祝璟琳 李大宇 鄒芝英 肖 煒 喻 杰 楊 弘* 薛良義*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室, 無錫 214081;2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211)

羅非魚(Oreochromisspp.)是世界上第二大經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類, 也是世界范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的主要來源之一。無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一種革蘭氏陽性菌, 也是魚類感染的常見病原菌, 由無乳鏈球菌等引起的鏈球菌病已嚴(yán)重危害全球羅非魚養(yǎng)殖業(yè), 造成巨大的經(jīng)濟損失[1,2]。據(jù)中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計, 我國羅非魚主產(chǎn)區(qū)為廣東、海南、廣西、云南和福建等省區(qū), 2018年產(chǎn)量為162.45×107kg,總產(chǎn)量和出口量都居世界首位。自2009年以來, 我國羅非魚暴發(fā)了大規(guī)模的鏈球菌病感染, 死亡率高達30%—90%, 病原菌90%以上是無乳鏈球菌[3,4]。使用抗生素和疫苗可以在短期內(nèi)減輕羅非魚鏈球菌病, 然而, 抗生素使用有導(dǎo)致耐藥性和藥殘的風(fēng)險, 造成潛在的食品安全隱患; 疫苗雖在實驗室取得較好的免疫保護率, 但離批文的獲得和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有很長的距離, 短期內(nèi)通過疫苗防治鏈球菌病仍有很大困難[2,5]。

作為一種長期的解決方案, 培育抗病品系可以有效地控制疾病。魚類和甲殼類對特定疾病的抗病品系培育都取得了一定進展, 如鮭鱒類[6—9]和蝦[10,11]。由于鏈球菌病對全球羅非魚產(chǎn)業(yè)的影響,國外學(xué)者已將對該疾病的抗病性選育作為育種目標(biāo)[12—14]。我們前期研究表明奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus♀×O. aureus♂)比其他羅非魚選育品種抗鏈球菌病能力更強[15]。雜交育種技術(shù)是提高羅非魚生長速率和雄性率, 并從遺傳本質(zhì)上提高羅非魚內(nèi)在抗病力的根本手段[16,17]。很少有研究直接比較水生動物的親本及其雜種之間的免疫力和病原菌抵抗力[18]。Arias等[19]曾報道雜交斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus×I. furcatus)對柱形病的抵抗力明顯高于親本。Bunlipatanon等[20]研究表明雜交石斑魚(Epinephelus lanceolatus×E. fuscoguttatus)的白細胞數(shù)、溶菌酶活性和清除病原菌的能力都很高, 而親本虎斑石斑魚(E. fuscoguttatus)則較低,相應(yīng)地虎斑石斑魚感染創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)后的存活率最低。本實驗的目的是比較雜交子一代奧尼羅非魚與親本尼羅羅非魚(O. niloticus)和奧利亞羅非魚(O. aureus)在腹腔注射無乳鏈球菌后的生理響應(yīng)變化, 研究它們對無乳鏈球菌的敏感性和免疫反應(yīng), 評估雜交種奧尼羅非魚相對于其親本的抗病性, 以期深入了解奧尼羅非魚中觀察到的抗病性雜種優(yōu)勢的生理和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗魚均來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部羅非魚遺傳育種中心南泉科研基地, 奧利亞羅非魚 “夏奧1號”(簡稱為AX奧利亞羅非魚)魚體質(zhì)量為(145±30) g; 尼羅羅非魚埃及品系(簡稱NE尼羅羅非魚)魚體質(zhì)量為(121±30) g; 奧尼羅非魚為(NE尼羅羅非魚♀×AX奧利亞羅非魚♂)的雜交子一代(簡稱EX奧尼羅非魚),魚體質(zhì)量(150±40) g。每種羅非魚隨機取200尾運回實驗室后在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7d, 養(yǎng)殖桶體積為360 L, 水溫(33±1)℃, 在按常規(guī)飼養(yǎng)方法管理。攻毒開始后每個養(yǎng)殖桶單獨控溫(33±1)℃。實驗菌株編號LB110808-2, 保存于本實驗室, 經(jīng)16S rDNA分子鑒定為無乳鏈球菌(GenBank登錄號:JQ990153), 復(fù)壯后使用。

