李 靜 楊毅玲 張承才

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120(Anabaenasp. PCC 7120)屬于念珠藻目念珠藻科念珠藻屬, 是由多個細(xì)胞組成的固氮絲狀藍(lán)細(xì)菌, 在營養(yǎng)充分的環(huán)境中, 魚腥藍(lán)細(xì)菌菌絲由營養(yǎng)細(xì)胞組成, 24h完成一次細(xì)胞增殖, 同時能夠利用環(huán)境中的化合態(tài)氮源, 如硝酸鹽和銨鹽等, 合成自身所需氨基酸從而保證存活[1,2]。當(dāng)環(huán)境中化合態(tài)氮源缺乏時, 菌絲上5%—10%的營養(yǎng)細(xì)胞在24h內(nèi)就會分化出一個具有固氮功能的異形胞, 相當(dāng)于每10—20個營養(yǎng)細(xì)胞之間會形成一個異形胞, 用來固定空氣中的氮?dú)庥糜诒Ｕ暇z的存活[3,4]。這種半規(guī)則的排列, 形成2種類型細(xì)胞組成的絲狀體[5], 其中營養(yǎng)細(xì)胞能夠固定CO2進(jìn)行光合作用, 異形胞可以進(jìn)行固氮作用, 這2種不同類型的細(xì)胞通過相互的營養(yǎng)物質(zhì)交換, 可以形成一個簡單多細(xì)胞的生存模式[6]。異形胞的分化是已知的最為古老的細(xì)胞分化形式之一。有文獻(xiàn)報道在oriC及dnaA-oriC-dnaN附近插入Ω片段會改變調(diào)控異形胞發(fā)育的關(guān)鍵基因HetN和HetR的轉(zhuǎn)錄及翻譯, 最終影響異形胞的分化[7]。oriC是DNA復(fù)制起始蛋白DnaA的結(jié)合位點(diǎn)。前期研究[8]表明, 在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中, 作為細(xì)胞周期中DNA復(fù)制起始蛋白DnaA參與細(xì)胞分化與細(xì)胞分裂的調(diào)控。DnaA起始復(fù)制是通過其結(jié)合oriC附近的DnaA box, 解鏈AT富集區(qū)開始的。OriC和DnaA box的序列相對保守, 在基因組上的位置也有一定的規(guī)律性。有些細(xì)菌的oriC或DnaA box在基因組位置分布上和DNA復(fù)制相關(guān)的dnaA基因的距離較近[9]。通過分析魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120基因組上DnaA box和dnaA基因的分布情況, 揭示了在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中, 染色體上的DnaA box并不是隨機(jī)分布, DnaA box和dnaA處在同一區(qū)域[10]。而且, 魚腥藍(lán)細(xì)菌的多個DnaA box也都在oriC區(qū)域上[10]。根據(jù)報道, 藍(lán)細(xì)菌oriC均與dnaN緊鄰并分布于非編碼區(qū), 附近分布有DnaA box, 拷貝數(shù)從2個到12個不等。魚腥藍(lán)細(xì)菌oriC附近有6個成串分布的DnaA box[7,11]。C端與dnaN緊鄰, N端與dnaA基因相鄰, 魚腥藍(lán)細(xì)菌是少數(shù)幾種oriC與dnaA基因相鄰的藍(lán)細(xì)菌。

另有對魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的研究發(fā)現(xiàn),dnaA缺失突變體的細(xì)胞生長和DNA復(fù)制與野生型相比沒有明顯差別[12], 魚腥藍(lán)細(xì)菌與真核生物染色體復(fù)制類似, 均含有多個復(fù)制起點(diǎn)且不同步起始復(fù)制[13—15]。dnaA對于魚腥藍(lán)細(xì)菌 DNA的復(fù)制及細(xì)胞生長來說都不是必需的[12]。dnaA的缺失不影響魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的DNA復(fù)制和細(xì)胞生長, 這說明一些非共生藍(lán)細(xì)菌譜系在多樣化進(jìn)程中喪失了對DnaA的功能依賴[12]。

由上述可知, 盡管dnaA對魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的DNA復(fù)制和細(xì)胞生長來說并不重要, 但其對異形胞分化有重要作用, 迄今為止, 其作用機(jī)理尚不明確, 本研究針對該問題, 擬以魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120為對象展開研究, 旨在進(jìn)一步探究細(xì)胞周期和異形胞分化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

