郭朝陽，芮法娟，李 婕

山東大學附屬山東省立醫(yī)院 感染性疾病科，濟南 250021

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟疾病，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH相關肝硬化和肝細胞癌(HCC)等。NAFLD的患病率隨著肥胖、血脂異常、糖尿病等代謝綜合征(MS)相關疾病的流行呈逐年增長趨勢，目前已成為全球的第一大慢性肝病[1]。本研究組對亞洲的NAFLD患病率進行薈萃分析，結果顯示亞洲國家普通人群中NAFLD患病率為29.62%，中國大陸高達29.81%[2]。若不采取有效的干預措施，25%的NAFLD患者會進展為NASH，NASH患者10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達15%～25%[3]。因此，NASH已成為嚴重的全球性公共健康問題，是日益增長的肝硬化和肝癌的主要原因之一[4]。

NASH的治療目標是延緩、阻止、逆轉疾病的進展，改善臨床結局，包括降低肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生，降低肝移植的需求，提高存活率，改善生活質量等。然而，目前的干預措施除改變生活方式(飲食及運動干預等)實現(xiàn)減重可使部分患者獲益外，尚無臨床試驗確證有效和安全的治療NASH藥物。即使在接受減重手術的NASH伴肝纖維化患者中，50%以上的患者肝纖維化程度并未改善甚至惡化，因此針對NASH患者肝臟損傷的藥物治療至關重要[5]。NASH新藥研發(fā)過程中的一些關鍵因素更新迅速，我國和美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)均針對NASH藥物研發(fā)發(fā)布臨床研究指南征求意見稿[6-8]，但因疾病發(fā)病機制復雜、患者異質性大等而面臨諸多挑戰(zhàn)，雖然目前有超過50種治療藥物正處于臨床研發(fā)階段，但臨床試驗成功率低，對該領域患者的臨床治療需求未得到滿足，仍存在諸多關鍵未決問題。

1 目標研究人群臨床表型的復雜性

NASH的發(fā)病機制至今尚未明確。之前多數(shù)學者支持以線粒體反應氧體系(ROS)為核心的氧應激和脂質過氧化對肝臟造成的進一步損傷理論，即“二次打擊”理論。隨著臨床和基礎研究的深入，目前NASH被認為是一種與胰島素抵抗、氧化應激、脂質過氧化和MS的各種表型密切相關的疾病[9]。

臨床上NASH患者常同時合并2型糖尿病(86.29%)、高血壓(85.23%)、高脂血癥(79.81%)、心血管疾病(35.76%)、肺部疾病(18.10%)、腎衰竭(15.77%)和甲狀腺疾病(14.95%)等代謝相關疾病[10-12]。但有的NASH患者無肥胖和高血壓等MS表現(xiàn)，而有的則可能伴隨一種或多種MS組分。因此，臨床上肝臟和肝外病變不同嚴重程度組合，決定了NASH患者的臨床表型非常復雜，這些復雜的臨床表型不僅會促進疾病進展，其對療效的影響亦不可忽視。某一類NASH的新藥，可能對所有的表型都有效，也可能只是對某個表型有效，對其他表型無效甚至有害。例如乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪合成中的關鍵酶，在調節(jié)代謝中發(fā)揮重要作用。ACC抑制劑在臨床研究中能有效降低肝臟脂肪含量，但卻意外升高血漿甘油三酯(TG)，帶來了心血管的安全隱患；盡管法尼酯衍生物X受體(FXR)激動劑奧貝膽酸Ⅲ期臨床試驗證實會減少肝臟纖維化，但它作為肝臟TG重要的調節(jié)因子，長期用藥會導致循環(huán)膽固醇升高和不良心血管事件發(fā)生，而且在亞洲人群的不良反應較高。