1.2 人工感染實驗

感染實驗①: 經(jīng)預(yù)實驗確定NE尼羅羅非魚的半致死濃度為6.5×107cfu/mL, 1.2×108cfu/mL無乳鏈球菌分別腹腔注射3種羅非魚, 按每100 g魚體腹腔注射菌液0.1 mL, 每種羅非魚每組10尾, 設(shè)3個平行, 人工感染后連續(xù)觀察7d, 并統(tǒng)計7d內(nèi)累積死亡率, 實驗期間不投喂。

感染實驗②: 另每種羅非魚取120尾, 分為4組,其中3組2.2×107cfu/mL無乳鏈球菌腹腔注射, 按每100 g魚體腹腔注射菌液0.1 mL, 剩余1組注射等量的無菌生理鹽水, 用于分析感染后血液生理指標(biāo)、血清生化指標(biāo)和脾臟促炎性細胞因子的變化規(guī)律,研究奧尼羅非魚及其親本感染無乳鏈球菌后生理響應(yīng)變化。

實驗期間不投餌, 周圍保持安靜, 減少干擾。在感染實驗②中, 在注射感染后第2天每種羅非魚隨機取1—2條有癥狀的魚解剖, 無菌操作取脾臟在腦心浸液瓊脂(BHIA)培養(yǎng)基上劃線分離細菌, 28℃培養(yǎng)24h后用API 20 Strep快速鑒定條(梅里埃公司)鑒定。

1.3 樣品采集

感染實驗②中注射生理鹽水腹腔注射后0, 無乳鏈球菌腹腔注射后7h、24h、48h、72h、120h和168h每組羅非魚隨機取9尾魚, 用2.5 mL注射器魚尾靜脈取血后, 分成2份, 1份制作抗凝血用作血液生理指標(biāo)和呼吸暴發(fā)測定, 另一份室溫靜置2—4h后, 4000 r/min離心15min后, 吸取上層血清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中, 放置-20℃冰箱待實驗。同時取脾臟放入加有1 mL Trizol試劑的凍存管中,液氮速凍后保存-70℃冰箱。

1.4 羅非魚血液生理指標(biāo)和血清生化指標(biāo)測定

血液中白細胞、紅細胞、血紅蛋白和紅細胞壓積在貝克曼庫爾特LH 750全自動血液分析儀上測定; 血清中總蛋白、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇指標(biāo)在日立7600型全自動生化分析儀上測定; 溶菌酶活力采用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒, 按照說明書操作。

呼吸暴發(fā)活力采用NBT(硝基四氮唑藍)還原法進行測定。采樣當(dāng)日采集的100 μL的抗凝新鮮血液中加入100 μL 0.2% NBT(Nitroblue tetrazolium,Sigma), 37℃孵育30min, 之后取15 μL 反應(yīng)液, 加入300 μL N, N′-二甲基甲酰胺(DMF), 充分混勻, 在2000 r/min, 4℃條件下離心5min, 取200 μL上清液于540 nm下讀取吸光值, 以200 μL DMF為空白對照, 呼吸暴發(fā)活性用OD540nm表示。

1.5 總RNA的抽提及cDNA的合成

將保存在超低溫冰箱中的脾臟樣品取出, 放入Sceintz-48型高通量組織研磨機(寧波新芝公司)中研磨勻漿。按照Trizol試劑使用說明書提取總RNA。提取的RNA經(jīng)Nanodrop超微量紫外分光光度計(Thermo公司)測定RNA的濃度及A260/A280, 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書合成cDNA。

