佟小非，孫亞朦，尤 紅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 肝病中心，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)的肝臟疾病。組織學(xué)上將NAFLD歸類為單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和NASH相關(guān)的肝纖維化、肝硬化[1]。目前，NAFLD的發(fā)病率逐年上升，全球約有25%的人口患有NAFLD[2]，2019年我國的NAFLD患病率已高達29.8%[3]。NASH是NAFLD進展中的重要環(huán)節(jié)，可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌等，對患者和社會造成重大的健康和經(jīng)濟負擔(dān)。然而，目前尚無通過隨機對照臨床試驗確證有效性和安全性的NASH治療藥物上市，新藥的研發(fā)是迫切的臨床需求。在新藥研發(fā)中，臨床結(jié)局的改善是評價藥物療效的硬終點，但對于NASH患者尤其是未合并肝硬化者，臨床結(jié)局的觀察通常需要數(shù)年的時間。因此美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)以及我國食品藥品監(jiān)督管理局允許在NASH藥物研究中合理使用“替代治療終點”。而“替代治療終點”如何定義以及是否可以反映臨床結(jié)局和獲益是新的挑戰(zhàn)。

1 臨床結(jié)局改善是NASH新藥評價硬終點

NAFLD和NASH新藥研究的重要臨床結(jié)局是全因死亡率和肝臟相關(guān)死亡率。改善臨床結(jié)局是NASH藥物治療的目標(biāo)。全因死亡率是許多可能導(dǎo)致死亡的慢性疾病治療方法臨床試驗的關(guān)鍵終點評估，包括NAFLD和NASH[4-5]。肝臟相關(guān)死亡是全因死亡的一個組成部分，與腹水、肝性腦病、靜脈曲張破裂出血、肝細胞癌、急慢性肝衰竭等肝臟失代償癥狀密切相關(guān)[6]。雖然全因死亡率和肝臟相關(guān)死亡率的降低是NASH藥物療效評價的理想終點，但NASH進展為肝硬化是緩慢的，研究[4-7]顯示平均7年肝纖維化進展1期，15%～20%的NASH患者可進展為肝硬化，NASH肝硬化的年發(fā)生率為4%[6-8]。NASH疾病發(fā)展緩慢的特點給治療藥物的研發(fā)帶來一定挑戰(zhàn)性，若要證明治療藥物能夠降低疾病的死亡率，對于早期的NASH患者需要10～15年的觀察期，這使得以臨床結(jié)局的改善作為新藥研發(fā)的終點缺乏可操作性，尤其對于非肝硬化NASH患者。

2 多個指南/指導(dǎo)原則明確可將組織學(xué)作為NASH新藥研發(fā)的替代終點

2.1 NASH的病理表現(xiàn)和評價體系 NASH的組織學(xué)特征包括大泡性脂肪變性、肝細胞氣球變性、散在的小葉性炎癥和凋亡小體、Mallory-Denk小體等。脂肪變性：在疾病的早期，脂變最嚴(yán)重的改變在腺泡3區(qū)，隨著疾病進展脂肪變性可均勻分布于整個肝腺泡或不規(guī)則分布。小葉炎癥：NASH炎癥主要為以小葉分布為主的混合炎性浸潤[9]，門靜脈炎癥雖不是診斷所必須的，但其嚴(yán)重程度與纖維化程度有關(guān)[10-11]。氣球樣變：氣球樣變是NASH中最重要的特征，典型的氣球樣改變的細胞是診斷NASH的重要證據(jù)[12]。纖維化：NASH纖維化通常始于3區(qū)竇周，顯示出典型的“雞籠樣”改變。隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，門靜脈也可出現(xiàn)纖維化，并發(fā)展為橋接纖維化和肝硬化。

目前被普遍接受的NAFLD/NASH主要病理評價體系包括：(1)Brunt系統(tǒng)，主要應(yīng)用于成人NASH的病理評價[13]。(2)美國NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)(CRN)提出的NAFLD Activity Score評分系統(tǒng)[14],該評價系統(tǒng)將NASH的病理表現(xiàn)歸類為脂變、小葉炎癥、氣球樣變3個組成部分，NASH疾病活動的程度即為3個組分評分的總和。NAS CRN系統(tǒng)由于對NASH疾病程度評價細致，因此作為組織學(xué)評價的標(biāo)準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于NASH臨床試驗和藥物研究中。(3)歐洲SAF/FLIP評分系統(tǒng)[15],該系統(tǒng)將NASH的評價分為脂變、活動度以及纖維化。SAF/FLIP 評分系統(tǒng)的優(yōu)點在于其囊括了NASH和纖維化的評價，并不存在不確定區(qū)域，因此適合用于臨床診斷。(4)兒童NAFLD評分系統(tǒng)[16],NAFLD兒童評分系統(tǒng)側(cè)重于門靜脈周圍炎癥的評價。

