朱昊俊 強(qiáng) 俊 徐鋼春 陶易凡 包景文 徐 跑

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214128; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214081)

水環(huán)境內(nèi)的微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用, 如污染物降解、氨氮循環(huán)和水體凈化等。同時(shí), 魚類腸道中棲息著眾多微生物, 維持著腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1]。健康個(gè)體腸道微生物的組成保持相對(duì)恒定, 同時(shí)又具有個(gè)體差異, 它們可以參與機(jī)體的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和氨基酸等代謝過程[2]。腸道菌群對(duì)宿主的營養(yǎng)、生理和免疫均有不同程度的影響, 不同的養(yǎng)殖模式和水體環(huán)境會(huì)顯著改變養(yǎng)殖動(dòng)物的健康及腸道微生物結(jié)構(gòu)[3,4]。目前對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康相關(guān)研究越來越全面和豐富, 已經(jīng)從最初的腸道形態(tài)學(xué), 逐步發(fā)展到腸道微生物平衡和魚類腸道健康相關(guān)機(jī)制的探索。

稻漁綜合種養(yǎng)模式是在我國傳統(tǒng)稻田養(yǎng)魚基礎(chǔ)上利用互利共生的原則, 建立起多物種共棲, 多層次利用的一種新型農(nóng)業(yè)模式[5,6]。自2012年第一次提出“稻漁種養(yǎng)”概念以來, 得到了各方的充分認(rèn)可, 在全國范圍內(nèi)大力推廣, 已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)亮點(diǎn)。稻漁綜合種養(yǎng)模式是以種糧為主,養(yǎng)殖為輔, 稻田內(nèi)增加水產(chǎn)品養(yǎng)殖不破壞稻田的耕作層, 因此水稻的產(chǎn)量不會(huì)減產(chǎn), 甚至有些條件下可以增產(chǎn); 與此同時(shí), 稻漁綜合種養(yǎng)模式可以降低農(nóng)藥和化肥的施用, 收獲的有機(jī)水稻和水產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效率良好, 可以大幅度提升農(nóng)戶收益[7]。在生產(chǎn)實(shí)踐中, 根據(jù)各地氣候、地質(zhì)和當(dāng)?shù)叵M(fèi)環(huán)境等因素,可以采用中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、小龍蝦(Procambarus clarkii)、中華鱉(Pelodiscus sinensis)和泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)等多種水產(chǎn)品。

位于云南紅河縣的哈尼梯田歷史悠遠(yuǎn), 但是迫于現(xiàn)實(shí)環(huán)境, 可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)峻考驗(yàn)。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心在哈尼梯田試驗(yàn)了水稻-黃顙魚的“稻漁共作”綜合種養(yǎng)模式。黃顙魚是我國一種優(yōu)質(zhì)的淡水養(yǎng)殖品種, 黃顙魚肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富, 且無肌間刺, 深受消費(fèi)者的好評(píng)[8]。梯田內(nèi)餌料資源豐富, 無需額外投入餌料, 收獲的黃顙魚深受消費(fèi)者喜愛, 豐富當(dāng)?shù)亍安嘶@子”的同時(shí)經(jīng)濟(jì)效率顯著, 是實(shí)施精準(zhǔn)扶貧的有力舉措[9]。

目前關(guān)于綜合種養(yǎng)的研究主要是集中在生態(tài)學(xué)及環(huán)境學(xué)方面(土壤理化性質(zhì)和溫室氣體排放等), 對(duì)于稻田內(nèi)微生物多樣性方面的研究較少[10—12]。新一代測序技術(shù)的發(fā)展使得我們可以有效的對(duì)微生物進(jìn)行宏觀分析, 其結(jié)果改變了對(duì)微生物群落和其生態(tài)位之間相互作用的認(rèn)識(shí)[13—15]。這些研究充分肯定了動(dòng)物腸道內(nèi)微生物種群和功能的多樣性。在本次研究中, 采用高通量測序技術(shù)(16S rDNA)對(duì)稻-魚共作綜合種養(yǎng)模式和傳統(tǒng)池養(yǎng)養(yǎng)殖模式下黃顙魚腸道微生物組成進(jìn)行比較, 探究不同養(yǎng)殖模式對(duì)黃顙魚腸道微生物多樣性和組成方面的影響,以期為水稻-黃顙魚這種新型稻漁綜合種養(yǎng)模式提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)選擇