1.6 實時熒光定量PCR分析

目標(biāo)基因和內(nèi)參基因引物序列見表 1, 在7900HT Fast Real Time PCR儀(ABI公司)上進行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系(20 μL)為: 2×SYBR Green I real-time PCR Master Mix (Toyobo公司) 10 μL, cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L) 各0.8 μL, 無RNA水7.4 μL; PCR擴增程序: 95℃ 預(yù)變性5min; 95℃ 變性15s, 60℃退火延伸 1min, 40個循環(huán); 目的基因和內(nèi)參基因擴增效率基本一致的前提下, 用2-ΔΔCt法分析計算TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA 的相對表達量。

表1 引物序列表Tab. 1 The sequence of primer

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel 2016初步處理后, 用SPSS 19軟件進行單因素方差分析檢驗(One-way ANOVA), 當(dāng)差異顯著時(P＜0.05), 則進行Duncan’s多重比較, 用GraphPadPrism8軟件作圖。血液生理生化指標(biāo)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后累計死亡率差異

如圖 1可見, 感染實驗①中每組羅非魚死亡主要集中在無乳鏈球菌感染后72h內(nèi), 實驗組EX奧尼羅非魚感染后各時間點的累積死亡率都顯著低于親本NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05),感染后7d累積死亡率NE尼羅羅非魚(64.07%)＞AX奧利亞羅非魚(56.00%)＞EX奧尼羅非魚(43.33%),而對照組3種羅非魚的累積死亡率均為0, 表明EX奧尼羅非魚對無乳鏈球菌的耐受力顯著強于親本。在感染實驗②中, 在人工感染后2d, 每種奧尼羅非魚的脾臟中均分離到了細菌, 用API 20 Strep快速鑒定試劑條鑒定均為無乳鏈球菌。

圖1 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后累計死亡率變化Fig. 1 Changes of cumulative mortality of tilapia and its parents artificially infected with Streptococcus agalactiae

2.2 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血液生理指標(biāo)變化

EX奧尼羅非魚和AX奧利亞羅非魚白細胞數(shù)在感染后7h顯著性升高(P＜0.05), 感染后24h達峰;NE尼羅羅非魚在感染后24h顯著性升高(P＜0.05),EX奧尼羅非魚和NE尼羅羅非魚白細胞數(shù)感染后168h都恢復(fù)到感染前水平, 而此時AX奧利亞羅非魚的白細胞數(shù)還未恢復(fù)到感染前水平。感染前、感染后7h和24h EX奧尼羅非魚白細胞數(shù)顯著高于NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 感染后48h和72h AX奧利亞羅非魚的白細胞數(shù)最高, 感染120h后每種羅非魚之間沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖 2A)。

3種羅非魚感染無乳鏈球菌后紅細胞數(shù)都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢, EX奧尼羅非魚在感染后72h紅細胞數(shù)最低, NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚紅細胞數(shù)分別在感染后24h和48h數(shù)目最低。感染前EX奧尼羅非魚紅細胞數(shù)顯著高于NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 感染后7h和24h NE尼羅羅非魚的紅細胞數(shù)顯著低于EX奧尼羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 感染后48h每種羅非魚之間紅細胞數(shù)沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖 2B)。

圖2 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血液白細胞(A)和紅細胞(B)數(shù)量變化Fig. 2 Changes of white blood cell (A) and erythrocyte (B) after artificial infection of S. agalactiae in hybrid tilapia and its parents

3種羅非魚感染后血紅蛋白含量均顯著性下降(P＜0.05), EX奧尼羅非魚和NE尼羅羅非魚在感染后24h顯著降低, AX奧利亞羅非魚在感染后7h就顯著降低, 感染120h后3種羅非魚的血紅蛋白均降到最低值。感染前EX奧尼羅非魚和AX奧利亞羅非魚血紅蛋白含量顯著高于NE尼羅羅非魚(P＜0.05), 感染后48h和72h AX奧利亞羅非魚血紅蛋白含量則顯著高于其余2種羅非魚(P＜0.05; 圖 3A)。