此外，由于NASH患者對藥物所致的肝損傷敏感性增加，有時藥物可能誘發(fā)肝損傷加重，以及NASH本身具有增加慢性腎臟疾病的風險，比如過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)δ激動劑Seladelpar改善NASH的相關指標卻增加發(fā)生界面性肝炎的風險。因此，在研發(fā)藥物時應將可能的肝臟毒性以及腎臟損傷性考慮在內(nèi)，并在臨床試驗中設立相應的監(jiān)測計劃。對于伴有高血壓、糖尿病等合并癥的NASH患者，如果同時服用降壓、降糖藥物，應重點關注NASH新藥與以上疾病常用藥物合并用藥的藥物相互作用，是否會影響臨床療效的評價。NASH新藥研發(fā)需要考慮這些異常代謝因素對藥物療效潛在的影響以及藥物是否有加重原有疾病的風險。一個有效的新藥在不合適(無效)的人群中開展研究，得到的只能是不正確的結果，從而錯誤地判斷此藥無效或者有害。在臨床實踐中，往往需要針對每一個新藥進行評估，綜合考慮新藥的作用靶點、臨床定位、臨床前研究和前期臨床研究的有效性和安全性等，從而選擇納入臨床試驗的真正合適的患者群體[13]。例如，隨機分組時可以考慮針對不同合并癥采用分層隨機化的方法，如考慮糖尿病、高血壓等并存疾病因素，避免藥物影響原有疾病。因此，藥物研發(fā)方案設計中針對目標研究人群的考慮，實則是設定一個NASH新藥的真正合適的患者群體，這對新藥成功研發(fā)是非常重要的。

2 起始治療節(jié)點以及臨床治療終點的合理性

關于NASH起始治療節(jié)點的選擇，一般認為，對藥物的依賴性應該是只有進展到NASH才形成。但從內(nèi)分泌角度來看，單純性脂肪肝(不伴有NASH)作為內(nèi)臟肥胖的標準，就應該進行干預，只有脂肪肝早期治療才能阻斷其進展NASH和纖維化/肝硬化；同時又能減少脂肪肝誘發(fā)的全身代謝紊亂。而從肝病角度來看，只有晚期纖維化患者中肝臟相關事件的風險較高，認為NASH臨床試驗最好的治療時機是在NASH伴有纖維化階段(F2～3)，尤其是橋接樣纖維化受試者的成本效益和社會獲益會更高。特別是這個階段疾病進展較快，藥物治療能夠突顯效果，并對肝損傷進展的獨立危險因子——纖維化程度能夠進行客觀評估，這部分患者也是最迫切需要治療的[14-15]。因此，2018年FDA發(fā)表的指南明確指出脂肪肝和輕度NASH不是藥物開發(fā)的首要目標，這個階段可以通過改變生活方式進行控制和治療；需要藥物干預的主要是纖維化2～3級的非肝硬化NASH和纖維化4級的代償期肝硬化，建議根據(jù)纖維化評估來確定需要藥物治療的NASH人群。

在藥物研發(fā)過程中，臨床治療終點的準確選擇對于NASH藥物療效的評價意義重大。是否能夠反映臨床結局、預測臨床獲益是終點選擇的基本原則。NASH新藥研發(fā)最重要的臨床結局是全因死亡率。因此，全因死亡率降低是NASH臨床試驗的硬終點。肝臟相關死亡率是全因死亡率的一個重要組成部分，常與進展為肝硬化、出現(xiàn)失代償事件(腹水、食管胃底靜脈曲張出血、肝性腦病和肝腎綜合征等)、肝移植和進展為肝癌密切相關[5]。一旦患者出現(xiàn)上述硬終點事件，通常意味著死亡風險顯著增加。然而，NASH經(jīng)常與糖尿病、肥胖和心血管等疾病共存。這些疾病互為因果，相互促進[16]。實際上，NASH患者首要死因是心腦血管疾病，而非終末期肝病。這給以全因死亡為主要終點的驗證性臨床試驗帶來極大的復雜性；此外，NASH進展為肝硬化的過程通常非常緩慢，如果以全因死亡率和肝臟相關死亡率降低作為主要研究終點，對于大部分早期NASH患者可能需要隨訪至少長達10～15年才能看到新藥的效果，這在新藥研發(fā)和審批的實踐中并不可行[9]。因此，藥物研發(fā)中關鍵因素是識別和驗證能預測進展為硬終點的替代終點[16-18]。

