曹 楊，舒 磊，馮旰珠*

1南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京210011；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院呼吸科，江蘇 南京211166

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstractive pulmonary disease，COPD）是最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，因慢性持續(xù)性氣道炎癥、小氣道病變、肺氣腫及肺彈性減退最終導(dǎo)致不可逆氣流受限和通氣功能障礙［1］。該病是肺部慢性疾病死亡的主要原因之一，它不僅增加了患者痛苦，而且增加了其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推測(cè)，至2030年COPD將成為全球死亡率第三的疾?。?-3］。長(zhǎng)期以來(lái)，煙草煙霧及生物燃料燃燒造成的室內(nèi)空氣污染被認(rèn)為是COPD發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，氣道內(nèi)細(xì)菌的定植與感染則是COPD急性加重的主要誘發(fā)因素［4-6］。

近年來(lái)隨著微生物菌群研究的不斷深入，呼吸道及腸道菌群與COPD的關(guān)系也成為研究熱點(diǎn)。運(yùn)用經(jīng)典培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，健康人群下呼吸道及肺是無(wú)菌的，而COPD患者呼吸道則被條件致病菌定植［7］。然而，16S rRNA基因測(cè)序表明下呼吸道無(wú)論在健康還是患病狀態(tài)下均存在著大量微生物群落。早期的基因測(cè)序研究主要針對(duì)腸道菌群，近來(lái)研究表明，呼吸道如同腸道一樣也存在著大量定植菌，且因呼吸道和腸道是與外界直接相通的空腔臟器，有著共同的胚胎起源，故呼吸道和腸道之間存在“腸-肺”軸的內(nèi)在聯(lián)系［8-9］。甚至研究顯示，在COPD不同表型中，呼吸道菌群存在不同特征，且腸道菌群與COPD發(fā)生發(fā)展、治療也存在緊密聯(lián)系。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于COPD菌群特征的相關(guān)研究歸納總結(jié)，旨在為COPD的防治提供新思路。

1 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)在人體微生物組學(xué)中的應(yīng)用

早在1990年人類基因組計(jì)劃（human genome project，HGP）通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，人類基因組含有約2.6萬(wàn)個(gè)基因，人類體表（皮膚）及體內(nèi)（消化道、口鼻、生殖道）擁有龐大的微生物群落，其總數(shù)達(dá)到人類自身細(xì)胞數(shù)的10～100倍［10］。作為HGP的延續(xù)，2007年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院?jiǎn)?dòng)了人體微生物組計(jì)劃（human microbiome project，HMP），分別對(duì)239例健康成人的5個(gè)身體部位（口、鼻、腸道、泌尿道及皮膚）樣本，進(jìn)行微生物組基因測(cè)序，基本明確了健康人群正常微生物組的組成及分布［11］。而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，下呼吸道即使在健康狀態(tài)下也存在著不同的細(xì)菌群落［12］。

傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)診斷通常依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，但陽(yáng)性率低，16S rRNA基因測(cè)序則因其高靈敏性逐漸成為微生物的檢測(cè)和鑒定的重要方法［13］。16S rRNA基因廣泛存在于所有微生物中，具有高度保守性及特異性，包含10個(gè)恒定區(qū)和9個(gè)可變區(qū)（V1～V9），大規(guī)模的16S rRNA基因分析是基于V1～V3或V4～V5可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，V1～V3區(qū)幾乎可鑒定除部分腸桿菌科以外所有的細(xì)菌，V4～V5區(qū)具有較高的特異性［14］。對(duì)相應(yīng)可變區(qū)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)用Illumina、454焦磷酸測(cè)序等高通量技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)讀取大量短核苷酸序列［15-16］，使用微生物生態(tài)學(xué)定量解析（quantitative insight into microbial ecology，OIIME）工具包根據(jù)97%的序列相似度進(jìn)行比對(duì)及聚類分析，從而得到一系列操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），并在不同微生物群落門、種、屬層面按OTU對(duì)物種多樣性及豐富度，如α多樣性、β多樣性進(jìn)行鑒定與分析［17］。近年來(lái)，研究者運(yùn)用這種快速敏感技術(shù)，對(duì)人體不同器官及不同疾病狀態(tài)下微生物群落的特征進(jìn)行分析，得到一些明確結(jié)論，對(duì)疾病的診斷起到重要作用。