3種羅非魚感染無乳鏈球菌后紅細胞壓積在7h就顯著降低(P＜0.05), 整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢, 在感染后48h最低。感染前EX奧尼羅非魚紅細胞壓積顯著高于NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 感染24h后 NE尼羅羅非魚紅細胞壓積則顯著低于其余兩種羅非魚(P＜0.05; 圖 3B)。

圖3 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血液血紅蛋白(A)和紅細胞壓積(B)數(shù)量變化Fig. 3 Changes of hemoglobin (A) and hematocrit (B) in blood after artificial infection of S. agalactiae in hybrid tilapia and its parents

2.3 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血清生化指標(biāo)變化

3種羅非魚感染后總蛋白均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢, 在感染后7h最低。感染前EX奧尼羅非魚的總蛋白含量在2個親本中間, NE尼羅羅非魚的總蛋白含量顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 在感染后7—48h AX奧利亞羅非魚的總蛋白最高, 感染后120—168h則NE尼羅羅非魚的總蛋白含量顯著低于其余2種羅非魚(P＜0.05; 圖 4A)。

EX奧尼羅非魚和NE尼羅羅非魚的葡萄糖在感染后都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, EX奧尼羅非魚在感染后72h達到峰值, 在感染后120h恢復(fù)到感染前水平; NE尼羅羅非魚在感染后24h就達到峰值,在感染后48h恢復(fù)到感染前水平; AX奧利亞羅非魚的葡萄糖在感染后呈現(xiàn)下降趨勢。3種羅非魚的葡萄糖在感染前沒有顯著性差異(P＞0.05), 在感染后EX奧尼羅非魚的葡萄糖顯著高于親本(P＜0.05; 圖 4B)。

圖4 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血液總蛋白(A)和葡萄糖(B)數(shù)量變化Fig. 4 Changes of total protein (A) and glucose (B) in blood after artificial infection of S. agalactiae in hybrid tilapia and its parents

EX奧尼羅非魚和NE尼羅羅非魚的總膽固醇感染后呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢, AX奧利亞羅非魚則表現(xiàn)為先升高再降低的趨勢, 在感染后24h達到峰值。EX奧尼羅非魚的總膽固醇含量在感染前后介于2個親本中間, NE尼羅羅非魚的總膽固醇在感染前后都最低(圖 5A)。

3種羅非魚的甘油三酯感染后都呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢, EX奧尼羅非魚和NE尼羅羅非魚在感染后24h最低, AX奧利亞羅非魚在感染后48h最低,感染后168h NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚恢復(fù)到感染前水平。感染前EX奧尼羅非魚的甘油三酯顯著高于NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 感染后168h EX奧尼羅非魚的甘油三酯顯著低于NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05;圖 5B)。

圖5 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血清總膽固醇(A)和甘油三酯(B)數(shù)量變化Fig. 5 Changes of serum total cholesterol (A) and triglyceride (B) after artificial infection of S. agalactiae in hybrid tilapia and its parents

3種羅非魚的溶菌酶感染后都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, EX奧尼羅非魚在感染后48—120h顯著升高(P＜0.05), 在感染后168h恢復(fù)到感染前水平;NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚在感染后7h就顯著升高(P＜0.05), 在感染后168h仍然顯著高于感染前水平(P＜0.05)。感染前、感染后72h和120h EX奧尼羅非魚的溶菌酶顯著高于NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 感染后168h EX奧尼羅非魚的溶菌酶仍然顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05;圖 6A)。

