安梓銘，馮 琴,2,3,4

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所，上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué) 肝病研究所，上海 201203；3 上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203； 4 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海 201203

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，疾病譜包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。我國NAFLD發(fā)病率大約為29.2%[1]，已取代病毒性肝炎成為最為高發(fā)的慢性肝病[2]。但目前臨床上缺乏有效治療NASH的獲批藥物，大量的臨床試驗正不斷開展。針對NASH的藥物臨床試驗，理想的治療終點是肝病相關(guān)死亡率或全因死亡率，然而實際操作中因達(dá)到臨床結(jié)局的時間過長而缺乏可行性，目前一般通過肝組織學(xué)的評價作為理想治療終點的替代終點[3]。組織學(xué)評價作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，能夠較為準(zhǔn)確地評價藥物療效，但是由于有創(chuàng)且費用較高，受試者接受度和依從性差[4]，在臨床中較難實施。因此，迫切需要安全可靠、準(zhǔn)確靈敏的無創(chuàng)指標(biāo)作為肝活檢的替代指標(biāo)。磁共振質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)(magnetic resonance imaging proton density fat fraction，MRI-PDFF)是一種運用磁共振技術(shù)對整個肝臟中的脂肪進(jìn)行定量評估的生物標(biāo)志物，近期多項國際多中心臨床試驗將之設(shè)計為主要臨床指標(biāo)以評價藥物療效。關(guān)于MRI-PDFF能否成為NASH臨床試驗理想的無創(chuàng)替代終點也正引發(fā)諸多思考。本文通過分析MRI-PDFF值與NASH肝組織學(xué)評價之間的相關(guān)性，特別是經(jīng)治后PDFF值的改變是否與組織學(xué)應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，探討其作為NASH臨床試驗無創(chuàng)性評價指標(biāo)的優(yōu)劣，希冀為今后臨床試驗提供參考。

1 關(guān)于MRI-PDFF

1.1 MRI-PDFF的概念 MRI-PDFF是一種應(yīng)用磁共振技術(shù)測量脂肪的成像方法，可對整個肝臟中的脂肪進(jìn)行定量評估。PDFF是組織中游離的甘油三脂中的質(zhì)子密度與游離的甘油三脂和水中的質(zhì)子總密度之比，范圍為0～100%。PDFF是組織的一項基本屬性，反映了組織中活動的甘油三脂濃度[4]。MRI-PDFF又可分為MRI-M(magnitude)和MRI-C(complex)，2種基于不同方法的類型對PDFF值進(jìn)行測量。研究[5]顯示，在橫向評估時，相比于MRI-C，MRI-M會低估PDFF值，但在縱向評估PDFF值的變化時二者具有一致性。

1.2 MRI-PDFF評估肝脂肪含量的原理 MRI對游離的未結(jié)合分子(水和甘油三脂)中質(zhì)子的信號敏感。相反，對結(jié)合的質(zhì)子，如細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層(包括膽固醇、鞘脂和磷脂)結(jié)構(gòu)中質(zhì)子的信號不敏感。同時，水和甘油三脂中質(zhì)子的不同電子屏蔽會導(dǎo)致不同質(zhì)子基團(tuán)的磁共振頻率不同。MRI-PDFF主要通過化學(xué)位移編碼MRI(CSE-MRI)技術(shù)將這種不同加以利用，同時利用2個或多個回波時間信號以進(jìn)行水脂分離[6]，首先分解來自于水和脂肪(甘油三脂)的信號，然后通過計算脂肪信號與來自水和脂肪的總信號的比值歸納整合這些信號，因此能夠量化肝脂肪含量。需要注意的是，PDFF值雖然能夠代表肝脂肪含量但二者并不相等，PDFF值與肝脂肪變性有關(guān)，但本質(zhì)上不同[4]。

2 MRI-PDFF值與NASH肝組織學(xué)評價的相關(guān)性

對NASH而言，評價藥物臨床療效的臨床結(jié)局終點包括出現(xiàn)肝硬化、肝移植、肝細(xì)胞癌或肝病相關(guān)死亡/全因死亡等事件。但NASH發(fā)展為肝硬化或肝癌的延續(xù)時間長達(dá)數(shù)十年，周期長且難以界定，因此臨床研究中通常用肝組織學(xué)替代終點評估療效。由于目前暫無有關(guān)MRI-PDFF與NASH疾病自然進(jìn)程關(guān)系，以及經(jīng)治后MRI-PDFF值的變化與臨床結(jié)局終點關(guān)系的相關(guān)研究。因此，尚只能通過與“金標(biāo)準(zhǔn)”——肝組織學(xué)評價的相關(guān)性分析判別其在NASH診斷及療效評價的價值。