2 呼吸道微生物菌群組成

2010年，Hilty等［18］首次通過(guò)對(duì)健康人、哮喘患者和COPD患者的口咽、鼻咽及左上肺支氣管黏膜刷檢樣本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)健康人支氣管樹并不是無(wú)菌的。后續(xù)研究結(jié)果顯示，健康下呼吸道高豐度菌群在門水平多為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidertes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）及放線菌門（Actinobacteria）；而在屬水平則多為鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、韋榮氏菌（Veillonella）、普雷沃氏菌（Prevotella）及嗜血桿菌（Hemophileae）［13，18-21］。這些細(xì)菌在健康人群呼吸道內(nèi)定植與人體共生，發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用。呼吸道菌群疾病狀態(tài)下與健康狀態(tài)下存在明顯差異，有研究通過(guò)對(duì)囊性肺纖維化（cystic fibrosis，CF）患者痰液測(cè)序后發(fā)現(xiàn)：CF患者肺內(nèi)厭氧菌（Anaerobe）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌群較健康者豐度顯著增高［22-23］。Strachan［24］則在1989年提出兒童期感染減少與哮喘的發(fā)生明顯關(guān)聯(lián)這一觀點(diǎn)，從而開創(chuàng)了“衛(wèi)生假說(shuō)”這一理論。此后的研究發(fā)現(xiàn)，兒童期抗生素使用與哮喘發(fā)生呈正相關(guān)，表明哮喘的發(fā)生與微生物菌群的紊亂相關(guān)。研究顯示，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中變形菌門豐度明顯增高，而擬桿菌門的豐度則顯著下降［18，25］。

3 COPD患者呼吸道菌群的特征

3.1 COPD患者呼吸道微生物菌群種類及其多樣性

通過(guò)對(duì)COPD患者呼吸道標(biāo)本測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門等4種高豐度門，鏈球菌、普雷沃氏菌、莫拉菌（Moraxella）、嗜血桿菌、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、梭桿菌（Fusobacterium）和奈瑟菌（Neisseria）等7種高豐度屬，占據(jù)總序列數(shù)的60%［26-27］。Hilty等［18］將COPD患者的氣道微生物多樣性與健康對(duì)照組對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，COPD患者較對(duì)照組氣道內(nèi)變形菌門豐度明顯升高，尤其以嗜血桿菌屬變化最為顯著，而擬桿菌門，特別是其中的普氏菌屬，豐度較對(duì)照組明顯下降。

3.2 吸煙對(duì)COPD呼吸道內(nèi)菌群的影響

吸煙是COPD氣道慢性炎癥的主要危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致了COPD的發(fā)生與發(fā)展，且戒煙后對(duì)氣道的炎性損害可持續(xù)存在。煙草的暴露致使肺部先天性防御能力受損，上氣道潛的在定植菌（potentially pathogenic microorganisms，PPM）通過(guò)呼吸的抽吸過(guò)程進(jìn)入下呼吸道，引起氣道上皮受損、誘發(fā)免疫細(xì)胞激活，此過(guò)程周而復(fù)始形成惡性循環(huán)，即“惡性循環(huán)假說(shuō)”理論［28］。Sethi等［29］通過(guò)對(duì)穩(wěn)定期COPD戒煙者（戒煙＞1年）、健康戒煙者（既往吸煙目前已戒煙＞1年）及健康非吸煙者（既往從未吸煙）的BALF檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：34.6%（9/26）COPD患者，0%（0/20）的健康戒煙者及6.7%（1/15）非吸煙者存在PPM，如流感嗜血桿菌（占比26.9%），COPD組的中性粒細(xì)胞量、白介素-8（interleukin-8，IL-8）和金屬蛋白酶-9（metalloproteinase-9，MMP-9）水平顯著增加，且COPD組BALF中的內(nèi)毒素水平明顯高于另外兩組，僅COPD組可見PPM，該研究結(jié)果表明香煙煙霧是導(dǎo)致COPD發(fā)病及氣道內(nèi)致病菌群定植的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，且戒煙后可持續(xù)存在。Wang等［30］對(duì)COPD目前吸煙、COPD已戒煙及健康對(duì)照組的吸煙、未吸煙狀態(tài)下的痰液菌群研究后發(fā)現(xiàn)，健康吸煙組較COPD吸煙組患者氣道中的變形菌門，嗜血桿菌屬豐度明顯增高；有趣的是，COPD吸煙組較COPD已戒煙組氣道內(nèi)變形菌門、嗜血桿菌屬反而顯著下降，從而驗(yàn)證了“吸煙導(dǎo)致COPD氣道炎癥和菌群紊亂，且戒煙不能逆轉(zhuǎn)該進(jìn)程”這一觀點(diǎn)，符合“惡性循環(huán)假說(shuō)”理論。

