龍 勇 葛國(guó)棟 李西西 崔宗斌,

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 廣東省科學(xué)院微生物研究所, 廣州 510070)

魚(yú)類(lèi)的抗寒能力往往受遺傳、發(fā)育階段和熱經(jīng)歷(Thermal history)等因素的綜合影響[1,2]。研究發(fā)現(xiàn), 重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)如羅非魚(yú)(Oreochromissp.)、大黃魚(yú)(Nibea albiflora)[3]、斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)[4]和金頭鯛(Larimichthys crocea)[5]等均具有不耐寒的特點(diǎn), 當(dāng)寒潮來(lái)臨時(shí)經(jīng)常被大量?jī)鏊?或因免疫力降低而導(dǎo)致大面積病害發(fā)生, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。魚(yú)類(lèi)在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成了應(yīng)對(duì)低溫脅迫的生理、生化和遺傳機(jī)制, 因此,可以通過(guò)解析對(duì)低溫應(yīng)激反應(yīng)和抗寒起關(guān)鍵作用的遺傳因子, 來(lái)研發(fā)增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)抗寒能力的技術(shù)方法。本文主要綜述了近年來(lái)魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)與調(diào)控, 及抗寒性狀遺傳決定基礎(chǔ)方面的研究進(jìn)展,為魚(yú)類(lèi)生理和遺傳育種研究提供參考。

1 低溫脅迫造成分子、細(xì)胞和組織損傷

魚(yú)類(lèi)遭遇急性低溫脅迫會(huì)產(chǎn)生分子、細(xì)胞和組織等多個(gè)水平的損傷作用[6]。溫度對(duì)核酸和蛋白質(zhì)等細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)和功能具有決定性影響[7]。在生理溫度條件下, 細(xì)胞表達(dá)與其環(huán)境溫度相應(yīng)的酶和結(jié)構(gòu)蛋白, 形成有利于實(shí)現(xiàn)各項(xiàng)生物學(xué)功能的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)魚(yú)體遭遇低溫脅迫時(shí), 核酸和蛋白質(zhì)等生物分子不能正確折疊和組裝, 導(dǎo)致其活性降低[8]。低溫脅迫還能誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生, 對(duì)DNA和蛋白質(zhì)造成氧化性損傷[6,9,10]。

在細(xì)胞水平, 低溫刺激可降低生物膜(包括細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜)的流動(dòng)性, 改變膜的結(jié)構(gòu), 影響膜及膜結(jié)合蛋白的功能[11,12]。在低溫條件下, 產(chǎn)生能量的速率降低, 導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足[13]。低溫影響微管蛋白的多聚化, 降低其穩(wěn)定性, 從而破壞細(xì)胞骨架, 改變細(xì)胞形態(tài)[14]。另外, 低溫能誘導(dǎo)線(xiàn)粒體的超極化并使溶酶體膜的通透性升高[14]。低溫暴露還能引起脂肪的過(guò)氧化, 激活鐵死亡(Ferroptosis)等細(xì)胞死亡通路[9,15]。

在組織水平, 低溫暴露可降低心臟的收縮功能,導(dǎo)致組織缺血, 進(jìn)而減少組織和細(xì)胞的氧氣供應(yīng),造成組織缺氧[6]。例如將鯉(Cyprinus carpio)從25℃直接轉(zhuǎn)移到15℃, 暴露90s后其腦部供血量即急劇降低[16], 從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能。在低溫脅迫條件下, 魚(yú)類(lèi)鰓的呼吸和滲透壓調(diào)節(jié)功能受抑制[17], 離子平衡被擾亂[1]。低溫脅迫還降低魚(yú)體的免疫力[18,19]、組織的代謝率[20]及游泳和逃避捕食者的能力, 使其被捕食的風(fēng)險(xiǎn)增加[21]。無(wú)論在自然還是在養(yǎng)殖條件下, 冬季都會(huì)出現(xiàn)魚(yú)類(lèi)大量死亡的事件, 其主要原因包括低溫應(yīng)激、饑餓和疾病等[22],這些都與低溫對(duì)魚(yú)體造成的不利影響有關(guān)。