目前，NAFLD/NASH的組織學(xué)評價系統(tǒng)主要包括Brunt系統(tǒng)、美國NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)評分系統(tǒng)(NASH-CRN)、歐洲SAF/FLIP評分系統(tǒng)，其中，NASH-CRN是NAFLD/NASH 臨床試驗研究中推薦的組織學(xué)評分系統(tǒng)[7]。在NASH-CRN評分系統(tǒng)中，NASH 活動度評分(NAFLD activity score，NAS)是脂肪變性(0、1、2、3分)、小葉炎癥(0、1、2、3分)和氣球樣變(0、1、2分)積分的總和，藥物干預(yù)前后評分的變化可以體現(xiàn)藥物治療NASH的臨床效應(yīng)。

2.1 橫向診斷時MRI-PDFF與NASH肝組織學(xué)評價的關(guān)系

2.1.1 MRI-PDFF值與脂肪變性評分的相關(guān)性 MRI-PDFF值反映的是肝脂肪含量，在評價肝脂肪變性方面具有較高的診斷準(zhǔn)確性和價值[8-10]。相關(guān)研究也確實證實了PDFF值與脂肪變性評分高度相關(guān)。Middleton等[11]分析了FLINT研究中NASH患者M(jìn)RI-PDFF值與肝組織學(xué)結(jié)果，證實PDFF值與脂肪變性等級評分有很強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.8，P<0.001)，脂肪變性不同級別可用具體PDFF值進(jìn)行相對精準(zhǔn)的劃分(脂肪變性0～1分與2～3分之間的PDFF閾值為16.3%，0～2分與3分之間閾值為21.7%)。其他多項應(yīng)用肝組織學(xué)作為參考標(biāo)準(zhǔn)的單中心橫向研究[12-16]也證實了PDFF值與肝脂肪變性評分的相關(guān)性。

2.1.2 MRI-PDFF值與小葉炎癥及氣球樣變評分的相關(guān)性 小葉炎癥和氣球樣變是診斷NASH的必要條件。除脂肪變性外，更應(yīng)該關(guān)注PDFF值與小葉炎癥和氣球樣變的關(guān)系。Jayakumar等[17]通過分析65例NASH患者在基線和Selonsertib(ASK1抑制劑)治療24周后肝組織學(xué)和MRI-PDFF結(jié)果，比較PDFF值與小葉炎癥和氣球樣變的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在基線時PDFF值與小葉炎癥評分及氣球樣變評分之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P值分別為0.34、0.08)。Middleton等[11]通過分析115例NASH患者肝組織學(xué)和MRI-PDFF結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDFF值與小葉炎癥甚至呈負(fù)相關(guān)(r=-0.21，P=0.03)；PDFF值與氣球樣變也不具有顯著的相關(guān)性(r=-0.02，P=0.85)。此外，Wildman-Tobriner等[18]對3項NAFLD或NASH藥物的Ⅱ期臨床試驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性分析，通過比較370例受試者在基線時的PDFF值與NAS評分，發(fā)現(xiàn)PDFF值與小葉炎癥和氣球樣變之間也均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.3 MRI-PDFF值與NAS總分的相關(guān)性 Jayakumar等[17]橫向比較了NASH患者的PDFF值與NAS總分的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在基線時兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.069)。上文所提到的Wildman-Tobriner等[18]也發(fā)現(xiàn)，雖然170例NAFLD患者在基線時PDFF值與NAS評分之間具有顯著的相關(guān)性(r=0.54，P<0.001)，但進(jìn)一步分析時，NAS評分≥4分與評分<4分的人群之間PDFF值有較多重疊，通過尤登指數(shù)劃分NAS評分≥4分的PDFF閾值為12.4%，但其陽性預(yù)測價值僅為0.13(95%CI: 0.05～0.26)，陰性預(yù)測價值卻為0.98(95%CI: 0.94～1)。因此認(rèn)為在NAS評分>4分的情況下，MRI-PDFF值與NAS評分的相關(guān)性較差。