大腸桿菌DH5α、HB101(pRL623)和J53(RP4)均由本實(shí)驗室保存; 魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120由本實(shí)驗室保存; 質(zhì)粒pCT、pCint2和pSfgfp-Sp均由本實(shí)驗室構(gòu)建或保存; 質(zhì)粒pRL271ΩoriC和pRL271ΩdnaAN均從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室藍(lán)細(xì)菌室獲得。

1.2 實(shí)驗引物

本研究所用引物(表 1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成, DNA序列測序由鉑尚生物技術(shù)有限公司及武漢擎科生物有限公司完成。魚腥藍(lán)細(xì)菌基因序列信息來自cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase)。

表1 實(shí)驗中所用主要引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗主要涉及大腸桿菌和魚腥藍(lán)細(xì)菌的培養(yǎng)。

大腸桿菌于LB液體培養(yǎng)基37℃, 180 r/min或固體(1.5%)培養(yǎng)基37℃下培養(yǎng)。LB液體培養(yǎng)基配方(1 L): 蛋白胨10 g, 酵母粉5 g, 氯化鈉10 g。若為固體培養(yǎng)基, 則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂條或瓊脂粉; 121℃, 101.53 kPa滅菌30min[11]。大腸桿菌在培養(yǎng)時涉及的抗生素使用濃度為: Ampicillin(氨芐青霉素), 100 μg/mL; Kanamycin(卡那霉素), 50 μg/mL; Chloramphenicol(氯霉素), 25 μg/mL; Spectinomycin(壯觀霉素), 100 μg/mL。

魚腥藍(lán)細(xì)菌通常于硝酸鹽培養(yǎng)基BG11或缺氮培養(yǎng)基BG110中培養(yǎng), BG110用于異形胞的誘導(dǎo)。液體培養(yǎng)條件為30℃, 120 r/min, 500—3000 lx連續(xù)光照培養(yǎng); 固體(1.2%)培養(yǎng)條件為30℃, 500—3000 lx連續(xù)光照培養(yǎng)。BG11培養(yǎng)基配方(1L): NaNO31.5 g,K2HPO40.04 g, MgSO4·7H2O 0.075 g, CaCl2·2H2O 0.036 g, Citric acid 0.006 g, Ferric ammonium citrate 0.006 g, EDTANa20.001 g, Na2CO30.02 g, A5(Tracemental solution)1 mL。其中A5(Trace mental solution)配方(1L): H3BO32.86 g, MnCl2·4H2O 1.86 g,ZnSO4·7H2O 0.22 g, Na2MoO4·2H2O 0.39 g, CuSO4·5H2O 0.08 g, Co(NO3)2·6H2O 0.05 g。BG110培養(yǎng)基與BG11培養(yǎng)基配方相仿, 只是在BG110培養(yǎng)基中不添加NaNO3。若為固體培養(yǎng)基, 則需添加1.2%的瓊脂粉[11], 121℃、101.53 kPa滅菌30min。魚腥藍(lán)細(xì)菌在培養(yǎng)時涉及的抗生素使用濃度為: Neomycin(新霉素), 100 μg/mL; Spectinomycin(壯觀霉素),5 μg/mL; Streptomycin(鏈霉素), 2.5 μg/mL。

1.4 實(shí)驗所用主要分子生物學(xué)試劑

本研究中使用的限制性核酸內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司, 金牌MIX高保真DNA聚合酶購自武漢擎科, Phanta高保真DNA聚合酶購自諾唯贊生物科技有限公司, 質(zhì)粒抽提試劑盒、基因組抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收及膠回收試劑盒和RNALater購自武漢川流生物科技有限公司。