2 魚(yú)類(lèi)的低溫應(yīng)激反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制

2.1 低溫信號(hào)的感知和傳遞

魚(yú)體通過(guò)對(duì)低溫刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 建立新的生理、生化和代謝穩(wěn)態(tài)來(lái)增強(qiáng)抗寒能力, 這一過(guò)程稱(chēng)為“低溫適應(yīng)(Cold acclimation)”。機(jī)體和細(xì)胞必須感受到低溫刺激, 并將刺激信號(hào)傳遞至細(xì)胞核才能啟動(dòng)低溫應(yīng)激反應(yīng)。在低溫信號(hào)的感知方面, 細(xì)菌細(xì)胞利用mRNA分子中特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)作為溫度感受器, 控制轉(zhuǎn)錄本在不同溫度條件下的翻譯效率[23]。真核細(xì)胞對(duì)低溫信號(hào)的傳遞主要依賴(lài)鈣離子信號(hào)系統(tǒng), 低溫脅迫激發(fā)細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流,進(jìn)而激活相關(guān)的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子[24,25]。離體培養(yǎng)的昆蟲(chóng)組織利用鈣離子信號(hào)感知低溫刺激和激活下游的“快速低溫強(qiáng)化(Rapid cold hardening,RCH)”機(jī)制, 使用特異性抑制劑抑制鈣離子的內(nèi)流、鈣調(diào)蛋白的激活和鈣調(diào)蛋白依賴(lài)激酶Ⅱ(CaMKII)的活性都能消除RCH的抗寒效應(yīng)[24]。脊椎動(dòng)物下丘腦的視前區(qū)是控制溫度感知和體溫調(diào)節(jié)的區(qū)域,其接收來(lái)自外周溫度感受器的信號(hào), 調(diào)控各種生理和行為的熱調(diào)節(jié)反應(yīng)(圖 1)[26]。瞬時(shí)受體電位離子通道TRPM8是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的低溫感受器, 其在感覺(jué)神經(jīng)元中特異性表達(dá), 低溫刺激時(shí)能迅速開(kāi)放, 介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)流[25]。Trpm8敲除的小鼠仍然能感受低溫刺激, 說(shuō)明動(dòng)物細(xì)胞中還存在其他的低溫感受器[27]。有研究發(fā)現(xiàn), 在小鼠(Mus musculus)下丘腦中表達(dá)的環(huán)核苷酸門(mén)控離子通道CNGA3也是一個(gè)低溫感受器[28]。

魚(yú)類(lèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)也參與對(duì)低溫刺激的感知和低溫信號(hào)的傳遞。鯉下丘腦的視前區(qū)在受到降溫刺激后30s被激活, 其周?chē)膬?nèi)分泌神經(jīng)元被激活后可以釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH),誘導(dǎo)下游的生理反應(yīng)[16]。通過(guò)遺傳篩選發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)的GLR-3基因具有低溫感受器的功能, 該基因編碼一個(gè)谷氨酸受體, 其在斑馬魚(yú)(Danio rerio)中的同源基因gluk2也具有傳遞低溫信號(hào)的功能[29]。離體培養(yǎng)的組織和細(xì)胞也能感受低溫刺激、傳遞低溫信號(hào)和啟動(dòng)低溫應(yīng)激反應(yīng)[24,30],說(shuō)明還存在不依賴(lài)神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞自主的低溫感受器。魚(yú)類(lèi)的低溫感受器還需進(jìn)一步鑒定, 鈣離子信號(hào)系統(tǒng)在魚(yú)類(lèi)低溫信號(hào)傳遞中的作用尚待深入研究。

2.2 內(nèi)分泌系統(tǒng)在調(diào)控低溫應(yīng)激反應(yīng)中的作用

在受到外界刺激時(shí), 魚(yú)類(lèi)的下丘腦-垂體-腎間腺(Hypothalamus-pituitary-interrenal, HPI)軸被激活。首先, 由下丘腦釋放CRH激活垂體的促皮質(zhì)細(xì)胞, 使其釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH); ACTH誘導(dǎo)腎間細(xì)胞釋放皮質(zhì)類(lèi)固醇激素(CS), 即初級(jí)反應(yīng);皮質(zhì)類(lèi)固醇激素進(jìn)入血液系統(tǒng)后調(diào)控代謝、血液、滲透壓和免疫反應(yīng)(次級(jí)反應(yīng)), 進(jìn)而引起個(gè)體生理和行為的改變(三級(jí)反應(yīng), 圖 1)[1,16,31,32]。

圖1 內(nèi)分泌系統(tǒng)在調(diào)控魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)中的作用Fig. 1 Functions of endocrinology system in regulating cold stress responses of fish