3種羅非魚血液呼吸暴發(fā)強度在感染后均出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05)。感染前的血液呼吸暴發(fā)強度AX奧利亞羅非魚＞NE尼羅羅非魚＞EX奧尼羅非魚,感染后7—72h 的呼吸暴發(fā)強度則AX奧利亞羅非魚＜NE尼羅羅非魚＜EX奧尼羅非魚, 在感染后120h, 3組呼吸暴發(fā)水平相近, 沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖 6B)。

圖6 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血清溶菌酶(A)和呼吸暴發(fā)(B)變化Fig. 6 Changes of serum lysozyme (A) and respiratory burst (B) after artificial infection of S. agalactiae in hybrid tilapia and its parents

2.4 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后脾臟促炎性細胞因子表達量的變化

3種羅非魚的脾臟TNF-α表達量在感染后都顯著性升高(P＜0.05), 且都在感染后7h達到峰值, 之后顯著性下降, 但在感染后168h仍然顯著高于感染前水平(P＜0.05); 感染前和感染后48h NE尼羅羅非魚TNF-α表達量顯著低于EX奧尼羅非魚和AX奧利亞羅非魚, 其余時間點EX奧尼羅非魚TNF-α表達量都顯著高于親本NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(圖 7A)。

3種羅非魚在感染后脾臟IL-1β的表達量都呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(P＜0.05), 且在感染后168hIL-1β的表達量都還顯著高于感染前水平(P＜0.05)。EX奧尼羅非魚IL-1β的表達量在感染后48h達到峰值, NE尼羅羅非魚IL-1β的表達量在感染后24—48h達到峰值, AX奧利亞羅非魚IL-1β的表達量在感染后72h達到峰值。感染后72—120h AX奧利亞羅非魚脾臟IL-1β表達量顯著高于其余2種羅非魚, 在其余時間點都是EX奧尼羅非魚IL-1β的表達量顯著高于親本NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05;圖 7B)。

3種羅非魚的脾臟IL-6的表達量在感染后都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 且都在感染后7h達到峰值,隨后逐步降低, 在感染后120h 恢復(fù)到感染前水平。感染前和感染后7—48h EX奧尼羅非魚的脾臟IL-6的表達量在感染前后都顯著高于親本NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 而在感染后72—168h的感染后期NE尼羅羅非魚的IL-6的表達量顯著低于EX奧尼羅非魚和AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖 7C)。

圖7 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后脾臟中TNF-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)相對表達量變化Fig. 7 Changes of relative expression of TNF-α (A), IL-1β (B)and IL-6 (C) in spleen of hybrid tilapia and its parents artificially infected with S. agalactiae

3 討論

3.1 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后累計死亡率差異分析

雖然在自然疾病暴發(fā)中幸存下來的魚被認為具有抵抗力, 但由于環(huán)境的不可控, 它們不適合用于評估抗病力。在大多數(shù)魚類育種中, 人工感染通常被用來評估抗病性。通過不同的方法感染實驗魚, 包括浸泡、同居挑戰(zhàn)和腹腔/肌肉注射[21,22]。雖然注射感染魚類在一定程度上繞過了先天免疫反應(yīng)(即皮膚和黏膜防御), 但注射感染已被用于評估魚類對許多細菌性病原體的抵抗力[23]。與無乳鏈球菌浸泡或同居挑戰(zhàn)通常會導(dǎo)致較低的死亡率和不一致的結(jié)果不同的是, 使用注射感染可確保每條魚都接受相同的病原菌劑量, 能獲得可重復(fù)性的試驗結(jié)果[13]。本實驗用無乳鏈球菌人工腹腔注射3種羅非魚后, EX奧尼羅非魚在各時間點的累積死亡率都顯著低于親本NE尼羅羅非魚和AX奧利亞羅非魚, 表明奧尼羅非魚對無乳鏈球菌的耐受力顯著強于親本尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚, 這與之前的研究結(jié)果一致[15], 再次證實了雜交育種途徑能顯著提高魚體的抗病力。