2.2 基于組織學(xué)的替代終點 為了滿足NASH新藥研究的需求，目前的新藥研究使用臨床硬終點的替代標(biāo)志物。替代標(biāo)志物需要經(jīng)過研究論證，能夠預(yù)測具有臨床意義的終點結(jié)果，既能反映疾病進程的變化，同時也與疾病的發(fā)病機理密切相關(guān)。替代終點通常需要能夠滿足兩點要求：(1)可預(yù)測臨床獲益；(2)可以預(yù)測不可逆的發(fā)病率或死亡率。

NASH組織病理學(xué)的典型表現(xiàn)可以為疾病的進展或逆轉(zhuǎn)提供信息，并且具有靈活、短期內(nèi)可評價的特點。肝纖維化的進展以與肝臟相關(guān)結(jié)局密切相關(guān)[17]，近期多項研究[17-20]顯示，肝纖維化程度是NAFLD長期預(yù)后關(guān)系最密切的影響因素，晚期纖維化與總體生存率的降低和肝臟相關(guān)死亡率的增加相關(guān)。而NASH疾病活動程度又是肝纖維化進展的促進因素，脂肪性肝炎的組織學(xué)緩解與纖維化的改善密切相關(guān)[21-22]，所以NASH的進展程度同樣需要關(guān)注。

2018 年FDA發(fā)布了NASH伴肝纖維化治療藥物的研發(fā)指南草案[23]，對于中度或橋接纖維化的NASH(纖維化2期和3期)，肝組織學(xué)改善可以作為治療終點，加快審批過程。2019年美國肝病學(xué)會和歐洲肝病學(xué)會對NAFLD臨床試驗終點的聯(lián)合報告[24]中指出，可以接受組織病理學(xué)作為NASH新藥試驗的替代終點。對于非肝硬化NASH研究，Ⅱb期的藥物臨床試驗建議使用的組織學(xué)替代終點為：NASH改善，纖維化不惡化(NAS評分降低≥2分，其中至少1分是小葉炎癥或氣球樣變)；或纖維化好轉(zhuǎn)1期及以上，NASH不惡化。Ⅲ期臨床試驗可接受的組織學(xué)替代終點為：NASH消退(氣球樣變消失，小葉內(nèi)炎癥灶的減少或消失)，纖維化不惡化；和/或纖維化好轉(zhuǎn)1期及以上，NASH不惡化。對于代償期NASH相關(guān)肝硬化的臨床試驗，仍建議繼續(xù)使用以臨床結(jié)局的改善為終點評價[23]，但組織學(xué)的改善也是Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗重要治療終點之一，即肝纖維化好轉(zhuǎn)至少1期，NASH無惡化[24]。

我國食品藥品監(jiān)督管理局在2019年頒布了《非酒精性脂肪性肝炎治療藥物臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[25]，其中對于NASH新藥研發(fā)的“后期探索”階段，推薦以組織學(xué)改善為主要療效指標(biāo)：(1)NASH改善，同時纖維化無惡化；或者，(2)肝組織纖維化改善1分及以上，同時NASH無惡化；或者，(3)NASH改善同時肝組織纖維化改善1分及以上。NASH改善定義為NAS評分至少降低2分，其中氣球樣變至少降低1分，脂肪變評分不增加。在確證性臨床試驗階段，對于無肝硬化的NASH患者，目前可接受的肝組織學(xué)替代終點包括脂肪性肝炎和/或纖維化的改善，推薦：(1)NASH緩解同時，纖維化無惡化；或者，(2)肝組織纖維化改善1分及以上，同時NASH無惡化；或者，(3)NASH緩解同時肝組織纖維化改善1分及以上。NASH緩解定義為NAS評分中炎癥評分為0～1分，氣球樣變評分為0分，脂肪變評分不增加。

2.3 組織學(xué)作為替代終點可能存在的問題 組織學(xué)可以作為NASH新藥研究替代終點，主要依據(jù)既往研究中組織學(xué)與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)合臨床治療經(jīng)驗和病理生理學(xué)的證據(jù)，認為有“合理可能性”來預(yù)測臨床獲益[26]。但目前仍缺乏足夠的證據(jù)證明達到組織學(xué)的替代終點者，NASH相關(guān)肝硬化失代償、肝細胞癌發(fā)生、肝臟相關(guān)死亡率及全因死亡率也明顯降低。在NASH新藥研發(fā)中，需要進一步研究來證明臨床獲益，以及對于臨床結(jié)局的改善。FDA肝臟病學(xué)與營養(yǎng)學(xué)部對于NASH新藥研發(fā)最新指導(dǎo)意見中強調(diào)，如果新藥研發(fā)基于組織學(xué)療效終點而獲得加速審批，仍需要進行Ⅳ期臨床結(jié)局的研究來驗證療效，Ⅳ期療效驗證研究的成功意味著申辦方開發(fā)的藥物可以獲得全面的上市批準(zhǔn)[23]。我國食品藥品監(jiān)督管理局同樣建議進行臨床試驗確證臨床結(jié)局的獲益，除上述結(jié)局事件的評估外，對于NASH無肝硬化的患者，還包括進展至肝硬化。