現(xiàn)有證據(jù)足以證明PDFF值與脂肪變性之間高度的相關(guān)性，是評價肝脂肪變性程度的可靠指標(biāo)。然而，尚無證據(jù)支持PDFF值與小葉炎癥和氣球樣變之間的相關(guān)性，同時PDFF值與NAS總評分之間也無穩(wěn)定相關(guān)關(guān)系。提示在進(jìn)行橫向診斷時，單純通過PDFF值并不能預(yù)測NASH的存在與否，NASH的診斷依然依賴于肝組織病理學(xué)評判。

2.2 縱向療效評價時MRI-PDFF值的改變與肝組織學(xué)變化的關(guān)系 對于縱向評價藥物臨床療效而言，若治療前后MRI-PDFF值的變化與組織學(xué)應(yīng)答顯著相關(guān)，則能體現(xiàn)MRI-PDFF值作為臨床療效評價替代終點的可行潛力。2018年6月美國肝病學(xué)會和歐洲肝病學(xué)會舉辦的有關(guān)NAFLD終點的聯(lián)合研討會中，提出了基于肝活檢組織學(xué)評價的NASH臨床試驗終點[19]：即NASH改善，同時纖維化無惡化；或者肝組織纖維化改善1分及以上，同時NASH無惡化；或者NASH改善同時肝組織纖維化改善1分及以上。目前，多項研究[17,20-22]證實藥物干預(yù)治療后MRI-PDFF值下降與組織學(xué)應(yīng)答存在一定的相關(guān)性。

Patel等[20]對MOZART試驗進(jìn)行了二級分析，該試驗以NAS評分至少減少2分而無纖維化惡化作為組織學(xué)應(yīng)答終點，共獲得了35例患者在基線以及應(yīng)用膽固醇吸收抑制劑依折麥布(Ezetimibe)治療24周時的MRI-PDFF值和肝組織學(xué)結(jié)果，研究者將其中達(dá)到組織學(xué)應(yīng)答的患者(n=10)與未達(dá)到組織學(xué)應(yīng)答的患者(n=25)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示達(dá)到組織學(xué)應(yīng)答的患者PDFF值較未達(dá)到組織學(xué)應(yīng)答者顯著降低(-4.1%±4.9% vs -0.6%±4.1%，P<0.04)，平均相對百分比變化為-29.3%±33.0% vs 2.0%±24.0%(P<0.004)。同時，與未達(dá)到組織學(xué)終點的患者相比，組織學(xué)應(yīng)答患者的肝脂肪變性評分與肝氣球樣變評分的中位數(shù)均下降了1分(P值分別為0.01、0.03)，而小葉炎癥和纖維化未出現(xiàn)變化。因此，研究者認(rèn)為MRI-PDFF值的相對下降29%可能與NASH肝組織學(xué)應(yīng)答顯著相關(guān)，可作為藥物治療后組織學(xué)應(yīng)答的閾值。