對治療NASH的新藥而言，替代終點的改善可以反映患者進展為肝硬化、出現(xiàn)失代償事件和進展為肝癌的風險顯著降低，進而預測新藥降低全因死亡率和肝臟相關死亡率的臨床獲益。理想的替代終點應該是在NASH的早期階段能預測未來向硬終點發(fā)展的風險，且在治療中變化靈敏，可以反映疾病進展風險的降低[6]。目前，常用的替代終點有基于肝臟組織病理學的替代終點，然而組織學作為替代終點仍存在諸多問題。肝活組織檢查有一定的風險，不能作為常規(guī)多次隨訪的手段，患者依從性較差。組織學評價質量也受多種因素影響，包括活檢方式/類型、穿刺部位、穿刺針規(guī)格以及病理學評估的偏倚等[9,19]。近來有大量研究[20-22]致力于用無創(chuàng)的方法診斷或評估NASH和肝纖維化，并取得一定進展，其中包括生化、氧化應激、炎癥、凋亡和纖維化的諸多生物標志物或組合指標，以及基于影像學技術的肝纖維化的判斷方法，如MRI彈性成像、瞬時彈性成像等。美國FDA認為早期臨床試驗嘗試提供概念驗證的證據(jù)，或者確定藥物的合適劑量，可采用無創(chuàng)的替代評價指標，如肝臟血清轉氨酶或者其他生物學標志物作為終點。在Ⅱb/Ⅲ試驗中，可以考慮使用與肝臟相關結局聯(lián)系密切的替代終點如纖維化評分、MRI質子密度脂肪含量測定和MRI彈性成像等[23]。

3 多靶點藥物的聯(lián)合應用

隨著對NASH發(fā)病機制研究的不斷深入，胰島素抵抗、脂肪毒性、氧化應激、免疫或細胞因子或線粒體功能改變，以及細胞凋亡等共同參與了NASH的發(fā)生和發(fā)展[24]。針對這些發(fā)病機制的靶向干預是當前研究的熱點，當前NASH藥物研發(fā)主要分為三類：調節(jié)代謝和能量，調節(jié)免疫和炎癥，控制纖維化進展[25]。治療靶點及相應制劑主要有PPARα/δ雙激動劑(脂代謝類)、凋亡信號調節(jié)激酶1抑制劑(抗氧化抗炎類)、長效胰高血糖素樣肽-1受體激動劑(胰島素抵抗)、FXR激動劑(脂代謝類)、成纖維細胞生長因子-19(脂代謝類)、甲狀腺激素受體-β激動劑(脂代謝類)、CC趨化因子受體2和5抑制劑(抗肝纖維化)等[26]。

目前這些治療靶點的探索分別處在不同的研究階段，但是多數(shù)研究僅僅是圍繞單一靶點干預展開。由于NASH的病因復雜，作為MS的一個組分，很難準確地建立一種導致或者驅動肝病進展的病因優(yōu)先級。目前在研藥物的作用靶點相對分散，有的甚至作用靶點也未明確。藥物研發(fā)的難點在于這些生物信號通路相互交織，互為因果，同時伴隨著肥胖、糖尿病以及心血管風險，靶向其中的一個通路或靶點，有時不足以產(chǎn)生療效甚至帶來副作用。而且個體患者發(fā)病機理和進展階段不盡相同，簡單說單一靶點藥物在不同患者不一定達到相同藥效，單靶點治愈NASH的可能性很小。因此，針對NASH發(fā)病機制不同靶點的多種藥物聯(lián)合干預，機制互補的組合尤其值得期待，治療靶點需要兼顧防治肝脂肪變、炎癥、肝細胞損傷及纖維化,如研究中涉及多個藥物多靶點聯(lián)合治療或固定劑量復方制劑，需要提供聯(lián)合用藥的充分依據(jù)，比如抑制ACC導致非飽和脂肪酸的反饋，PPAR通路被抑制，臨床表現(xiàn)為TG升高，依靠優(yōu)化藥物分子難以克服，但可以考慮的解決方案是與PPAR或者FXR激動劑聯(lián)用。此外，與治療代謝疾病的藥物進行聯(lián)合，可能會給研究帶來更多的思路，例如奧貝膽酸導致循環(huán)膽固醇升高，可能需要與他汀類藥物聯(lián)合用藥[26-27]。

4 可有效預測療效的體外細胞/動物模型

FDA建議研發(fā)人員使用動物模型篩選潛在新藥。構建NAFLD合適的模型進行臨床前研究，對于測試靶點的合理性和藥物的成藥性至關重要。理想的動物模型應與人類疾病特征相似，能夠模擬人類疾病狀態(tài)和進程；穩(wěn)定性好，可重復性高，造模方法簡便可行。與人源化模型相比，NASH動物模型中需要對人類疾病的所有元素進行建模，這顯然具有較大的挑戰(zhàn)性。在臨床前動物試驗中，動物模型必須解決幾個關鍵問題：能否忠實的復制疾病的所有特征？動物對特定藥物的反應是否表明患者也可能有此類反應？另一挑戰(zhàn)是嚙齒類動物對藥物的反應比人類更敏感，從鼠模型中能夠看到比人類實際中更多種類的疾病。雖然NASH動物模型眾多，但由于這些病理特征難以同時在臨床前模型中模擬，沒有任何模型能夠理想的模擬人類的NASH環(huán)境、發(fā)病機制和病理特征，不同靶點藥物可能在不同的模型中發(fā)揮功效，從而導致NASH藥物從臨床前數(shù)據(jù)到臨床患者療效的轉化率很低[28-29]。目前之所以沒有FDA批準的NASH治療藥物，部分歸因于缺乏生物學相關的臨床前模型。因此，新藥研發(fā)成功的一個關鍵點在于選擇合適的臨床前動物模型，可以密切反映人類的病理生理學對于驗證藥物靶點和確定藥物的作用方式非常重要。