3.3 COPD急性加重期菌群變化

COPD患者呼吸道菌群不僅與正常人群存在差異，而且即使同一患者，其急性加重前后微生物群落也有不同。Wang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在急性加重期呼吸道菌群較穩(wěn)定期有顯著變化，急性加重期菌群多樣性降低，變形菌門尤以嗜血桿菌、莫氏菌豐度增加，厚壁菌門中葡萄球菌顯著下降。Sun等［31］在研究了15例COPD患者急性加重D1（加重期）、D7及D14（緩解期）氣道分泌液的菌群后，得出與Wang等［27］類似的結(jié)果，加重期較緩解期莫氏菌豐度增加了5%，嗜血桿菌增加3.0%，鏈球菌則減少3.8%；Molyneaux等［32］研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者感染鼻病毒（rhinovirus）后其致病流感嗜血桿菌豐度顯著增加。這些研究表明，COPD急性加重在很大程度上與微生物多樣性降低及變形菌比例的增加有關(guān)。

由上述可見，COPD患者是無(wú)論穩(wěn)定期還是急性加重期，抑或吸煙，均可見下呼吸道以變形菌門尤其是嗜血桿菌增加為主。因此有理由推測(cè)，嗜血桿菌可能系COPD患者呼吸道的“關(guān)鍵物種”，其在擾亂呼吸道微生物生態(tài)系統(tǒng)，使之進(jìn)入失調(diào)狀態(tài)，引發(fā)氣道促炎反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［33］。因此，針對(duì)變形菌門嗜血桿菌屬進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)可能是COPD防治的一個(gè)潛在選擇。

3.4 藥物治療對(duì)COPD呼吸道菌群的影響

糖皮質(zhì)激素及抗生素治療是COPD急性加重期治療過(guò)程中最常用的藥物。相關(guān)研究表明，這兩類藥物的應(yīng)用可改變COPD患者下呼吸道的菌群。接受糖皮質(zhì)激素治療的COPD患者下呼吸道菌群α多樣性下降，嗜血桿菌和莫拉菌豐度增加，鏈球菌屬豐度下降，而抗生素的使用則可觀察到與上述相反的結(jié)果［27］。

微生物群落由多種微生物物種組成，各物種間既需要爭(zhēng)奪空間和資源，又需要相互協(xié)同相互作用，這種現(xiàn)象可用“關(guān)鍵物種”假說(shuō)來(lái)解釋：即相對(duì)較低的細(xì)菌豐度的微小變化，也可能對(duì)其微生物群落組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，從而改變機(jī)體的疾病狀態(tài)，似有“牽一發(fā)而動(dòng)全身”的現(xiàn)象［34］。

4 腸道微生物菌群對(duì)COPD的影響及治療價(jià)值

HMP表明人類腸道中有1×1014～1×1015個(gè)微生物，其細(xì)菌種類達(dá)1 000多種［11］。在門水平上，高豐度菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門占所有菌門的90%；在屬水平上，最常見菌為雙歧桿菌（Bifdobacterium），擬桿菌屬，乳桿菌（Lactobacillus），腸球菌（Enterococcus），鏈球菌和柔嫩梭菌（Faecalibacterium），其核心菌門與下呼吸道核心菌門相似［35-36］。

