肝脂質代謝、改善肝脂肪含量和纖維化，其良好的藥效使得FGF21成為治療NAFLD和NASH等慢性肝臟疾病的新型候選藥物。

通過對FGF21蛋白進行重組改造與修飾，以及對其受體復合物激動劑的研發(fā)，工程化的FGF21類似物克服了野生型蛋白半衰期短、藥代動力學性能較差的缺陷，在臨床試驗中取得了令人鼓舞的結果。然而，F(xiàn)GF21類似物在NAFLD和NASH患者中發(fā)揮治療功效的同時，也伴隨著一些問題和不良反應的出現(xiàn)。首先，Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗的患者在給予不同種類的FGF21類似物或受體激動劑治療后，其機體代謝指標的變化不盡相同；其次，接受FGF21給藥后，患者往往會出現(xiàn)骨骼生長受抑制、骨密度降低、產(chǎn)生抗FGF21抗體等副作用[44]。盡管經(jīng)歷多年的研究，但對于FGF21的生理功能和藥理機制仍未完全闡明，依然有大量問題有待解決：(1)為何FGF21在生理狀態(tài)和藥理作用下會出現(xiàn)明顯不同的效應？(2)為何在動物實驗中FGF21類似物良好的抗肥胖抗糖尿病功效卻在人體試驗中療效甚微，F(xiàn)GF21在不同物種之間作用差異的原因是什么？(3)FGF21改善NAFLD的功效是直接作用于肝細胞，還是通過促進脂肪細胞分泌脂聯(lián)素或者大腦-肝臟之間的調節(jié)而發(fā)揮間接效應，其具體的分子機制有哪些？(4)機體在肥胖狀態(tài)下，全身或者靶器官是否存在與胰島素抵抗相類似的“FGF21抵抗”效應，“FGF21抵抗”是否會促進肥胖相關的代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展？(5)FGF21類似物在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗的人數(shù)較少，觀察時間較短，其長期療效、最佳治療窗口和副作用等方面的證據(jù)相對有限。因此，需要在不同種族人群中針對更大樣本量的NAFLD患者進行更長時間的臨床試驗，以進一步驗證FGF21類似物及其受體激動劑在治療該病的臨床效果及評估長期用藥后的安全性。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：金雷鋼負責收集分析資料，撰寫論文；耿磊落負責論文修改；徐愛民擬定寫作思路，指導文章撰寫并最后定稿。