何應(yīng)豐，陳建軍，周亮亮，薛 源，鄧義軍

鹽城市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 鹽城224000

膿毒癥是人體對感染的異常反應(yīng)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙［1］。膿毒性休克是膿毒癥的一種嚴(yán)重類型，是指膿毒癥引起嚴(yán)重的循環(huán)、細(xì)胞和/或代謝障礙［1］。近年來，抗感染藥物和生命支持手段取得了很大進(jìn)展，但是膿毒癥尤其是膿毒性休克的病死率仍較高［2］。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、全身免疫失衡、多器官功能障礙和基因多態(tài)性等［3］。早期診斷和干預(yù)是降低膿毒癥病死率最有效的方法，然而目前膿毒癥的診斷、病情和預(yù)后評估以及治療仍然缺乏明確的生物學(xué)標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸序列的非蛋白編碼RNA，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等過程［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）與膿毒癥的免疫炎癥損傷密切相關(guān)［5］，但是MALAT1在膿毒癥診斷、嚴(yán)重程度以及預(yù)后評估中的臨床意義尚未見報道。本研究擬通過檢測膿毒癥患者血漿中MALAT1的表達(dá)，探討其對膿毒癥診斷、嚴(yán)重程度以及預(yù)后的評估價值。

1 對象和方法

1.1 對象

采用前瞻性研究方法，選取2017年1月—2018年1月鹽城市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）收治的60例膿毒癥患者，根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度分為膿毒癥組（37例）和膿毒性休克組（23例）。膿毒癥和膿毒性休克的診斷及治療依據(jù)國際膿毒癥和感染性休克管理指南［1］。排除年齡＜18歲或＞80歲，妊娠及哺乳期婦女，以及合并有腫瘤、血液病和自身免疫性疾病的患者。同時，選擇同期30例年齡和性別匹配的健康體檢者作為健康對照組。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

記錄所有膿毒癥患者入院24 h內(nèi)臨床基本信息，包括年齡、性別、病情嚴(yán)重程度（單純膿毒癥或膿毒性休克）、血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）水平、動脈血乳酸（lactate，Lac）水平、序貫器官衰竭評分（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）、急性生理與慢性健康狀況評估Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ），以及28 d預(yù)后（存活或死亡）。同時記錄健康對照者年齡、性別以及血清PCT水平。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

所有研究對象入院24 h內(nèi)抽取靜脈血5 mL，分離出血漿，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。MALAT1引物序列：正向5′-AGGCTGAAGTTACAGGTC-3′，反向5′-TTGGCTCCCAGTGTCTTA-3′；GAPDH引物序列：正向5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′；反向5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。采 用2-ΔΔCt定 量 法，計(jì) 算MALAT1的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析MALAT1、PCT、Lac、SOFA和APACHEⅡ?qū)δ摱景Y診斷、嚴(yán)重程度以及預(yù)后的預(yù)測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組相關(guān)臨床資料的比較

3組人群之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而MALAT1和PCT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表1），其中血漿MALAT1表達(dá)水平在健康對照組、膿毒癥組和膿毒性休克組呈逐漸升高趨勢（均P＜0.05）。膿毒癥組和膿毒性休克組患者血清PCT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均高于健康對照組（均P＜0.05）。另外，膿毒性休克患者血Lac、SOFA評分和APACHEⅡ評分均顯著高于膿毒癥患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。

2.2 MALAT1對膿毒癥診斷的預(yù)測價值

ROC曲線分析顯示，血漿MALAT1表達(dá)水平和血清PCT水平對膿毒癥均具有良好的診斷價值，且MALAT1的ROC曲線下面積（AUC=0.963）要大于PCT。當(dāng)MALAT1最佳截斷值為1.935時，其診斷膿毒癥的靈敏度為88.33%，特異度為90.00%（圖1，表2）。