3.2 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血液生理指標(biāo)變化分析

對魚血液學(xué)參數(shù)的評估可作為監(jiān)測生理和病理變化的良好指標(biāo), 因為它提供了有關(guān)應(yīng)激、代謝異常、生殖功能障礙和疾病的基本信息[24]。白細胞具有吞噬功能, 可吞入并殺傷或降解病原體, 參與對炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)控。在本實驗中, 3種羅非魚在感染無乳鏈球菌后白細胞都顯著性升高。白細胞總數(shù)增加, 提示它們可能通過吞噬和產(chǎn)生抗菌蛋白來保護魚體免受入侵病原體的侵襲[25]。在本實驗中, 感染前EX奧尼羅非魚白細胞數(shù)最高, 感染120h后每組羅非魚之間沒有顯著性差異。有報道表明白細胞水平較高的物種將能夠比其他物種更有效地對抗感染, 因為白細胞計數(shù)和免疫反應(yīng)之間存在直接關(guān)聯(lián)[26]。這說明奧尼羅非魚比親本尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚更能有效對抗鏈球菌病感染。

紅細胞特性可能決定氧氣從呼吸系統(tǒng)到組織的運輸效率, 血紅蛋白和紅細胞計數(shù)等紅細胞值是氧化狀態(tài)的一個很好的指示器[24]。紅細胞壓積是檢查貧血狀況以及與營養(yǎng)、疾病和應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)的魚類健康的可靠指標(biāo)[26]。在本實驗中, 3種羅非魚感染無乳鏈球菌后紅細胞數(shù)和紅細胞壓積都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢, 血紅蛋白含量顯著性下降,在感染120h后降到最低值。Zhou等[27]也研究發(fā)現(xiàn)無乳鏈球菌高毒力株 HN016能顯著降低羅非魚紅細胞和紅細胞壓積的含量。紅細胞壓積和血紅蛋白降低可能是因為病原菌感染后造血器官的破壞而導(dǎo)致的失血[28]。感染前EX奧尼羅非魚紅細胞數(shù)和紅細胞壓積最高, EX奧尼羅非魚的紅細胞數(shù)和血紅蛋白含量在感染前后都更接近AX奧利亞羅非魚, 表明奧尼羅非魚運輸氧氣的效率更高, 雜交子一代奧尼羅非魚的血液生理指標(biāo)與父本奧利亞羅非魚更為接近。

3.3 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后血清生化指標(biāo)變化分析

血清總蛋白濃度是魚類健康、應(yīng)激和營養(yǎng)狀況的臨床指標(biāo)[26]。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染降低了鯰(Silurus asotus)[28]和尼羅羅非魚[29]體內(nèi)的總蛋白濃度。Zhou等[27]研究表明無乳鏈球菌高毒力株 HN016能顯著升高羅非魚總蛋白、白蛋白和球蛋白的含量。在本實驗中, 3種羅非魚感染后總蛋白均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢, 和之前報道尼羅羅非魚中的變化趨勢一致[30]。血糖是魚類的一個主要應(yīng)激指標(biāo), 當(dāng)魚類面對不同的應(yīng)激源時, 血糖會通過刺激碳水化合物代謝而增加[31]。在遲緩愛德華氏菌感染后, 尼羅羅非魚[29]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[31]中的葡萄糖水平明顯升高。在本實驗中, 奧尼羅非魚和尼羅羅非魚的葡萄糖在感染后都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 進一步證實了細菌感染初期對魚體生理條件產(chǎn)生嚴(yán)重影響,然后逐漸恢復(fù)到正常水平, 這和Mao等[32]的研究結(jié)果一致。在本實驗中, 感染前3種羅非魚的葡萄糖沒有顯著性差異, 感染后EX奧尼羅非魚的葡萄糖顯著高于其他兩組, 說明奧尼羅非魚在感染細菌后的糖原動員分解能力更強, 維持魚體抵抗病原菌的能量消耗需要。