目前，NASH動物模型眾多，但沒有任何模型能夠完全模擬NASH的環(huán)境、機制和病理特征。NASH的小鼠模型通常是飲食模型，沒有遺傳或基因突變因素參與。比如瘦素(ob/ob)缺乏模型，代謝特征明顯，但是在無外加條件下，很難發(fā)生肝纖維化，最重要的是，在人類NAFLD中，血清瘦素通常呈現(xiàn)升高的狀態(tài)[28,30]。蛋氨酸膽堿缺乏(MCD)飼料誘導的NASH模型基因表達譜和人類NASH較接近，但缺乏代謝紊亂特征且體質量隨試驗延長明顯降低，與人類NAFLD代謝過程明顯不同[29]?；瘜W(CCl4)或者物理損傷(BDL)可以方便地誘導纖維化，但機制上完全有別于NASH。而且，NASH一般與糖尿病、高脂血癥、心血管等疾病共存，目前，很少有模型能夠綜合反映多種疾病共存的特征。在NASH藥物研發(fā)中，為了結果的可重復性，試驗動物盡量保持各種因素統(tǒng)一，然而臨床試驗中，個體差異無法排除，包括性別、年齡、基因背景、生活習慣、腸道菌群和基礎疾病等。這也是臨床前結果不能轉化的重要原因。而且NASH動物造模時間長，特別是飲食誘導的模型，周期從幾個月到1年以上，導致NASH藥物研發(fā)成本高，效率低[31]。

因此，尋找其他創(chuàng)新的臨床前模型也是NASH領域的研究熱點。模擬人體3D細胞技術平臺，其中就包括模擬NASH的復雜性，提高藥物發(fā)現(xiàn)和安全性測試效率。目前，無論是在工業(yè)界還是學術界，都認為將實驗動物模型轉向3D細胞模型更有意義，它具有很多技術和實踐優(yōu)勢。

5 總結與展望

目前尚無獲得批準的NASH治療藥物，考慮到NASH的高患病率、終末期肝病日益加重的負擔，研制減緩、停止或逆轉NASH的新藥具有巨大的臨床需求。鑒于尚未有標準來確定哪些NAFLD患者會進展為NASH，目前藥物研發(fā)的重點放在開發(fā)非肝硬化NASH伴肝纖維化的治療上，而且NASH進展緩慢，并且需要時間來評估臨床終點，如肝硬化或生存期。因此，將考慮可以合理地預測臨床獲益，我國食品藥品監(jiān)督管理局2019版指導原則推薦采用臨床結局終點和肝組織學(炎癥或/和纖維化)替代終點。此外，由于NASH發(fā)病多重作用機制，多同時伴隨著肥胖、糖尿病以及心血管等并發(fā)癥，導致NASH漸進演變及其異質性異常復雜，NASH新藥研發(fā)需要考慮這些異常代謝因素對藥物療效潛在的影響以及藥物是否有加重原有疾病的風險，選擇適宜的目標治療人群對于評價新藥的有效性至關重要。目前NASH新藥研發(fā)缺少適宜的體外模型來測試靶點的合理性和藥物的成藥性。雖然現(xiàn)有多種針對不同治療靶點的探索分別處在不同研究階段，但是多數(shù)研究僅僅是圍繞單一靶點干預展開的，使得NASH藥物研發(fā)成功率較低。針對發(fā)病機制的多靶向聯(lián)合干預是當前研究的熱點，聯(lián)合多靶點用藥會是未來治療的一個發(fā)展方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李婕負責文章思路設計；郭朝陽、芮法娟負責文獻數(shù)據(jù)獲取分析；李婕、郭朝陽、芮法娟負責起草或修改文章關鍵內(nèi)容。