本次試驗(yàn)選取的試驗(yàn)田位于紅河縣(云南省紅河哈尼族自治州), 坐標(biāo)是: 東經(jīng)102°23′54″, 北緯23°17′52″, 海拔634 m(圖 1)。梯田依山而建, 年平均氣溫22℃左右, 梯田的水源為山上不斷滲出的微流水。

圖1 采樣地點(diǎn)圖Fig. 1 Location of sampling sites

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取一塊約800 m2的梯田作為稻-魚共作組(DY組), 由于受當(dāng)?shù)丨h(huán)境限制, 在同一海拔附近較難找到一處面積相似的池塘作為對(duì)照組, 故而在海拔接近、水源來源一致的地方選擇一個(gè)面積為200 m2池塘作為池塘組(CT組)。水稻進(jìn)行移栽(株間距為20cm, 品種為“紫谷”)后, 于5月15日在梯田內(nèi)投入約雜交黃顙魚(Tachysurus fulvidraco♀×Pseudobagrus vachellii♂)苗400尾(梯田內(nèi)魚苗密度為0.5尾/m2), 雜交黃顙魚平均體重為(16.1±1.0) g,同一時(shí)間以同樣的密度在池塘內(nèi)投放相同規(guī)格的雜交黃顙魚苗。雜交黃顙魚苗是由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心和廣東五龍崗水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司共同繁育的雜交黃顙魚。

1.3 樣品采集

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間水稻田內(nèi)不施用農(nóng)藥和化肥,稻田內(nèi)蓄水高度維持在5—10 cm。定期巡田, 檢查水位情況。整個(gè)養(yǎng)殖周期內(nèi)DY組不單獨(dú)投喂飼料,池塘組每日投喂商品顆粒飼料1次。8月23日, 在進(jìn)行水稻收割前進(jìn)行采樣, 養(yǎng)殖周期為100d。在CT組和DY組隨機(jī)各選取黃顙魚12尾, 解剖采集腸道樣本(肛門前5 cm左右), 液氮冷凍保存, 用于提取總DNA。采樣時(shí)DY組和CT組黃顙魚平均體重為(52.2±3.6) g和(55.8±2.5) g。

1.4 總DNA提取和16S rDNA測序

取腸道樣本(-80℃冰箱凍存)放置在冰塊上解凍, 放入研缽后加入液氮研磨至粉末, 使用預(yù)先冷凍處理的2 mL離心管, 稱量100 mg左右樣本進(jìn)行總DNA提取。所有樣品使用TIANGEN糞便提取試劑盒(DP328)提取腸道微生物總DNA, 操作根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行, 提取完畢后使用NanoDrop Lite微量核酸檢測儀進(jìn)行濃度測定, 使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。PCR擴(kuò)增采用高保真DNA聚合酶, 擴(kuò)增產(chǎn)物能真實(shí)反映細(xì)菌的原始序列情況,并保證同一批樣本的擴(kuò)增條件一致。采用的16S rDNA引物如下, 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′;805R: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。

PCR擴(kuò)增程序: 98℃預(yù)變性30s; 32次循環(huán)(98℃變性10s, 54℃退火30s, 72℃延伸45s); 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,對(duì)目標(biāo)片段使用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒進(jìn)行回收。純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在 Qbit 熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫進(jìn)行定量, 合格的文庫濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。將合格的上機(jī)測序文庫(Index 序列不可重復(fù))梯度稀釋后, 根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合,并經(jīng)NaOH 變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序, 使用NovaSeq測序儀進(jìn)行2×250 bp的雙端測序。采用杭州聯(lián)川生物有限公司的NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