皮質(zhì)醇是硬骨魚(yú)類(lèi)主要的皮質(zhì)類(lèi)固醇激素。低溫暴露能迅速誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)血漿中皮質(zhì)醇含量上升[9,32]。例如, 將水溫在30min內(nèi)從25℃降低到12℃顯著升高了奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromis aureus)血漿中皮質(zhì)醇的含量[33]。血漿中皮質(zhì)醇的含量與降溫的幅度成正相關(guān)[34], 因此常被用作魚(yú)體受刺激程度的指標(biāo)[31]。皮質(zhì)醇進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合。GR與激素結(jié)合后被激活, 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能, 調(diào)控糖皮質(zhì)激素反應(yīng)基因的表達(dá)[32]。皮質(zhì)醇在調(diào)控魚(yú)類(lèi)的中間代謝、滲透壓和免疫中具有重要的作用[32]。低溫刺激后奧利亞羅非魚(yú)血漿皮質(zhì)醇水平的升高與吞噬細(xì)胞的活性被抑制有關(guān)[33]。皮質(zhì)醇在魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)中的主要作用可能是調(diào)控能量的再分配, 促進(jìn)糖異生以增加細(xì)胞能量供應(yīng); 同時(shí)抑制生長(zhǎng)和免疫等耗能的生物學(xué)過(guò)程,從而增強(qiáng)細(xì)胞抵抗環(huán)境脅迫的能力[35]。目前, 皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素在調(diào)控魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)和抗寒能力形成中的作用和機(jī)制還不清楚。

甲狀腺素也參與調(diào)控魚(yú)類(lèi)的低溫適應(yīng)。斑馬魚(yú)在18℃低溫適應(yīng)的同時(shí), 用丙基硫尿嘧啶(PTU)處理抑制甲狀腺素的合成, 能影響能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)和降低低溫適應(yīng)對(duì)個(gè)體持續(xù)游泳能力的增強(qiáng)作用[36]。抑制甲狀腺素的合成使個(gè)體持續(xù)游泳的能力降低, 主要表現(xiàn)為尾部擺動(dòng)頻率下降, 這可能與肌肉組織中肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶(SERCA)活性降低和肌球蛋白重鏈的表達(dá)水平下降有關(guān)[37]。甲狀腺素在斑馬魚(yú)低溫適應(yīng)過(guò)程中還能通過(guò)影響心率和SERCA的活性來(lái)增強(qiáng)心臟的功能[38]。

2.3 低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制

細(xì)胞接收到低溫信號(hào)以后, 通過(guò)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控, 從而建立新的胞內(nèi)穩(wěn)態(tài), 修復(fù)低溫應(yīng)激造成的分子損傷, 清除受損嚴(yán)重的細(xì)胞, 增強(qiáng)機(jī)體的抗寒能力。在低溫脅迫時(shí), 魚(yú)類(lèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感受低溫刺激。作為低溫感受器的離子通道被激活, 使鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高, 激活相關(guān)的激酶, 進(jìn)而使特定的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化修飾而活化; 活化的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核激活下游基因的轉(zhuǎn)錄, 完成低溫信號(hào)的傳遞(圖 2)。

轉(zhuǎn)錄組研究是揭示魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制的重要手段。近年來(lái), 應(yīng)用基因芯片、RNA-seq和small RNA-seq等技術(shù)對(duì)多種魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了研究, 鑒定低溫調(diào)控的基因、miRNA、lncRNA和轉(zhuǎn)錄本的可變剪接事件。研究的種類(lèi)既有模式魚(yú), 也有經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi), 既有暖水性魚(yú)類(lèi), 也有冷水性魚(yú)類(lèi); 低溫處理方式有急性暴露, 也有慢性暴露; 刺激程度有溫和的、非致死的處理, 也有致死低溫暴露; 樣品的組織來(lái)源也多種多樣。雖然不同種類(lèi)對(duì)低溫刺激的反應(yīng)具有很大差異, 但鑒定到了低溫應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)記基因, 如低溫誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白cirbp、高遷移率蛋白家族(hmgb)成員和硬脂酰輔酶A去飽和酶(scd)等, 這些基因在大多數(shù)情況下都能被低溫刺激誘導(dǎo)表達(dá)[39—42]。通過(guò)對(duì)低溫響應(yīng)基因(Coldresponsive gene, CRG)進(jìn)行基因本體(Gene ontology, GO)和信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn), RNA剪接、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生物鐘節(jié)律和蛋白質(zhì)分解代謝等是最具代表性的受低溫調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程[18,39—41,43—45],FoxO信號(hào)通路在調(diào)控魚(yú)類(lèi)抗寒能力的形成中具有重要作用[46]。不同組織對(duì)低溫刺激的反應(yīng)既有共同的特征, 又有很高的組織特異性[39,44,45]。特定組織的低溫應(yīng)激反應(yīng)與其功能相關(guān), 例如肝臟的CRG主要參與能量和脂肪酸代謝[4,5,47], 肌肉的CRG主要參與能量代謝和肌肉萎縮[39,48], 鰓的CRG主要參與離子調(diào)控[49]。