1.5 PCR擴(kuò)增條件及主要質(zhì)粒構(gòu)建

pCT-alr2009質(zhì)粒用于過表達(dá)DnaA(由alr2009編碼)。使用引物P3和P4通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增載體pCT, 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 59℃退火30s, 72℃延伸4min, 29個循環(huán);72℃5min。使用引物P1和P2通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到alr2009片段, 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s,29個循環(huán); 72℃5min。通過同源重組插入到上一步得到的載體, 得到質(zhì)粒pCT-alr2009。該質(zhì)粒負(fù)責(zé)alr2009基因的表達(dá), CT啟動子指Theophylline riboswitch E(TP, 茶堿)和PpetE(Cu2+)組成的啟動子,petE啟動子啟動的強(qiáng)弱受銅離子(Cu2+)控制, Cu2+是啟動轉(zhuǎn)錄所必需的, riboswich E調(diào)控起始DnaA蛋白的翻譯, riboswich E受茶堿(Tp, Theophylline)的調(diào)控, 二者共同誘導(dǎo)基因的表達(dá)。本實(shí)驗所用Cu2+終濃度為0.25 μmol/L, Tp終濃度為1 mmol/L用于DnaA的過表達(dá)。

pCint2M-alr2009質(zhì)粒用于構(gòu)建dnaA(alr2009)缺失突變體。使用引物P5和P6通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Anabaena基因組DNA獲得alr2009基因上游的1255 bp片段(alr2009UP), 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s,29個循環(huán); 72℃5min。使用引物P7和P8通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Anabaena基因組DNA獲得由alr2009基因第1378位起始的1251 bp片段(alr2009 DW), 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s,55℃退火30s, 72℃延伸45s, 29個循環(huán); 72℃5min。使用引物P9和P10通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增載體pSfgfp-Sp得到Spectinomycin抗性基因片段, 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 58℃退火30s,72℃延伸1min, 29個循環(huán); 72℃5min。將上述3個基因片段通過同源重組連接并插入到pCint2載體的PstⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)之間, 得到質(zhì)粒pCint2M-alr2009。該質(zhì)粒中Sp-r兩邊序列與野生型基因組中dnaA(alr2009)基因上游1255 bp片段(alr2009UP)及下游由該基因1378位起始的1251 bp片段(alr2009DW)同源,因此可與野生型基因組發(fā)生同源重組, 從而將壯觀霉素基因插入到野生型基因組中, 利用Spectinomycin(壯觀霉素)和Streptomycin(鏈霉素)抗性及5%蔗糖進(jìn)行篩選獲得DnaA缺失突變體。

1.6 魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120接合轉(zhuǎn)移(三親本雜交)

根據(jù)實(shí)驗需要, 分別取等體積的處于對數(shù)生長期的大腸桿菌HB101/pRL623(pRL623是指HB101自身攜帶的質(zhì)粒)、接合菌J53/RP4和魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120這3個親本菌株, 6000 r/min, 離心3min收集菌體, 并用相應(yīng)的無抗培養(yǎng)基洗滌2次。然后用0.2 mL無抗LB培養(yǎng)基重懸2種大腸桿菌, 用0.2 mL無抗的BG11培養(yǎng)基重懸魚腥藍(lán)細(xì)菌[11]; 將3個親本的菌液混合搖勻, 轉(zhuǎn)移至無菌的透明度較高的離心管中, 在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4h以上; 將靜置后的菌液均勻涂布于無抗的BG11固體培養(yǎng)基平板表面, 然后把平板置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]。

抗生素篩選: 培養(yǎng)18—24h后, 于固體培養(yǎng)基底部加入相應(yīng)的合適濃度的篩選抗生素稀釋液, 之后置于光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng); 24h后, 翻轉(zhuǎn)平板, 使有培養(yǎng)基的皿底朝上, 繼續(xù)培養(yǎng); 10—15d左右, 觀察平板, 成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的魚腥藍(lán)細(xì)菌將會長出相應(yīng)的單菌落, 然后挑取單菌落并轉(zhuǎn)接到含相應(yīng)抗生素的新鮮固體培養(yǎng)基平板或液體培養(yǎng)基三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng); 驗證: 抽提菌株的總DNA, PCR驗證菌株;驗證無誤的菌株繼續(xù)培養(yǎng), 以進(jìn)行下一步的實(shí)驗[11]。

蔗糖篩選: 將獲得的單菌落轉(zhuǎn)移到含對應(yīng)抗生素BG11培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(標(biāo)記好克隆子編號)。再轉(zhuǎn)移至含相應(yīng)抗生素2 mL液體培養(yǎng)基; 收集菌體于2 mL離心管中(1 mL菌液), 用超聲波處理,將菌絲打斷成＜10個細(xì)胞(顯微鏡觀察), 離心去除上清, 添加200—400 μL新鮮培養(yǎng)基, 再轉(zhuǎn)移到1—2個含5%蔗糖及對應(yīng)的抗生素BG11平板, 進(jìn)行雙交換突變體的篩選; 1—2周后分別挑取5—6個單菌落于新鮮相應(yīng)抗生素的平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 再轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng), 同時對之進(jìn)行驗證。