根據(jù)與宿主的關(guān)系腸道菌群可分為共生菌、條件致病菌和病原菌。其中，共生菌能刺激并提高身體的免疫機(jī)能，共生菌中的乳桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌（Clostridium）等可將膳食纖維發(fā)酵成短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），這些SCFA包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有機(jī)酸，它們?cè)谡{(diào)節(jié)腸道及呼吸道微生物菌群平衡和機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用［37-39］。近年來(lái)提出的“腸-肺”軸理論表明，呼吸道與腸道間存在病理生理的相互作用［40］。有研究表明，COPD患者腸道通透性較健康人群高，而腸道高通透性可引起細(xì)菌或其產(chǎn)物移位從而導(dǎo)致相應(yīng)組織部位的炎癥，腸道菌群代謝產(chǎn)物三聚氰胺-N-氧化物（trimethylamine-N-oxide，TMAO）與COPD患者的遠(yuǎn)期病死率增加有關(guān)；另有研究顯示，腸道益生菌對(duì)常見呼吸系統(tǒng)疾病，如支氣管哮喘、COPD、CF及肺癌等有干預(yù)和治療效應(yīng)［41-43］。且不同人群可因吸煙、飲食、抗生素等多種因素影響著其腸道菌群的組成。

4.1 香煙煙霧的影響

有文獻(xiàn)復(fù)習(xí)了2000—2016年有關(guān)吸煙對(duì)腸道微生物菌群影響的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)吸煙可導(dǎo)致腸道放線菌門、厚壁菌門中雙歧桿菌屬和乳球菌屬減少，變形菌門和擬桿菌門中梭狀芽孢桿菌屬、擬桿菌屬和普氏桿菌屬增加，而戒煙后厚壁菌門和放線菌門數(shù)量增加，擬桿菌門和變形桿菌門數(shù)量減少，微生物多樣性增加［44-45］。動(dòng)物模型研究證實(shí)，暴露于香煙煙霧后，小鼠腸道中SCFA水平顯著降低，雙歧桿菌、乳桿菌、瘤胃球菌（Ruminococcus）和分段絲狀桿菌（Segmental filamentous bacilli，SFB）數(shù)量減少［46-47］。

如前所述，吸煙是COPD發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，吸煙患者下呼吸道菌群發(fā)生紊亂，其核心菌門的變化與患者腸道菌群變化方向一致。表明吸煙引起COPD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增高與香煙煙霧導(dǎo)致腸道菌群紊亂密切相關(guān)。由于目前缺乏吸煙對(duì)COPD呼吸道及腸道菌群的大規(guī)模對(duì)照研究，下呼吸道與腸道菌群改變的先后次序尚難確定。

4.2 飲食的影響

飲食結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)和維持機(jī)體腸道菌群穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。食物的類型塑造了腸道菌群的組成及豐度，影響宿主與微生物的相互作用［48］。富含水果、豆類纖維、碳水化合物的高膳食飲食，可增加腸道菌群多樣性及普氏菌屬的豐度，降低擬桿菌屬的豐度，膳食纖維還可被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生SCFA，對(duì)腸道及全身的免疫起正性調(diào)節(jié)作用［37］；相反，高脂肪、高蛋白質(zhì)、高糖的低纖維膳食可降低腸道菌群的多樣性，減少厚壁菌門，增加變形菌門及擬桿菌門的豐度［49］。

Shaheen等［50］在研究了2 800余人飲食模式與肺功能關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高膳食纖維飲食（水果、蔬菜、全麥谷物）與1 s用力呼氣容積/用力肺活量（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）及1 s用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值之比（FEV1% pred）呈正相關(guān)，對(duì)預(yù)防肺功能受損和COPD發(fā)生發(fā)展，尤其對(duì)男性吸煙者的肺功能保護(hù)有積極意義。Szmidt等［51］研究表明，≥26.5 g/d的高膳食纖維、≥16.3 g/d的富含谷類食物及≥7.6 g/d水果纖維的攝入可使COPD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)減少30%。

顯然，增加膳食纖維，減少脂肪、糖類的攝入可以改善腸道菌群紊亂，增加有益腸道菌群豐度及SCFA的產(chǎn)生，從而有利于調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處器官-呼吸系統(tǒng)的免疫功能，降低COPD的發(fā)生率、減少肺功能受損的機(jī)率。