除了基因表達(dá)水平變化以外, 前體RNA發(fā)生低溫誘導(dǎo)的可變剪接, 產(chǎn)生不同的可變剪接體(圖 2),也是魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)的重要組分[41]。在低溫條件下, 很多基因發(fā)生了可變剪接, 但是總的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平卻保持不變[41,50,51]。RNA-seq在檢測(cè)基因表達(dá)豐度的同時(shí), 還能鑒定可變剪接和可變啟動(dòng)子使用等轉(zhuǎn)錄調(diào)控事件。通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)的42個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析, 在腦和心臟中分別鑒定了483和208個(gè)低溫調(diào)控的可變剪接事件[50]。對(duì)底鳉(Fundulus heteroclitus)、三刺魚(yú)(Gasterosteus aculeatus)和斑馬魚(yú)的骨骼肌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 不同種類(lèi)中發(fā)生低溫誘導(dǎo)可變剪接的基因數(shù)目為426—866,說(shuō)明在低溫適應(yīng)過(guò)程中大量的基因發(fā)生了可變剪接[51]。低溫誘導(dǎo)的可變剪接在調(diào)控?cái)M南芥(Arabidopsis thaliana)的抗凍能力形成中具有重要作用[52],但在調(diào)控魚(yú)類(lèi)抗寒中的作用和機(jī)制還不清楚。

研究魚(yú)類(lèi)CRG的表達(dá)調(diào)控對(duì)于解析其抗寒能力建成的分子機(jī)制具有重要的意義。轉(zhuǎn)錄因子、miRNA和lncRNA是主要的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。轉(zhuǎn)錄因子AP-1的結(jié)合元件在斑馬魚(yú)低溫誘導(dǎo)基因的上游序列中顯著富集, 轉(zhuǎn)錄因子Jun與Bcl6的復(fù)合體通過(guò)與AP-1元件相結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)[44]。研究者們應(yīng)用small RNA-seq技術(shù)鑒定了魚(yú)類(lèi)中受低溫調(diào)控的miRNA及其靶基因。在斑馬魚(yú)仔魚(yú)中發(fā)現(xiàn)dre-mir-29b調(diào)控低溫誘導(dǎo)基因per2的表達(dá)[53]。在鯉肝臟中發(fā)現(xiàn), 高溫和低溫刺激調(diào)控相同的miRNA, 但是作用的方向相反; 這些差異表達(dá)的miRNA主要參與調(diào)控糖皮質(zhì)激素代謝和胰島素信號(hào)通路[54]。在羅非魚(yú)的腎臟中發(fā)現(xiàn)miR-29a/122能調(diào)控scd基因的表達(dá)[55]。在斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)低溫響應(yīng)miRNA的靶基因主要參與磷酸化調(diào)控、細(xì)胞連接和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程, 使用這些miRNA的抑制劑或類(lèi)似物處理ZF4細(xì)胞, 可增強(qiáng)細(xì)胞的低溫耐受能力[56]。將致死低溫暴露后的大菱鲆(Scophthalmus maximus) 分為耐受組和敏感組, 同時(shí)檢測(cè)基因和miRNA表達(dá), 鑒定了與抗寒能力相關(guān)的CRG和miRNA[57]。關(guān)于lncRNA調(diào)控魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)的研究還很少。在斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞中鑒定了低溫調(diào)控的lncRNA, 這些lncRNA可能參與調(diào)控電子轉(zhuǎn)移、細(xì)胞黏附和氧化還原等生物學(xué)過(guò)程[58]。