1.7 魚腥藍(lán)細(xì)菌異形胞的缺氮誘導(dǎo)

將魚腥藍(lán)細(xì)菌于BG11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A750=0.4—0.5), 6000 r/min離心2min收集菌體; 加入BG110液體培養(yǎng)基重懸菌體, 6000 r/min離心2min, 收集菌體; 重復(fù)上述步驟1次; 6000 r/min離心2min, 用移液器盡量除去上清培養(yǎng)基; 加入適量BG110培養(yǎng)基重懸菌體; 將菌體轉(zhuǎn)移至適宜大小的三角瓶中, 添加適量BG110培養(yǎng)基后置于光照搖床中培養(yǎng); 24h以后鏡檢是否有異形胞的分化[11]。實(shí)驗過程中應(yīng)做好三組平行試驗。

1.8 顯微鏡觀察

藍(lán)細(xì)菌和0.5%的Alcian blue染色混合, 放置1min左右進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色, 利用Olympus BX41顯微鏡對魚腥藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察, 主要步驟為取0.2—0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中, 靜置, 待其自然沉降; 吸取離心管底部3—5 μL細(xì)胞液, 滴于載玻片中央; 將蓋玻片置于載玻片上方, 輕壓, 趕出氣泡; 將制作好的切片置于顯微鏡載物臺中央; 低倍鏡尋找合適視野, 根據(jù)實(shí)驗需要轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的高倍鏡, 每轉(zhuǎn)換一次需重新對焦一次; 根據(jù)實(shí)驗需要切換視野或濾鏡通道, 觀察并記錄圖像[11]。

2 結(jié)果

2.1 dnaA缺失突變體、過表達(dá)株的構(gòu)建及含DnaA box基因序列在基因組中的插入

起始蛋白DnaA在細(xì)胞周期中起復(fù)制起始作用,DnaA濃度的改變與細(xì)胞周期的變動緊密相連。為了探究DnaA濃度對魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的細(xì)胞生長及異形胞發(fā)育的影響, 構(gòu)建了dnaA基因(alr2009)缺失突變體以及DnaA過表達(dá)株。同時作為對照,通過改變DnaA box位點(diǎn)數(shù)量, 也可相應(yīng)地改變游離DnaA的量。通過在魚腥藍(lán)細(xì)菌染色體中插入含有DnaA box的oriC片段及dnaA-oriC-dnaN片段來實(shí)現(xiàn)對DnaA濃度的改變。

通過三親本雜交的方式將構(gòu)建好的pCT-alr2009(圖 1A)轉(zhuǎn)入野生型魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中,獲得DnaA過表達(dá)株Oalr2009。同時也構(gòu)建了pCint 2M-alr2009質(zhì)粒(圖 1B), 通過三親本雜交的方式將構(gòu)建好的整合型載體pCint2M-alr2009轉(zhuǎn)入野生型魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中, 通過篩選獲得DnaA缺失突變體Malr2009。

圖1 pCT-alr2009(A)和pCint2M-alr2009(B)載體示意圖Fig. 1 The vector map of pCT-alr2009 (A) and pCint2M-alr2009(B)

利用引物1-up和1-dw及1-up和2-dw分別對抗性篩選得到的Oalr2009進(jìn)行PCR驗證(圖 2A)。WT菌株作為對照無法擴(kuò)增出目的片段, 過表達(dá)菌株中利用引物1-up和1-dw可擴(kuò)增獲得目的片段1787 bp, 同時換用引物1-up和2-dw進(jìn)行PCR擴(kuò)增,也可獲得目的片段, 大小應(yīng)為2117 bp。結(jié)果表明,篩選得到的3株Oalr2009菌株均為超表達(dá)菌株。