Loomba等[21]對FLINT試驗的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行了二級分析，證實了MRI-PDFF值相對減少30%與肝組織學(xué)應(yīng)答間的關(guān)系。對78例NASH患者在奧貝膽酸(n=40)與安慰劑(n=38)治療前后所測得的MRI-PDFF值和肝組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行評估，組織學(xué)終點為NAS評分減少≥2分而無纖維化的惡化。分析顯示，在治療72周后，MRI-PDFF值較基線相對下降≥30%的患者(n=20)與相對下降<30%(n=58)的患者組織學(xué)應(yīng)答率分別為50%和19%(OR=4.86，95%CI: 1.4～12.8，P<0.009), 提示當(dāng)PDFF值相對下降≥30%時會有更多患者達(dá)到組織學(xué)應(yīng)答。PDFF值相對下降≥30%的患者中有85%出現(xiàn)脂肪變性減少≥1分的改善，而<30%的患者中僅有25%出現(xiàn)了相應(yīng)的改善，2組間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。在氣球樣變改善方面，MRI-PDFF值相對下降≥30%的患者中有50%的患者出現(xiàn)了≥1分的改善，而PDFF值相對下降<30%的患者中只有26%的患者出現(xiàn)了相應(yīng)改善，2組間亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2019年Harrison等[22]報道了選擇性甲狀腺激素受體-β激動劑Resmetirom治療NASH臨床療效的Ⅱ期臨床試驗結(jié)果，研究者第12周和第36周連續(xù)測量受試者M(jìn)RI-PDFF值，第36周進(jìn)行第2次肝活檢，研究主要終點設(shè)為第12周MRI-PDFF值較基線的相對變化。研究除證實了Resmetirom對NASH顯著的臨床療效之外，另一個重要的意義是再次證實了MRI-PDFF值治療前后的縱向變化與肝組織學(xué)改變(脂肪變性、炎癥及氣球樣變)之間良好的相關(guān)性。試驗將MRI-PDFF值下降≥30%設(shè)為MRI-PDFF應(yīng)答，將NAS評分下降≥2分且其中至少有1分來自于炎癥或氣球樣變設(shè)為NASH緩解的組織學(xué)應(yīng)答，將NAS評分下降2分且氣球樣變評分為0分、炎癥評分為0或1分設(shè)為NASH逆轉(zhuǎn)的組織學(xué)應(yīng)答。分析結(jié)果顯示，第12周時出現(xiàn)MRI-PDFF應(yīng)答的受試者在第36周試驗結(jié)束時出現(xiàn)NASH緩解組織學(xué)應(yīng)答的比例為65%(30/46)，而未出現(xiàn)MRI-PDFF應(yīng)答的受試者僅有32%(11/34)第36周出現(xiàn)NASH緩解的組織學(xué)應(yīng)答，2組間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.006 3)；12周時出現(xiàn)MRI-PDFF應(yīng)答的受試者在36周試驗結(jié)束時出現(xiàn)NASH逆轉(zhuǎn)組織學(xué)應(yīng)答的比例為37%(17/46)，而未出現(xiàn)MRI-PDFF應(yīng)答的受試者僅有4%(2/27)達(dá)到NASH逆轉(zhuǎn)的組織學(xué)應(yīng)答，進(jìn)一步分析顯示，達(dá)到NASH逆轉(zhuǎn)的組織學(xué)應(yīng)答者M(jìn)RI-PDFF相對值平均下降50%、絕對值平均下降11%。此外，研究發(fā)現(xiàn)只有MRI-PDFF應(yīng)答者才會出現(xiàn)氣球樣變及炎癥積分的同時下降。

在Jayakumar等[17]的研究中，12例患者(18%)達(dá)到了組織學(xué)應(yīng)答(NAS評分下降≥2分)，計算出MRI-PDFF值預(yù)測組織學(xué)應(yīng)答的最佳閾值為相對下降≥25%。PDFF值相對下降≥25%的患者更易出現(xiàn)脂肪變性評分減少的改善(44% vs 22%)。此外，雖然在氣球樣變或匯管區(qū)炎癥的改善上PDFF值相對下降≥25%的患者與PDFF值相對下降<25%的患者相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，但相對下降≥25%的患者更易出現(xiàn)小葉炎癥評分的減少(50% vs 16%，P=0.016)。研究還發(fā)現(xiàn)PDFF值下降≥25%的患者的ALT(-31.8%vs -2.9%，P=0.001)和血清細(xì)胞角蛋白18-M30(-30.7%vs 4.9%，P=0.008)均出現(xiàn)更顯著的下降。

上述縱向研究中，PDFF值下降與炎癥或氣球樣變改善之間的相關(guān)性，表明藥物干預(yù)過程中肝脂肪含量下降越顯著越容易出現(xiàn)炎癥或細(xì)胞損傷的改善，PDFF值的變化可以部分預(yù)測組織學(xué)應(yīng)答效應(yīng)，這些為MRI-PDFF作為NASH臨床試驗療效評價替代終點提供了依據(jù)。