表2 MALAT1、PCT對膿毒癥的診斷價值

2.3 MALAT1區(qū)分膿毒性休克和膿毒癥的預(yù)測價值

ROC曲線分析顯示，血漿MALAT1表達(dá)水平、血Lac、SOFA和APACHEⅡ評分對區(qū)分膿毒性休克和膿毒癥均具有較好的預(yù)測價值，但是MALAT1的ROC曲線下面積（AUC=0.784）要小于Lac、SOFA和APACHEⅡ。當(dāng)MALAT1最佳截斷值為3.455時，其區(qū)分膿毒性休克和膿毒癥的靈敏度為78.26%，特 異度為72.97%，預(yù)測能力不如Lac、SOFA和APACHEⅡ（圖2，表3）。

表3 MALAT1、Lac、SOFA和APACHEⅡ區(qū)別膿毒性休克和膿毒癥的預(yù)測價值

圖2 MALAT 1、Lac、SOFA和APACHEⅡ區(qū)別感染性休克和膿毒癥的ROC曲線

2.4 膿毒癥生存和死亡患者相關(guān)臨床資料的比較

所有膿毒癥患者28 d病死率為36.7%（22/60），死亡患者中感染性休克占77.3%（17/22），顯著高于生存患者的15.8%（6/38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者之間年齡、性別以及血清PCT水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而死亡患者血漿MALAT1表達(dá)水平、血Lac、SOFA和APACHEⅡ評分均顯著高于生存患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表4）。

表4 膿毒癥生存與死亡患者之間相關(guān)變量的比較

2.5 MALAT1對膿毒癥患者28 d病死的預(yù)測價值

ROC曲線分析顯示，血漿MALAT1表達(dá)水平、血Lac、SOFA和APACHEⅡ評分對膿毒癥患者28 d病死均具有良好的預(yù)測價值，但MALAT1的ROC曲線下面積（AUC=0.876）小于Lac、SOFA和APACHEⅡ。當(dāng)MALAT1最佳截斷值為4.505時，其預(yù)測膿毒癥患者28 d病死的靈敏度為72.73%，小于Lac、SOFA和APACHEⅡ，但是特異度為97.37%，優(yōu)于Lac、SOFA和APACHEⅡ（圖3，表5）。

表5 MALAT1、Lac、SOFA和APACHEⅡ?qū)δ摱景Y患者預(yù)后的預(yù)測價值

圖3 MALAT 1、Lac、SOFA和APACHEⅡ預(yù)測膿毒癥預(yù)后的ROC曲線

3 討論

MALAT 1位于人類染色體11q13上［6］，由Ji等［7］在2003年首次發(fā)現(xiàn)并報道與肺腺癌早期轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，因而被命名為肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（MALAT1），也是目前研究最多的lncRNA之一［8］。MALAT1廣泛存在于人體幾乎所有的組織、血液和體液中，這為MALAT1作為疾病診斷、治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物提供了可能［9］。然而，目前大多數(shù)研究都集中在MALAT1調(diào)節(jié)各種病理生理過程的潛在分子機(jī)制，只有少數(shù)研究探索了MALAT1作為生物標(biāo)志物的臨床價值［8］。據(jù)我們所知，這是目前第1篇關(guān)于MALAT1作為膿毒癥診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用研究。

膿毒癥的本質(zhì)是感染誘導(dǎo)的機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能損傷。目前研究報道，MALAT1的異常表達(dá)對膿毒癥的免疫炎癥損傷具有重要的調(diào)控作用。例如，MALAT1表達(dá)下調(diào)可以通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來減輕膿毒癥大鼠的心臟炎癥和微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［10-11］。敲除MALAT1基因表達(dá)還可以通過調(diào)節(jié)miR-146a/NF-κB通路來減輕炎癥反應(yīng)，從而抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性腎損傷和急性肺損傷［12-13］。此外，MALAT1被發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而敲低MALAT1基因表達(dá)反而會加重LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷，增加腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的水平［14-16］。這些研究表明，MALAT1在細(xì)菌內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)的不同組織和細(xì)胞中起著促炎和抗炎的雙向調(diào)節(jié)作用，這可能與膿毒性損傷期間機(jī)體免疫炎癥系統(tǒng)的異常失衡相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血漿MALAT1的表達(dá)水平顯著升高，且在膿毒性休克和死亡的膿毒癥患者中MALAT1的表達(dá)水平進(jìn)一步升高。這些研究結(jié)果均提示，MALAT1可能與膿毒癥的診斷、嚴(yán)重程度以及預(yù)后密切相關(guān)。