2.4 低溫應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)組和代謝組研究

在低溫條件下, 細(xì)胞優(yōu)先翻譯包含特定序列的mRNA分子, 從而調(diào)整細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成; 低溫還誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的磷酸化和乙?；确g后修飾, 使其化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變, 更有利于在低溫下發(fā)揮功能(圖 2)?；谫|(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)極大地促進(jìn)了低溫調(diào)控的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定。從蝦虎魚(yú)(Gillichthys mirabilis)的心臟中鑒定到37個(gè)受溫度影響的蛋白質(zhì), 這些蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、線(xiàn)粒體調(diào)控和細(xì)胞骨架組織等生物學(xué)過(guò)程; 在9℃低溫適應(yīng)后, 蝦虎魚(yú)心臟肌酐激酶的表達(dá)豐度顯著上升, 說(shuō)明磷酸肌酐能量系統(tǒng)在低溫條件下對(duì)心臟的功能具有重要作用[59]。在暗紋東方鲀(Takifugu fasciatus)的肝臟中發(fā)現(xiàn)了160個(gè)受低溫調(diào)控的蛋白質(zhì), 低溫誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白(CIRBP)、熱激蛋白90(HSP90)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是代表性的低溫誘導(dǎo)蛋白; 這些蛋白質(zhì)富集的生物學(xué)過(guò)程包括氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體酶和信號(hào)傳導(dǎo)等[60]。對(duì)金頭鯛的肝臟進(jìn)行的定量蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn), 低溫調(diào)控的蛋白主要參與分解代謝[61]。從鯉的血漿中鑒定了22個(gè)低溫誘導(dǎo)的蛋白, 這些蛋白質(zhì)主要參與脂肪代謝和應(yīng)激反應(yīng)[62]。定量磷酸化蛋白質(zhì)組研究從斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞中鑒定到702個(gè)低溫條件下發(fā)生差異磷酸化修飾的位點(diǎn), 分布于510個(gè)蛋白質(zhì); 這些差異磷酸化蛋白與蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程相關(guān); 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)是低溫適應(yīng)過(guò)程中調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)鍵激酶[30]。在斑馬魚(yú)仔魚(yú)上的研究也證明, 低溫刺激可激活ERK1/2和p38 MAPK(Mitogen-activated protein kinase, 絲裂原活化蛋白激酶), 抑制其活性可顯著降低仔魚(yú)抗寒能力[63]。蛋白質(zhì)組研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)魚(yú)類(lèi)抗寒能力建成的分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支撐, 也為魚(yú)類(lèi)低溫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究提供了重要線(xiàn)索。

圖2 魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)的遺傳調(diào)控Fig. 2 Genetic regulation underlying cold stress responses of fish

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究可揭示應(yīng)激狀態(tài)下基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和豐度等特征, 指示細(xì)胞代謝和生理狀態(tài)的變化趨勢(shì), 而代謝組研究則檢測(cè)細(xì)胞和組織中各種代謝物的含量。代謝物是細(xì)胞生命過(guò)程的終產(chǎn)物, 代謝物水平被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化所產(chǎn)生最終反應(yīng)[64]。對(duì)金頭鯛的研究發(fā)現(xiàn), 在降溫過(guò)程中(28d內(nèi)將溫度從18℃降至11℃)肝臟的糖原、葡萄糖和ATP/ADP含量顯著降低; 在低溫維持過(guò)程中(11℃, 28d), 肝臟葡萄糖和ATP/ADP的含量回升; 而在恢復(fù)過(guò)程中(28d內(nèi)將溫度從11℃升高到18℃)肝臟糖原和葡萄糖含量進(jìn)一步升高[65]。對(duì)許氏平鲉(Sebastes schlegelii)血液的研究發(fā)現(xiàn), 急性低溫刺激能引起脂肪酸代謝通路中相關(guān)代謝物水平的變化[66]。從大黃魚(yú)的肝臟中鑒定了受低溫和饑餓影響的代謝物, 這些代謝物主要與谷胱甘肽(GSH)代謝和不飽和脂肪酸合成等代謝通路有關(guān)[67]。對(duì)七彩神仙魚(yú)(Symphysodon aequifasciatus)的鰓進(jìn)行了代謝組研究, 發(fā)現(xiàn)慢性低溫處理能激活抗氧化系統(tǒng)和GSH代謝[68]。以上研究結(jié)果表明, 能量代謝和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)魚(yú)類(lèi)抗寒能力的建成具有重要影響。