樣品在IlluminaNovaSeq平臺(tái)上按照制造商的建議進(jìn)行測序, 根據(jù)雙端序列的重疊區(qū), 根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼, 將配對(duì)端序列分配給樣品, 并將建庫引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端讀取。根據(jù)Fqtrim(v0.94)在特定的過濾條件下對(duì)原始讀數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾, 以獲得高質(zhì)量的clean標(biāo)簽。使用Vsearch(v2.3.4)軟件對(duì)嵌合序列進(jìn)行過濾。使用DADA2 進(jìn)行解調(diào), 得到特征表和特征序列。Alpha多樣性和Beta多樣性通過歸一化到相同的隨機(jī)序列進(jìn)行計(jì)算。然后根據(jù)SILVA(release132)分類器, 利用每個(gè)樣本的相對(duì)豐度對(duì)特征豐度進(jìn)行歸一化。Alpha多樣性用于分析樣本物種多樣性的復(fù)雜性, 通過4個(gè)指標(biāo), 包括Chao1、Observed_Feature、Shannon和Simpson, 這些指標(biāo)都是用QIIME2計(jì)算出來的, 顯著性檢驗(yàn)使用t檢驗(yàn)(Student’sttest)。Beta多樣性由QIIME2計(jì)算, R(v3.5.2)包繪制。采用Blast進(jìn)行序列比對(duì), 每個(gè)代表性序列用SILVA數(shù)據(jù)庫對(duì)特征序列進(jìn)行注釋。主坐標(biāo)分析(PCoA)分析使用QIIME2進(jìn)行, 顯著性檢驗(yàn)采用ADONIS檢驗(yàn)。用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)確定了樣品間α-多樣性和相對(duì)豐度差異的顯著性。顯著差異腸道菌群的篩選使用LefSe分析, 設(shè)定P＜0.05, LDA值＞3。利用Bugbase 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)菌表型預(yù)測, 并進(jìn)行組間差異分析[16]。在各顯著性檢驗(yàn)中, 顯著差異P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本質(zhì)量評(píng)估

經(jīng)過質(zhì)量控制后, 24個(gè)樣本總共獲得合格的16S rDNA序列2008079條, 平均每個(gè)樣本有效序列數(shù)量為83670條。通過過濾、去重和嵌合體過濾等方式修正錯(cuò)誤, 共獲得1825個(gè)feature, 其中2個(gè)處理共有feature數(shù)量為392個(gè), 歸屬于25個(gè)門、57綱、140個(gè)目、257個(gè)科、545個(gè)屬和838個(gè)種。根據(jù)稀釋度曲線可知(圖 2), 曲線逐漸趨于平緩, 測序所得數(shù)據(jù)可以覆蓋樣本絕大多數(shù)物種, 測序數(shù)據(jù)適合進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

圖2 樣本稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves and estimators of different samples

2.2 不同養(yǎng)殖模式對(duì)腸道微生物Alpha多樣性的影響

Alpha多樣性是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性, 主要用來反映物種豐富度和均勻度(圖 3)。結(jié)果顯示, CT組的辛普森指數(shù)(Simpson)和香農(nóng)—威納指數(shù)(Shannon)顯著低于DY組(P＜0.05), 而Chao1和Observed_feature指數(shù)沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖3 不同養(yǎng)殖模式腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)Fig. 3 Alpha diversity under different culture modes

2.3 不同養(yǎng)殖模式對(duì)腸道微生物Beta多樣性的影響

主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis, PCoA)是將進(jìn)化結(jié)構(gòu)中相近的物種聚類在一起, 樣本間距離越近, 說明樣本之間的微生物結(jié)構(gòu)越相似。對(duì)不同養(yǎng)殖模式的24個(gè)樣本的PCoA分析如圖 4所示。在同一養(yǎng)殖模式下各樣本聚集, 不同養(yǎng)殖模式樣本間明顯區(qū)分, 表明不同養(yǎng)殖模式下黃顙魚腸道微生物結(jié)構(gòu)具有明顯不同, 基于Unweighted_UniFrac和Weighted_UniFrac的結(jié)果均具有顯著差異性(P＜0.05)。

圖4 不同養(yǎng)殖模式腸道微生物PCoA分析Fig. 4 Principal coordinates analysis of intestinal microbiota in different culture modes