近年來，有大量研究表明MALAT1可以作為多種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物［17-18］。另外，Shaker等［19］的研究也發(fā)現(xiàn)MALAT1是糖尿病視網(wǎng)膜病變診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。但是血漿MALAT1能否作為膿毒癥的生物標(biāo)志物尚未有研究報道。本研究中，ROC曲線分析顯示血漿MALAT1對膿毒癥的診斷和28 d死亡預(yù)后具有良好的預(yù)測價值，AUC分別達(dá)到0.963和0.876，在最佳截斷點(diǎn)均具有良好的靈敏度和特異度。但在評估膿毒癥嚴(yán)重程度方面，MALAT1不具有良好的預(yù)測價值（AUC=0.784）。本研究結(jié)果表明，血漿MALAT1可能是膿毒癥診斷和預(yù)后的一個良好評估指標(biāo)。

目前臨床上，血清PCT水平是診斷膿毒癥的一個傳統(tǒng)指標(biāo)，而血Lac水平、SOFA和APACHEⅡ評分通常被用來評估膿毒癥的嚴(yán)重程度和預(yù)后［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)MALAT1對膿毒癥診斷的預(yù)測價值要優(yōu)于PCT（AUC 0.963vs.0.898），且MALAT1在最佳截斷點(diǎn)的靈敏度和特異度均大于PCT。Dahaba等［23］研究發(fā)現(xiàn)血清PCT水平與膿毒癥的嚴(yán)重程度也密切相關(guān)，并且在患者入院后第6天顯示出對膿毒癥預(yù)后的良好預(yù)測價值。但是在本研究中，發(fā)現(xiàn)膿毒性休克與單純膿毒癥患者以及生存與死亡患者之間血清PCT水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCT對膿毒癥病情嚴(yán)重程度和28 d預(yù)后的預(yù)測價值較差，這可能是由于本研究納入樣本量較少，且血清PCT檢測時間較早，為入院24 h之內(nèi)。另外，本研究中ROC曲線分析顯示血Lac水平、SOFA和APACHEⅡ評分對膿毒癥的病情嚴(yán)重程度和28 d死亡預(yù)后均具有良好的預(yù)測價值，且均優(yōu)于MALAT 1。但是MALAT1在最佳截斷點(diǎn)預(yù)測膿毒癥患者28 d死亡預(yù)后的特異度（97.37%）要優(yōu)于血Lac水平、SOFA和APACHEⅡ評分。上述研究結(jié)果表明，與膿毒癥診斷和預(yù)后評估的傳統(tǒng)指標(biāo)相比，血漿MALAT1兼具良好的診斷和預(yù)后評估價值。

本研究的不足和展望：①本研究納入的研究對象均來自于鹽城市第一人民醫(yī)院，且樣本量較小，可能對研究結(jié)果造成一定程度的選擇偏倚；②本研究只檢測了膿毒癥患者入院24 h以內(nèi)血漿MALAT1的表達(dá)水平，未進(jìn)行不同時間點(diǎn)的動態(tài)監(jiān)測，可能對研究結(jié)果造成一定程度的信息偏倚；③與膿毒癥傳統(tǒng)評估指標(biāo)相比，檢測血漿MALAT1的表達(dá)需要特殊的試劑、耗材，檢測時間較長，花費(fèi)較高，其時效性和簡便性不如膿毒癥的傳統(tǒng)評估指標(biāo)。但是，血漿MALAT1作為基因靶點(diǎn)，為膿毒癥的機(jī)制研究和生物治療開辟了新的思路，未來還需要多中心、大樣本的研究來進(jìn)一步評估血漿MALAT1作為膿毒癥生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用價值。