3 討論

需要前后2次肝組織學(xué)評估是目前NASH臨床研究存在的主要“瓶頸”。血清學(xué)指標(biāo)和影像學(xué)技術(shù)等非創(chuàng)性評價方法被引入到NASH臨床試驗中，并作為一些臨床試驗的終點來進(jìn)行探索性評價[23]。從現(xiàn)有的證據(jù)來看，MRI-PDFF作為一種無創(chuàng)技術(shù)可以準(zhǔn)確測量出肝脂肪含量，在評價肝脂肪變性時具有較高的準(zhǔn)確性。但是在橫向診斷時缺少PDFF值與小葉炎癥、氣球樣變以及NAS總評分之間存在穩(wěn)定相關(guān)性的證據(jù)，MRI-PDFF在臨床單獨診斷NASH時可能會缺乏一定的準(zhǔn)確性。事實上，肝臟內(nèi)脂肪堆積的程度與炎癥或氣球樣變可能并不直接相關(guān)，肝脂肪含量高的患者并不一定為NASH。此外，在NASH疾病進(jìn)展過程中，隨著纖維化的逐漸加重，肝內(nèi)脂肪含量反而會出現(xiàn)不同程度的減少。因此，MRI-PDFF顯然不能作為NASH診斷的工具。

在縱向評價藥物臨床療效方面，多項研究驗證了PDFF值相對降低與肝組織學(xué)改善之間具有較好的相關(guān)性，可通過MRI-PDFF的相對減少預(yù)測肝組織學(xué)的改善，表明MRI-PDFF具有作為評價藥物療效的臨床終點的潛力。上文提及的4項臨床試驗也分別證實當(dāng)患者M(jìn)RI-PDFF值相對下降25%～30%時，肝組織學(xué)評分減少≥2分的受試者比例更高。但需要注意的是，研究者[17，20-21]將組織學(xué)改善定義為“NAS評分下降2分”，并未限定降低分值的具體來源(脂肪變性、炎癥或氣球樣變)，脂肪變性評分在NAS總分中占3分，不能排除下降的2分均來自于脂肪變性評分，因此PDFF與該應(yīng)答之間的相關(guān)性缺少很強(qiáng)的說服力。然而。Harrison等[22]試驗中定義的NASH逆轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)為“NAS評分下降≥2分且氣球樣變?yōu)?分、炎癥評分為0或1分”，該標(biāo)準(zhǔn)是更為嚴(yán)格的療效終點，PDFF被證實與此組織學(xué)終點也具有顯著的相關(guān)性，這為PDFF值下降與臨床療效的相關(guān)性提供了有力的證據(jù)。

使用MRI-PDFF去評估藥物臨床療效，其實質(zhì)是通過肝內(nèi)脂肪含量的變化預(yù)測或評估其他病理特征(炎癥及氣球樣變)的改善。雖然上述研究證實了其可行性，然而，Bril等[24]使用氫質(zhì)子磁共振波譜檢測吡格列酮(pioglitazone)治療后肝脂肪含量的改變，卻未發(fā)現(xiàn)肝脂肪含量下降與組織學(xué)應(yīng)答(NAS評分下降≥2分且下降分值來自2個不同的組織學(xué)參數(shù)，同時無纖維化惡化)之間存在相關(guān)性，認(rèn)為NASH進(jìn)展中肝脂肪過度沉積引起的脂毒性損傷，可能僅靠脂肪含量的減少無法逆轉(zhuǎn)。此外，當(dāng)肝脂肪含量出現(xiàn)足夠明顯的下降(相對下降≥30%左右)時，雖然部分患者會出現(xiàn)除脂肪變性之外的其他組織學(xué)特征(炎癥、氣球樣變)的改善，但事實上也并不是所有患者都會產(chǎn)生組織學(xué)應(yīng)答。有研究者[4]分析，原因可能是從脂肪含量下降到進(jìn)一步出現(xiàn)炎癥或氣球樣變的改善可能需要一定的時間。

綜上，MRI-PDFF作為一種新興的無創(chuàng)技術(shù)，適用于定量肝脂肪含量，評價肝脂肪變性程度，但不能替代肝活檢作為NASH診斷的工具。在臨床療效評價方面，MRI-PDFF的相對下降可以一定程度地預(yù)測肝組織學(xué)的改善情況，具有作為臨床替代終點的潛力。但關(guān)于其能否成為NASH臨床試驗理想的替代終點還有待進(jìn)一步探究。MRI-PDFF與其他影像學(xué)或血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)用也可能是NASH臨床試驗無創(chuàng)傷療效評價的未來發(fā)展方向之一。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：安梓銘負(fù)責(zé)資料分析和撰寫論文；馮琴負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。