之后利用引物3-up和3-dw及4-up和4-dw分別對篩選得到的Malr2009克隆進(jìn)行PCR驗證(圖 2B)。當(dāng)使用3-up和3-dw引物時, WT菌株因不含Sp-r片段所以無法擴(kuò)增出片段, 缺失突變菌株中由于alr2009基因片段被Sp-r片段置換, 因此PCR擴(kuò)增后片段大小為1800 bp。當(dāng)使用4-up和4-dw引物時(圖 2C),WT菌株因為含有alr2009基因片段, 因此PCR擴(kuò)增后的片段大小為861 bp, 缺失突變菌株中由于alr2009基因片段被Sp-r片段置換, 因此PCR擴(kuò)增后無產(chǎn)物。檢測結(jié)果顯示, 篩選得到的3個Malr2009菌株均可擴(kuò)增得到預(yù)期的1800 bp的DNA片段, 而且沒有擴(kuò)增出野生型DNA片段, 所以這3個菌株為完全分離的Malr2009雙交換突變菌株。

圖2 Oalr2009和Malr2009菌株的PCR驗證Fig. 2 The PCR verification of Oalr2009 and Malr2009

作為對照, 在將含有DnaA box的oriC片段或dnaA-oriC-dnaN片段插入到基因組的實(shí)驗中, 將pRL271ΩoriC和pRL271ΩdnaAN載體通過三親本雜交的方法, 轉(zhuǎn)入野生型魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中, 利用壯觀霉素可以篩選到單菌落。將pRL271ΩoriC轉(zhuǎn)入魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120后得到的突變體MoriC,將pRL271ΩdnaAN轉(zhuǎn)入魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120后得到突變體MdnaAN, 用于后續(xù)的實(shí)驗作為對照。

2.2 MoriC、MdnaAN、Oalr2009和Malr2009株的異形胞分化

為了探究DnaA是否參與異形胞的發(fā)育調(diào)控,對野生型、MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009共5株菌株在氮源缺乏條件時的異形胞發(fā)育進(jìn)行了觀察, 并對異形胞頻率進(jìn)行了統(tǒng)計。圖 3結(jié)果顯示,缺氮培養(yǎng)24h后, 野生型可形成成熟異形胞, 異形胞頻率為8.64%。MoriC和MdnaAN也可形成成熟異形胞, 每條菌絲中都可觀察到大量異形胞, 異形胞頻率分別為11.76%和11.73%, MoriC和MdnaAN的異形胞頻率明顯高于野生型(表 2)。結(jié)果表明,oriC和dnaA-oriC-dnaN數(shù)量均可影響魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的異形胞形成模式。

同時, Malr2009和Oalr2009在缺氮培養(yǎng)24h后也形成成熟的異形胞(圖 3), Oalr2009菌絲中只能觀察到少量異形胞, 其異形胞頻率為6.97%, 低于野生型(表 2)。Malr2009的異形胞頻率為8.57%, 與野生型幾乎沒有差別(表 2)。綜上說明, 過表達(dá)增加DnaA蛋白會影響魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的異形胞形成模式, 但是完全敲除dnaA基因不會影響魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的異形胞形成模式。

圖3 五種菌株的缺氮表型觀察Fig. 3 Phenotypes of the five strains under nitrogen starvation

為了進(jìn)一步確定DnaA對異形胞分化頻率的影響, 分別對野生型WT、MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009這5株菌株的相鄰異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計, 以此反映異形胞在菌絲中的分化模式。圖 4顯示, 在氮源缺乏24h后, 野生型中異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞數(shù)眾數(shù)為10, MoriC和MdnaAN中異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞眾數(shù)為7, 明顯低于野生型, 這與MoriC和MdnaAN異形胞頻率明顯高于野生型的結(jié)果一致(表 2)。Malr2009的異形胞分化頻率與野生型相比無明顯差別, 這在異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞間隔數(shù)統(tǒng)計中也可反映出來, Malr2009異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞間隔眾數(shù)為9, 與野生型非常接近(圖 4)。在Oalr2009菌株中, 其異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞間隔數(shù)眾數(shù)為12, 明顯高于野生型(圖 4), 這與Oalr2009的異形胞頻率低于野生型異形胞頻率的結(jié)果符合(表 2)。

圖4 五種菌株異形胞間營養(yǎng)細(xì)胞間隔數(shù)頻數(shù)的統(tǒng)計Fig. 4 Frequency of the number of the vegetative cells between heterocysts in the five strains