2.5 低溫應(yīng)激反應(yīng)的“多組學(xué)”整合分析

機(jī)體和細(xì)胞的抗寒能力由不同類(lèi)型的生物分子通過(guò)相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)共同決定。因此, 進(jìn)行“多組學(xué)”的聯(lián)合分析能有效地獲得與抗寒相關(guān)的效應(yīng)基因, 更全面地解析魚(yú)類(lèi)低溫適應(yīng)和抗寒能力形成的分子調(diào)控機(jī)制。在對(duì)暗紋東方鲀的肝臟進(jìn)行的“多組學(xué)”(轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組)分析中, 發(fā)現(xiàn)了36個(gè)共表達(dá)的差異表達(dá)基因(DEG)-差異表達(dá)蛋白(DEP)對(duì), 19個(gè)變化方向相反的DEGDEP對(duì), 及40個(gè)差異表達(dá)代謝物(DEM); 其中17個(gè)DEM和14個(gè)共表達(dá)的DEG-DEP對(duì), 都參與脂肪酸代謝和膜轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程[47]。

2.6 表觀(guān)遺傳修飾對(duì)魚(yú)類(lèi)抗寒能力形成的作用

低溫可誘導(dǎo)組蛋白發(fā)生乙酰化等翻譯后修飾,基因組DNA發(fā)生甲基化和去甲基化等修飾(圖 2)。大量研究關(guān)注魚(yú)類(lèi)的“熱印記(Thermal imprint)[69]”,即發(fā)育的早期階段經(jīng)歷的溫度環(huán)境對(duì)幼魚(yú)或成魚(yú)階段面臨溫度脅迫時(shí)產(chǎn)生反應(yīng)的影響。斑馬魚(yú)胚胎期的培養(yǎng)溫度會(huì)影響成魚(yú)在低溫條件下的游泳能力、不同類(lèi)型肌纖維的組成和肌肉組織對(duì)低溫刺激的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[70]。金頭鯛胚胎和仔魚(yú)階段經(jīng)歷的“熱印記”影響成魚(yú)對(duì)低溫脅迫的反應(yīng); 在低溫處理后, 金頭鯛血漿皮質(zhì)醇、Na+、K+和葡萄糖水平,及骨骼代謝均受早期發(fā)育階段培養(yǎng)溫度的影響[69]。胚胎期的培養(yǎng)溫度還影響塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)和大西洋鱈(Gadus morhua)幼魚(yú)不同組織中miRNA的表達(dá)[71,72]。

這種“熱印記”的實(shí)質(zhì)是個(gè)體的“熱經(jīng)歷”使其基因組的相關(guān)位點(diǎn)發(fā)生了可以長(zhǎng)期持續(xù)的表觀(guān)遺傳修飾。在三刺魚(yú)中研究了胚胎期的培養(yǎng)溫度和成魚(yú)期的適應(yīng)溫度對(duì)肌肉DNA甲基化和基因表達(dá)的影響, 發(fā)現(xiàn)irs2b、klhl38b、gadd45ga和slc3a2a是對(duì)溫度刺激產(chǎn)生反應(yīng)的代表性基因; 上調(diào)表達(dá)基因富集的生物學(xué)過(guò)程主要有細(xì)胞分裂、mRNA剪接和蛋白質(zhì)降解, 下調(diào)表達(dá)基因富集的生物學(xué)過(guò)程主要包括細(xì)胞外基質(zhì)組織和細(xì)胞黏附[73]。同時(shí), 該研究還比較了差異表達(dá)基因和差異甲基化位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)了324個(gè)低溫或高溫適應(yīng)后與差異甲基化相關(guān)聯(lián)的差異表達(dá)基因[73,74]。該研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與發(fā)育階段“熱印記”造成的差異表達(dá)基因相關(guān)聯(lián)的DNA甲基化位點(diǎn), 可能“熱印記”的效應(yīng)主要由其他類(lèi)型的表觀(guān)遺傳修飾(如組蛋白乙酰化等)決定[73]。