此外，組織學(xué)纖維化改善1期是較為普遍接受的替代治療終點。然而，研究顯示許多安慰劑組患者也得到了組織學(xué)的改善，一項對NASH藥物臨床試驗安慰劑效應(yīng)的Meta分析[27]顯示，安慰劑組NAS評分升高≥2分的比例僅為25%(95%CI: 21%～29%)，主要原因是參加臨床試驗的過程可以使受試者接收到且主動依從飲食的建議并開始鍛煉，達到體質(zhì)量下降的效果，從而導(dǎo)致安慰劑效應(yīng)比預(yù)期高，而觀察藥物的差異卻低于預(yù)期值。因此有學(xué)者提出，是否應(yīng)該制定更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，如纖維化好轉(zhuǎn)2期及以上，以增加特異性并降低安慰劑效應(yīng)，但因此可能會帶來增加樣本量和延長試驗時間等問題。

盡管組織學(xué)是NASH診斷及分級的金標(biāo)準(zhǔn)，但其本身仍有局限性，如嚴(yán)重的(約40%)抽樣誤差[28]、樣本長度以及匯管區(qū)數(shù)量不足等[29]，可能導(dǎo)致病理評估不充分或分級不準(zhǔn)。另外一個重要挑戰(zhàn)是不同病理學(xué)家之間診斷的一致性問題(組間差異性)，有時甚至與他們自己先前的診斷不一致(組內(nèi)差異性)[30]。針對以上問題，我國食品藥品監(jiān)督管理局要求NASH臨床試驗中要嚴(yán)格遵循病理樣本的標(biāo)準(zhǔn)操作流程(standard operation procedure，SOP)，為減少組織病理學(xué)評價的差異，采用中心閱片方式，建議由2名及以上肝臟病理專家進行雙盲讀片[25]。FDA建議通過對病理醫(yī)師的培訓(xùn)，提高病理評價的一致性，例如建立中央病理評審委員會，至少2名經(jīng)過培訓(xùn)的病理專家共同閱讀基線和治療后的切片，決定NAS的各個組成部分的評分，申辦方應(yīng)在Ⅲ期臨床試驗開始前詳細審查肝穿的執(zhí)行過程以及結(jié)果的判讀[23]。

近期人工智能在NASH病理評價中得到了應(yīng)用，一項研究[31]采用雙光子顯微鏡技術(shù)為基礎(chǔ)的纖維化參數(shù)(q-FP)來定量評價NASH纖維化水平。另一項研究[32]采用雙光子/二次諧波方法，量化NASH組織學(xué)中脂變、小葉炎癥、氣球樣變等組分。人工智能在NASH病理評價中的應(yīng)用，可能為提高病理診斷的一致性帶來新的可能性。

3 探索性終點——基于無創(chuàng)標(biāo)志物的終點

目前正在開發(fā)的NASH藥物主要分為三大類: 改善代謝類、抗炎類和抗纖維化類。NASH藥物臨床試驗的早期探索階段采用的終點，取決于該藥物內(nèi)在的作用機制。藥物的代謝效應(yīng)、抗炎、抗纖維化效應(yīng)仍在概念驗證階段，是否以及如何轉(zhuǎn)化為肝組織學(xué)的改善尚不明確，因此可以考慮以影像學(xué)、血清學(xué)、NASH肝纖維化無創(chuàng)模型等作為藥效學(xué)指標(biāo)，進行小樣本、短療程的藥動學(xué)/藥效學(xué)評估，全面了解藥物的暴露/效應(yīng)作用特點，為后續(xù)臨床試驗提供指導(dǎo)。目前包括我國、美國等食品藥品監(jiān)督管理機構(gòu)，允許在臨床試驗概念驗證的早期階段，以及藥物研發(fā)的后期作為次要以及探索終點使用無創(chuàng)的生物標(biāo)志物(即劑量探索階段或 Ⅱb/Ⅲ 期臨床試驗)，并鼓勵臨床研究使用和開發(fā)無創(chuàng)生物標(biāo)志物，使可靠性強、一致性好的無創(chuàng)標(biāo)記物可以作為療效的替代終點來反映臨床獲益。