能量代謝產(chǎn)物水平是魚類的重要健康參數(shù)[33]。甘油三酯通常作為肝功能指標(biāo)[34], 總膽固醇水平可指示魚體營養(yǎng)狀態(tài), 肝臟脂質(zhì)和脂蛋白代謝的功能障礙[35]。在加州鱸(Micropterus salmoides)患白云病[36], 吉富羅非魚、新吉富羅非魚和埃及尼羅羅非魚感染海豚鏈球菌(S. iniae)[37], 奧尼羅非魚感染無乳鏈球菌[16]后, 血清甘油三酯和膽固醇的水平都顯著下降了。這與本試驗結(jié)論相似, 說明無乳鏈球菌感染后引起羅非魚營養(yǎng)不良, 肝功能和脂代謝障礙。Kim等[31]研究發(fā)現(xiàn), 與血漿膽固醇水平較高的魚相比, 血漿膽固醇水平較低的魚對疾病的抵抗力較低。在本實驗中, 尼羅羅非魚的總膽固醇在感染前后都最低, 說明3種羅非魚中尼羅羅非魚抗病力最低, 這與攻毒感染后尼羅羅非魚累計死亡率最大的結(jié)果相一致。

溶菌酶是體液免疫中產(chǎn)生的一種抗菌酶, 是魚類天然免疫的重要參數(shù)[38]。具有較高溶菌酶活性的鯉魚家系對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染表現(xiàn)出更強的抵抗力[39]。我們之前研究也表明溶菌酶水平和羅非魚抗鏈球菌病能力呈一定的正相關(guān)[15]。在本研究中, 3種羅非魚的溶菌酶感染后都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 感染前、感染后72h和120h EX奧尼羅非魚的溶菌酶都顯著高于親本。白細胞產(chǎn)生的呼吸暴發(fā)在吞噬過程中攻擊入侵的病原體, 可作為評估魚類對病原體的防御能力的重要指標(biāo)[40,41]。細鱗鯧(Piaractus mesopotamicus)感染嗜水氣單胞菌后白細胞呼吸暴發(fā)活性增強[42], 而在本研究中, 3種羅非魚在感染無乳鏈球菌后都顯示呼吸暴發(fā)抑制, 類似情況也在感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)[43]和海豚鏈球菌[44]的魚類巨噬細胞中發(fā)現(xiàn), 這一事實可能是這些病原菌的致病機制之一。它們不僅通過抑制呼吸暴發(fā), 而且通過抑制凋亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶誘導(dǎo)吞噬細胞存活來逃避宿主的免疫反應(yīng), 有助于其在宿主中的傳播和生長[43,45]。在本實驗中, 感染后1周內(nèi)3種羅非魚呼吸暴發(fā)活性都抑制, 而Huang等[46]研究表明奧尼羅非魚、新吉富羅非魚(O. niloticus ♀×O. ni-loticus♂)和吉奧羅非魚(NEW GIFT ♀×O. aureus♂) 感染無乳鏈球菌后2周和4周時呼吸暴發(fā)都顯著升高, 這種看似矛盾的結(jié)果也在遲緩愛德華氏菌的巨鯰(Pangasius pangasius)中發(fā)現(xiàn), 其呼吸暴發(fā)活性在感染后5d時顯著降低, 但在感染后10d時顯著升高[47]。雖然感染前EX奧尼羅非魚呼吸暴發(fā)活性最低, 但感染后7—72h 則是EX奧尼羅非魚最高。Huang等[46]也研究表明奧尼羅非魚在攻毒后第4周的NBT活性明顯高于新吉富羅非魚和吉奧羅非魚, 說明奧尼羅非魚對病原菌的侵染具有更強的防御能力。