2.4 不同養(yǎng)殖模式對(duì)腸道微生物組成和相對(duì)豐度的影響

為了確定與不同養(yǎng)殖模式相關(guān)的feature, 進(jìn)行差異feature分析。通過韋恩圖(圖 5)可知, CT組和DY組共享的feature有392個(gè), 占總feature的21.5%,而2個(gè)不同養(yǎng)殖模式特有的feature數(shù)量基本相當(dāng),分別為750個(gè)(41.1%)和683(37.4%)。同時(shí), 采用曼哈頓圖來展示相較于DY組, CT組內(nèi)顯著富集或者顯著降低的feature(圖 6)。結(jié)果顯示, 相較于DY組,CT組顯著下降的feature數(shù)量要明顯多于顯著富集的feature(120vs. 32)。同時(shí), 差異feature主要集中在厚壁菌門(Firmicutes), 其次是變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes), 且梭桿菌門(Fusobacteria)只有顯著下降的feature。

圖5 不同養(yǎng)殖模式下feature韋恩圖展示Fig. 5 Venn diagram showing feature in CT vs.DY yellow catfish

圖6 不同養(yǎng)殖模式下差異feature曼哈頓圖展示Fig. 6 Manhattan plots showing enriched and depleted feature in CT vs. DY yellow catfish

對(duì)樣本中平均相對(duì)豐度大于1%的feature進(jìn)行相對(duì)豐度和差異分析(圖 7)。在門水平上(圖 7a),不同養(yǎng)殖模式下優(yōu)勢(shì)菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和梭桿菌門(Fusobacteria), 4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門占比均大于98%。而根據(jù)圖 7b可知, 變形菌門(64.8%vs. 31.2%), 厚壁菌門(10.7%vs. 36.7%)和擬桿菌門(12.5%vs. 20.2%)在不同養(yǎng)殖模式下相對(duì)豐度存在顯著差異(P＜0.05), 而梭桿菌門(10.8%vs. 10.4%)則沒有顯著差異(P＞0.05)。在屬水平上(圖 7c), 相對(duì)豐度大于1%的屬有18個(gè), 具體為: 檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、醋酸桿菌屬(Cetobacterium)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、巴恩斯氏菌科_未鑒定(Barnesiellaceae_unclassified)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、Romboutsia屬、無色桿菌屬(Achromobacter)、Paludibacter屬、Epulopiscium屬、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、Turicibacter屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、乳球菌屬(Lactococcus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)。經(jīng)差異分析(圖 7d)和LEfSe分析可以發(fā)現(xiàn)(圖 7e),CT組中顯著富集的屬主要是變形菌門, 而DY組顯著富集的屬主要是厚壁菌門和擬桿菌門。18個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬中6個(gè)屬存在顯著差異(P＜0.05), 具體為顯著富集于CT組的鄰單胞菌屬(14.8%vs. 2.3%)和顯著富集于DY組的梭狀芽孢桿菌屬(1.2%vs. 12.8%)、Romboutsia屬(0.5%vs. 12.5%)、Paludibacter屬(1.2%vs. 7.4%)、Epulopiscium屬(1.3%vs. 4.5%)、擬桿菌屬(0.4%vs. 4.6%)。

圖7 不同養(yǎng)殖模式下腸道微生物的優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度和差異分析Fig. 7 Relative abundance and difference analysis of feature identified in CT vs. DY yellow catfish

為進(jìn)一步了解不同養(yǎng)殖模式下腸道微生物菌群的差異性變化, 我們對(duì)細(xì)菌表型進(jìn)行分析, 使用BugBase算法來對(duì)細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測, 探究不同的養(yǎng)殖模式是否會(huì)對(duì)腸道微生物種群的功能和表型產(chǎn)生影響。BugBase表型預(yù)測分析了7種表型特征(圖 8), 包括好養(yǎng)(Aerobic)、厭氧(Anaerobic)、兼性厭氧(Facultatively_Anaerobic)、革蘭氏陰性(Gram_Positive)、革蘭氏陽性(Gram_Negative)、生物膜形成(Forms_Biofilms)和潛在致病性(Potentially_Pathogenic)。CT組相較于DY組革蘭氏陰性菌豐度顯著增加, 而革蘭氏陽性菌豐度顯著減少。在氧氣需求方面, 好養(yǎng)菌豐度沒有顯著差異, CT組在厭氧菌方面豐度顯著低于DY組, 而兼性厭氧菌豐度則顯著升高。同時(shí), CT組在表型方面具有更高的生物膜形成能力和潛在致病性。