3.1 影像學(xué)評價 肝細胞脂肪變是NAFLD的重要病理改變，在非肝硬化患者中，肝脂肪變性的完全消除可能伴隨著NASH的改善[33]。在以降低肝脂肪為靶點的NASH藥物的Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗中，越來越多研究傾向于使用MRI質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)(MRI-PDFF)定量評估肝脂肪變性作為主要療效終點。MRI-PDFF具有無創(chuàng)、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點，可以測量整個肝臟各個區(qū)域的脂變，對細微的脂肪比例變化較為敏感[34]，在規(guī)范培訓(xùn)和良好質(zhì)控的前提下，可以用MRI-PDFF 改變的絕對值或者相對百分比評價以肝脂肪變?yōu)橹委煱悬c的藥物。

基于彈性成像的方法確定的肝硬度，包括瞬態(tài)彈性成像(VCTE)、磁共振彈性成像(MRE)和剪切波彈性成像(SWE)提供了肝纖維化程度的較為準(zhǔn)確的評價。但目前尚無充分證據(jù)表明，基于彈性成像的影像學(xué)方法可以預(yù)測NASH肝纖維化的變化。一項研究[35]顯示，VCTE檢測肝硬度(LSM)增高的NAFLD患者，30%重復(fù)檢測后LSM值可在正常范圍內(nèi)。由于VCTE受到肝臟炎癥、膽汁淤積、操作規(guī)范等多因素影響，尚不能作為判斷纖維化療效的替代終點。MRE在不同的纖維化分期均具有較高的準(zhǔn)確性[36]。在一項selonsertib的Ⅱ期臨床試驗[37]中，MRE預(yù)測6個月內(nèi)纖維化ROC曲線下面積(AUC)為 0.62，包含基線的MRE值可使AUC增至0.79。另有研究[38]顯示MRE測量的肝硬度值下降15%，組織學(xué)肝纖維化則下降1期。以上研究表明MRE有可能成為判斷肝纖維化的替代終點，但是需要進一步驗證。

3.2 血清學(xué)評價 血清學(xué)無創(chuàng)評價指標(biāo)包括：(1)糖脂代謝相關(guān)，體質(zhì)量、BMI、空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗(如HOMA-IR)、血脂等。(2)肝臟炎癥/損傷相關(guān)，ALT、AST、CK18片段等。(3)肝纖維化相關(guān)，F(xiàn)ibroTest、ELF、NAFLD纖維化評分(NFS)、Pro-C3、FIB-4、APRI等。在NASH新藥研究中，可考慮將無創(chuàng)血清學(xué)指標(biāo)作為藥效觀察的次要或探索終點。雖然許多非侵入性生物標(biāo)志物正在研究中，以期作為臨床研究的替代標(biāo)志物，但目前為止并沒有證據(jù)顯示無創(chuàng)血清標(biāo)志物可以預(yù)測臨床獲益，仍需進一步研究來尋找可靠性強、一致性好的無創(chuàng)血清標(biāo)志物用于未來的臨床研究。

3.3 其他 用于評價肝硬化臨床結(jié)局的指標(biāo)包括肝靜脈壓力梯度和肝功能Child-Pugh評分、MELD評分的變化。既往研究顯示，以上評分或模型與肝硬化失代償?shù)冉K點事件有較強相關(guān)性，在NASH合并肝硬化患者的新藥研發(fā)中有作為候選替代終點的潛力，然而仍需要進一步驗證其反映治療預(yù)后變化和臨床結(jié)局的能力。

4 總結(jié)

NAFLD及NASH的疾病負擔(dān)日益增加，而目前尚無有效治療藥物是迫切需要解決的問題。NAFLD/NASH的治療目標(biāo)是延緩、阻止、逆轉(zhuǎn)疾病的進展，改善臨床結(jié)局，包括降低肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生，降低肝移植的需求，提高存活率，改善生活質(zhì)量等。然而，作為硬終點的臨床結(jié)局的觀察時間過長，不能滿足亟待解決的臨床治療需求。對于無肝硬化的NASH，藥物的早期概念驗證階段可采用無創(chuàng)評估方法，包括MRI-PDFF、MRE等影像學(xué)改變，以及肝臟疾病特異性的血清學(xué)指標(biāo)的變化等共同評價肝脂肪含量、炎癥和纖維化。在后期探索和確證性臨床試驗階段，評估藥物療效的終點集中于改善NASH和纖維化的組織學(xué)特征。同時，需要長期隨訪來評估這些組織學(xué)替代終點是否與硬終點的改變平行。對于合并肝硬化的NASH新藥研發(fā)，應(yīng)結(jié)合臨床結(jié)局、組織學(xué)以及無創(chuàng)指標(biāo)共同作為療效終點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：佟小非負責(zé)文獻檢索，文章框架設(shè)計，論文撰寫；孫亞朦負責(zé)論文修訂；尤紅負責(zé)文章結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵內(nèi)容審定，終審定稿。