表2 缺氮24h后異形胞頻率Tab. 2 Heterocysts frequency after 24h of nitrogen starvation

2.3 菌株的生長狀況檢測

為了探究DnaA對魚腥藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞生長的影響,在氮源充足和氮源缺乏的條件下, 對野生型WT、MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009這5株菌株的生長狀況進(jìn)行了檢測(圖 5)。圖 5A結(jié)果顯示, 在氮源充足的情況下, MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009的細(xì)胞生長狀況均與WT相似。然而,在氮源缺乏時(圖 5B), MoriC和MdnaAN的細(xì)胞生長速度慢于野生型, 它們在第12天時,A750均不到0.6。Oalr2009的細(xì)胞生長略快于野生型, 其在第12天時A750約為1.2。Malr2009的細(xì)胞生長速率與野生型無明顯差異, 第12天時的A750均約為0.9。

圖5 五種菌株分別在供氮(A)和缺氮(B)條件下的生長狀況Fig. 5 Growth curves of the five strains under nitrogen replete(A) and nitrogen starvation (B) conditions

3 討論

細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。在該過程中遺傳信息DNA精確地復(fù)制, 并分配到子代細(xì)胞中[16—18]。在大腸桿菌中, DNA復(fù)制的起始由起始蛋白DnaA對oriC的識別開始,oriC中含多個DnaA box, 可與DnaA結(jié)合, 在其他輔助因子的幫助下啟動復(fù)制[19—24]。但是本研究的結(jié)果(圖 3和表 2)表明DnaA缺失突變株Malr2009的細(xì)胞增殖率沒有改變。這個結(jié)論與文獻(xiàn)報道在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中DnaA并不是細(xì)胞增殖必需的蛋白[12]一致。DnaA對不同藍(lán)細(xì)菌的影響各有不同, 在細(xì)長聚球藻S. elongatus中, DnaA會影響復(fù)制起始, 其dnaA缺失突變體會降低DNA復(fù)制頻率, 但并不影響細(xì)胞生長, 且其在靜止期更有生存優(yōu)勢[12,25]; 相反, 在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與葉綠體親緣關(guān)系更為接近的集胞藻Synechocystis和魚腥藍(lán)細(xì)菌Anabaena中, DNA復(fù)制不依賴于DnaA[12,26], 這2種藍(lán)細(xì)菌的dnaA缺失突變體的細(xì)胞生長和DNA復(fù)制與野生型相比均沒有明顯差別。由此可以看出, DnaA對復(fù)制過程的影響與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可能相對應(yīng)。有文獻(xiàn)報道魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中細(xì)胞周期的抑制, 會抑制異形胞的發(fā)育[27]。結(jié)合實(shí)驗結(jié)果DnaA的增加會降低異形胞頻率, 我們推測在進(jìn)化上DnaA的功能可能由調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)化到調(diào)控異形胞頻率。在魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中, 雖然DnaA在細(xì)胞周期并不是必需的,但是DnaA:oriC的平衡對異形胞的發(fā)育極其重要[7]。本研究的結(jié)果(圖 3和表 2)證明DnaA缺失并不會改變異形胞頻率, 但是過表達(dá)DnaA會降低異形胞的頻率。同時在本研究中通過增加DnaA結(jié)合位點(diǎn)oriC來降低細(xì)胞中游離的DnaA, 結(jié)果同樣證明了DnaA的增加會降低異形胞頻率。有研究[7]證明在MoriC和MdnaAN突變中異形胞發(fā)育的正調(diào)控因子hetR增加導(dǎo)致了異形胞頻率增加。因此我們推測通過過表達(dá)DnaA減少可用的oriC從而降低異形胞發(fā)育的正調(diào)控因子hetR, 最終導(dǎo)致在DnaA過表達(dá)的突變株Oalr2009異形胞頻率降低。

綜上, 本研究以DNA復(fù)制中的關(guān)鍵蛋白DnaA為切入點(diǎn), 探究了魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120 DnaA與異形胞分化之間的關(guān)系, 研究表明, DnaA并不是魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120細(xì)胞生長過程所必需的, 完全敲除dnaA基因?qū)?xì)胞生長無影響, 但在缺氮條件下, 增加游離DnaA的數(shù)量會降低異形胞的分化頻率。此研究進(jìn)一步細(xì)化并完善了異形胞分化的分子機(jī)制,為DnaA和異形胞分化過程相互關(guān)系的研究提供了一定的理論基礎(chǔ), 為藍(lán)細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化提供了更多的信息。