2.7 魚(yú)類(lèi)抗寒相關(guān)基因的功能研究

雖然通過(guò)組學(xué)研究已經(jīng)鑒定了大量的CRG, 但對(duì)這些基因在調(diào)控魚(yú)類(lèi)抗寒性狀中的功能卻知之甚少。目前, 已有研究者應(yīng)用轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲和CRISPR/Cas9技術(shù), 建立了轉(zhuǎn)基因、基因插入失活和基因敲除的斑馬魚(yú)品系, 來(lái)研究目的基因在魚(yú)類(lèi)抗寒中的功能。例如通過(guò)研制轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系, 在斑馬魚(yú)肌肉中表達(dá)鯉的Ⅲ型肌酐激酶(M3CK), 顯著增強(qiáng)了其抗寒能力[75]。對(duì)斑馬魚(yú)grinaa基因轉(zhuǎn)座子插入失活突變體的研究發(fā)現(xiàn), Grinaa能減輕低溫誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡, 從而提高魚(yú)體的抗寒能力[76]。另外, 還應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了敲除自噬相關(guān)基因atg12和脂肪代謝相關(guān)基因cpt1b的斑馬魚(yú)品系, 發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因的突變都能降低斑馬魚(yú)的抗寒能力[77]。這些轉(zhuǎn)基因和基因突變的斑馬魚(yú)品系對(duì)研究目的基因在調(diào)控魚(yú)類(lèi)抗寒中的功能和作用機(jī)制具有重要的意義。

3 其他因子對(duì)魚(yú)類(lèi)抗寒能力的影響

3.1 低氧

在自然條件下, 由于棲息地的環(huán)境復(fù)雜多變,魚(yú)類(lèi)往往會(huì)同時(shí)暴露于不同的環(huán)境刺激。對(duì)變溫脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō), 暴露于不同類(lèi)型的刺激, 都會(huì)造成組織缺氧和氧化應(yīng)激[6]。溫度和低氧是對(duì)魚(yú)類(lèi)生理功能具有重要影響, 且能相互作用的兩種環(huán)境刺激因子[78]。魚(yú)類(lèi)在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中形成了對(duì)低氧和低溫等環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn), 低氧適應(yīng)(5%氧氣)能顯著增強(qiáng)個(gè)體對(duì)致死低溫(12℃)的耐受能力, 而低溫適應(yīng)(18℃)卻使個(gè)體對(duì)致死低氧處理(2.5%氧氣)更加敏感[79]; RNA-seq分析結(jié)果表明, 低溫和低氧共誘導(dǎo)的基因主要參與氧化還原過(guò)程、氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)、造血、血紅蛋白合成和細(xì)胞離子平衡[79]。低溫和低氧脅迫都能誘導(dǎo)細(xì)胞和組織產(chǎn)生ROS[80,81]。急性低溫暴露誘導(dǎo)斑馬魚(yú)肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激, 投喂含α-硫辛酸或GSH等還原劑的飼料可以顯著降低低溫引起的氧化應(yīng)激, 進(jìn)而減輕組織損傷, 增強(qiáng)抗寒能力; 而H2O2處理誘導(dǎo)氧化應(yīng)激則能降低斑馬魚(yú)ZFL細(xì)胞的耐寒能力[82]。

3.2 鹽度

鹽度是影響?hù)~(yú)類(lèi)生理的一個(gè)重要環(huán)境因子。降河洄游魚(yú)類(lèi)會(huì)同時(shí)遭受高鹽度和低溫刺激[83]。水體鹽度對(duì)遮目魚(yú)(Chanos chanos)的抗寒能力具有明顯的影響, 在海水中適應(yīng)的個(gè)體與在淡水中適應(yīng)的個(gè)體相比, 抗寒能力顯著增強(qiáng)[84]。低鹽度刺激可能通過(guò)影響低溫條件下遮目魚(yú)肝臟糖原的分解代謝[85]、ATP合成[86]和鰓的離子調(diào)控[84], 來(lái)影響其抗寒能力。對(duì)刀鱭(Coilia nasus)同時(shí)進(jìn)行高鹽度和低溫刺激, 發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)、受體和調(diào)控蛋白可能在洄游中起著重要的調(diào)控作用[83]。

另外, 一些低溫響應(yīng)基因能被多種環(huán)境刺激誘導(dǎo)表達(dá)。如斑馬魚(yú)nr1d4a和nr1d4b基因能被重金屬、缺氧和高鹽度處理誘導(dǎo)表達(dá)[87]。這些能被多種環(huán)境刺激的誘導(dǎo)表達(dá)的基因可能代表細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)機(jī)制的核心模塊, 低氧和鹽度等環(huán)境刺激因子可能通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)影響?hù)~(yú)類(lèi)的低溫應(yīng)激反應(yīng)和抗寒能力。

3.3 饑餓和營(yíng)養(yǎng)