3.4 奧尼羅非魚及親本群體感染無乳鏈球菌后脾臟中促炎性細胞因子的變化分析

魚類主要依靠先天免疫來抵御疾病, 脾臟是硬骨魚的重要免疫器官, 也是無乳鏈球菌感染羅非魚的主要靶器官[48]。在受到細菌侵襲時, 細胞因子及其系列效應(yīng)分子能夠誘導(dǎo)特定白細胞的富集并激活其抗菌途徑[49]。在無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚后, 頭腎和脾臟的IL-6表達均顯著上調(diào), 并在6h達到高峰, Wei等[50]研究表明IL-6可能參與了尼羅羅非魚抵抗細菌感染的宿主防御和促進抗體的產(chǎn)生。弗蘭西斯菌(Francisella)感染羅非魚后24h,TNF-α和IL-1β的表達明顯增強, 并持續(xù)至96h[51]。在本實驗中, 3種羅非魚在感染后脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達量都顯著上升, 3種羅非魚的TNF-α和IL-6在感染后7h達到峰值, 奧尼羅非魚IL-1β在感染后48h達到峰值, 尼羅羅非魚IL-1β在感染后24—48h達到峰值, 奧利亞羅非魚IL-1β在感染后72h達到峰值。這些促炎性細胞因子通過促進吞噬、凋亡、淋巴細胞激活和白細胞的遷移, 在對細菌感染的即時和早期反應(yīng)中對病原菌起到防御作用, 是宿主防御機制的重要組成部分[50—53]。

此外, Dong等[54]研究表明無乳鏈球菌感染誘導(dǎo)免疫組織產(chǎn)生抗炎細胞因子來抑制宿主免疫反應(yīng),從而使魚體逃避無乳鏈球菌攻擊引起感染。在本實驗中, EX奧尼羅非魚在感染前后TNF-α和IL-6表達量都最高,IL-1β在感染前和感染后7—48h表達量都顯著高于親本, 但感染后120h 表達量最低。奧尼羅非魚的促炎性細胞因子在感染前后表達水平較高, 表明其啟動和調(diào)節(jié)免疫功能的能力較強, 后期卻能更好地控制炎癥反應(yīng)。結(jié)合攻毒后累計死亡率最低的結(jié)果, 可以推斷奧尼羅非魚的免疫應(yīng)答比親本更活躍, 表現(xiàn)出抗病力雜種優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本研究比較分析了雜交種EX奧尼羅非魚及其親本群體NE尼羅羅非魚、AX奧利亞羅非魚對無乳鏈球菌人工感染后的累積死亡率差異, 血液生理生化響應(yīng)和脾臟中促炎性細胞因子表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)奧尼羅非魚的累積死亡率顯著低于親本, 證實了雜交育種途徑能顯著提高魚體的抗病力。感染前奧尼羅非魚白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)和紅細胞壓積最高, 感染后3種羅非魚的白細胞都顯著性升高;紅細胞數(shù)、紅細胞壓積和血紅蛋白顯著性下降, 呼吸暴發(fā)抑制; 其血液生理指標(biāo)與父本奧利亞羅非魚更為接近。奧尼羅非魚在感染細菌后的血糖、溶菌酶水平和呼吸暴發(fā)更強, 對病原體的侵染具有更強的防御能力。定量PCR分析表明3種羅非魚的促炎性細胞因子都顯著升高, 可能參與了宿主對細菌感染的防御, 但奧尼羅非魚的促炎性細胞因子在感染后表達水平較高, 推斷奧尼羅非魚的免疫應(yīng)答比親本更活躍, 表現(xiàn)出抗病力雜種優(yōu)勢。然而, 雜種優(yōu)勢的分子基礎(chǔ)是復(fù)雜的, 雜種優(yōu)勢起源于親本和雜種基因型之間的遺傳密碼差異, 下一代基因組測序、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)等手段有助于我們?nèi)胬斫怆s種優(yōu)勢現(xiàn)象, 應(yīng)該在今后的奧尼羅非魚雜種優(yōu)勢研究工作中加以應(yīng)用。