4.3 益生菌的影響

“益生菌”概念首見于1960年，目前得到廣泛應(yīng)用的包括雙歧桿菌和乳酸桿菌。益生菌可耐受胃酸及膽汁，通過(guò)在腸道上皮細(xì)胞的附著，參與腸道菌群的穩(wěn)定調(diào)控。益生菌起初主要用于治療抗生素性相關(guān)性的腸道菌群紊亂，后來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)它對(duì)克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激惹綜合征等腸道疾病中也能發(fā)揮明顯效應(yīng)［52］。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，益生菌在治療COPD的急性加重過(guò)程中能起到積極作用。文獻(xiàn)報(bào)道在COPD模型上觀察到，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）及雙歧桿菌可顯著降低中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向炎性組織遷移，減輕肺組織的病理?yè)p傷，從而降低炎癥因子的產(chǎn)生及肺組織的結(jié)構(gòu)重塑［53-55］。另有研究發(fā)現(xiàn)，口服乳酸桿菌或雙歧桿菌能誘導(dǎo)肺組織中抗炎因子mRNA的表達(dá)上調(diào)，增加血清中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的總數(shù)和百分率［56-57］。

5 COPD肺部免疫與腸道菌群的關(guān)系

COPD的發(fā)生與Treg/TH17細(xì)胞免疫失衡相關(guān)，白介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等細(xì)胞因子可促進(jìn)Foxp3表達(dá)，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，使之成為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)；另一方面，白介素-6（interleukin-6，IL-6）則可完全抑制TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3+Treg細(xì)胞的生成，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化及IL-17分泌，增加中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的招募，從而促進(jìn)氣道黏液分泌，引起氣道高反應(yīng)［58-60］。腸道作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與腸道自身及遠(yuǎn)處器官免疫功能的調(diào)節(jié)，而腸相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphoid tissue，GALT）在維持肺部免疫調(diào)節(jié)功能方面起著重要作用。GALT分為上皮層和固有層，固有層分泌T細(xì)胞，腸道菌群在CD8+T細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及維持健康狀態(tài)的腸固有層Th17/TregT穩(wěn)態(tài)扮演著重要角色［61-63］。研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露可促進(jìn)與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的趨化因子表達(dá)上調(diào)，而腸道益生菌既能下調(diào)Th17的免疫反應(yīng)能力，又能通過(guò)SCFA的增加來(lái)提高Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能，從而在抑制COPD的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮特有效應(yīng)［39，64-65］。此外，GALT上皮層細(xì)胞含有Toll樣受體（toll like receptor，TLR）及核苷酸結(jié)合寡結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide binding oligo domain protein 2，NOD2）等模式識(shí)別受體（pattern recognition receptoers，PRR），TLR在固有免疫中起著至關(guān)重要的作用。業(yè)已證實(shí)益生菌含有TLR配體，參與固有免疫系統(tǒng)的激活，補(bǔ)充益生菌可增強(qiáng)機(jī)體固有免疫能力，從而對(duì)呼吸道感染發(fā)揮抑制效應(yīng)［61，66-68］。

6 總結(jié)

綜上所述，COPD患者呼吸道及腸道菌群多樣性下降，有益菌群減少，致病性變形菌門增多；香煙煙霧暴露影響了肺部免疫，降低呼吸道、腸道菌群多樣性及有益菌群豐度，抑制SCFA的產(chǎn)生；減少香煙煙霧暴露可減少COPD發(fā)病，改善預(yù)后。高膳食纖維飲食及腸道益生菌制劑（如乳桿菌、雙歧桿菌）有利于促進(jìn)宿主免疫反應(yīng)提高，在抑制呼吸道感染、減輕COPD炎癥方面發(fā)揮積極效應(yīng)。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟和生物信息學(xué)手段的日臻完善，有關(guān)COPD菌群特征的相關(guān)研究將會(huì)越來(lái)越深入。減少COPD患者下呼吸道“關(guān)鍵物種”病原菌、增加膳食纖維及腸道益生菌的攝入有利于改善呼吸系統(tǒng)免疫功能，這已成為一個(gè)新興的臨床研究視角，必將為COPD的治療帶來(lái)新的思路。