低溫脅迫會(huì)降低魚(yú)的攝食率, 引起饑餓[77]。雖然長(zhǎng)期的饑餓會(huì)導(dǎo)致能量耗竭, 但是一定水平的饑餓不僅可以?xún)?yōu)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝, 還可以通過(guò)增強(qiáng)自噬減輕細(xì)胞損傷[88]。研究發(fā)現(xiàn), 饑餓48h能顯著增強(qiáng)斑馬魚(yú)的抗寒能力; 脂肪分解代謝和自噬的激活在禁食誘導(dǎo)的抗寒效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用; 另外, 抑制mTOR信號(hào)通路可以起到與禁食一樣的抗寒效果, 而激活mTOR信號(hào)通路則能減弱抗寒效應(yīng)[77];根據(jù)該研究的結(jié)果, 養(yǎng)殖生產(chǎn)中適當(dāng)禁食可以作為提高魚(yú)類(lèi)抗寒能力的策略[77]。飼料的營(yíng)養(yǎng)成分, 如脂肪的來(lái)源也能影響?hù)~(yú)類(lèi)的抗寒能力。尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)攝食添加玉米油或玉米油與魚(yú)油混合物(1∶1)的飼料時(shí), 與添加魚(yú)油或可可油的飼料相比, 抗寒能力顯著增強(qiáng)[89]。該研究結(jié)果說(shuō)明可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)增強(qiáng)羅非魚(yú)的抗寒能力。

4 遺傳多樣性與魚(yú)類(lèi)的抗寒性狀

魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)動(dòng)物大多數(shù)都處于家養(yǎng)馴化的早期階段, 種內(nèi)遺傳多樣性豐富, 可以通過(guò)遺傳篩選獲得顯著的性狀改良效應(yīng)[90]。很多養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)有眾多地方品種和選育品系, 不同的品種在體色、鱗片和體型等形態(tài)特征和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的能力方面具有明顯差異。例如, 對(duì)于我國(guó)主要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一的鯉而言, 北方的黑龍江野鯉和人工培育的松浦鏡鯉都具有很強(qiáng)的耐寒能力, 可以在冬季長(zhǎng)期冰封的池塘中生存, 但鯉的近緣種柏氏鯉(Cyprinus pellegriniTchang)卻對(duì)低溫非常敏感[91]。研究者們?cè)?jīng)嘗試應(yīng)用RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)和SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列)等標(biāo)記定位鯉耐寒相關(guān)QTL位點(diǎn)[91,92];但由于檢測(cè)通量小, 標(biāo)記數(shù)目不足, 遺傳圖譜不完全, 鑒定到的標(biāo)記難以定位到染色體上[91]。因此,迄今尚未克隆到?jīng)Q定鯉耐寒能力的關(guān)鍵基因或調(diào)控元件。

最近的研究發(fā)現(xiàn),hsp70和hmgb1基因序列中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)與牙鲆(Paralichthys olivaceus)的抗寒能力顯著相關(guān)[93], 其中hmgb1是多種魚(yú)類(lèi)中受到低溫刺激時(shí)高水平上調(diào)表達(dá)的標(biāo)記基因[39,40]。對(duì)底鳉肌肉組織的研究結(jié)果表明, 線(xiàn)粒體的基因型對(duì)低溫應(yīng)激條件下的基因表達(dá)也有一定影響[94]。研究核基因組和線(xiàn)粒體基因組遺傳多樣性與魚(yú)類(lèi)抗寒能力的關(guān)系有望開(kāi)發(fā)抗寒相關(guān)的分子標(biāo)記, 促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的抗寒育種。

5 展望

在應(yīng)用各種組學(xué)技術(shù)開(kāi)展的魚(yú)類(lèi)低溫應(yīng)激反應(yīng)研究中, 發(fā)現(xiàn)了大量的低溫響應(yīng)基因, 但是大部分基因的功能都還不清楚。在斑馬魚(yú)等模式魚(yú)上,應(yīng)用基因工程和基因編輯技術(shù)研制轉(zhuǎn)基因、基因敲除和基因定點(diǎn)編輯的品系, 可以為系統(tǒng)解析目的基因的作用機(jī)制提供研究模型。在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中, 可通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)和數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位等技術(shù)鑒定影響抗寒能力的關(guān)鍵變異位點(diǎn)和分子模塊, 開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記, 開(kāi)展主要養(yǎng)殖品種的分子標(biāo)記輔助抗寒育種。另外, 根據(jù)模式魚(yú)中抗寒相關(guān)基因的作用機(jī)制及關(guān)鍵位點(diǎn)的精細(xì)定位等研究結(jié)果, 對(duì)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)相應(yīng)的基因及其調(diào)控序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯, 有望使其耐寒能力顯著增強(qiáng)。