圖8 BugBase預(yù)測得到的不同養(yǎng)殖模式下腸道菌群表型分析Fig. 8 Phenotype analysis of intestinal microflora in CT vs. DY yellow catfish predicted by BugBase

3 討論

腸道微生物在宿主體內(nèi)的定植與穩(wěn)態(tài)對(duì)宿主具有重要意義, 其對(duì)宿主的營養(yǎng)代謝、免疫應(yīng)答、疾病狀態(tài)甚至行為均會(huì)產(chǎn)生影響[17—20]。腸道微生物來源于環(huán)境, 同時(shí)受遺傳背景和食物等因素的影響, 其與宿主之間的關(guān)系現(xiàn)在越來越受研究者們的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)不同的養(yǎng)殖模式可以顯著地改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。

3.1 Alpha多樣性和 Beta多樣性分析

Alpha多樣性和Beta多樣性是評(píng)估群落結(jié)構(gòu)組織化水平的重要參數(shù)[21]。Alpha多樣性是反應(yīng)腸道微生物豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。Chao1和Observed_feature指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度, 數(shù)值越高表明群落的豐富度越好; 辛普森指數(shù)(Simpson), 香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon)主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度, 辛普森指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)數(shù)值越大, 表明群落的均勻度越高。CT組在物種豐富度上略低于DY組, 但是沒有顯著差異, 從韋恩圖上也可以看出CT組和DY組共有392個(gè)共享feature, 而專有feature的數(shù)量基本一致; 相對(duì)的,CT組的辛普森指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)顯著低于DY組, CT組在物種均勻度方面要顯著低于DY組。通過曼哈頓圖可知相較于DY組, CT組擁有120個(gè)相對(duì)豐度顯著下降的feature, 顯著上升的數(shù)量僅為32個(gè), CT組腸道微生物相對(duì)豐度集中于更少的幾個(gè)優(yōu)勢(shì)feature。不同養(yǎng)殖模式對(duì)腸道微生物的豐富度影響較小, 但會(huì)顯著影響其均勻度。Beta多樣性是通過算法將各樣本序列的進(jìn)化關(guān)系和豐度信息轉(zhuǎn)換為樣本間距離, 直觀反映樣本組間的群落差異[21]。本研究中不同養(yǎng)殖模式下的2個(gè)處理組被明顯分為2個(gè)亞群, 且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相較于傳統(tǒng)的池塘養(yǎng)殖模式, DY組稻漁共作養(yǎng)殖模式是一種水稻和水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物互利共作復(fù)合生態(tài)模式, 更加有利于營養(yǎng)的轉(zhuǎn)移、能量的代謝, 其具有更良好的生態(tài)效應(yīng)[22,23]。

養(yǎng)殖對(duì)象的生產(chǎn)性能與養(yǎng)殖環(huán)境(土壤和水體)之間的關(guān)系密不可分。通過對(duì)稻鱉共作的研究發(fā)現(xiàn)共作組的水稻稻谷、秸稈和中華鱉產(chǎn)量均高于單作組, 共作組擁有更好的水環(huán)境, 促進(jìn)中華鱉餌料利用率, 有利于其生長發(fā)育, 而中華鱉的加入可以抑制田間雜草的生長(與水稻營養(yǎng)性競爭)[24]。在稻漁共作模式下黃顙魚腸道微生物多樣性上升,特別是均勻度顯著提升, 可能與稻漁共作模式下良好的生態(tài)效應(yīng)有關(guān)(有利于營養(yǎng)的轉(zhuǎn)移和能量的代謝)。腸道微生物多樣性與機(jī)體的健康密切相關(guān)[25]。腸道微生物多樣性的降低可能會(huì)成為多種疾病的誘因, 例如炎癥性腸病等[25]。相關(guān)研究也證實(shí), 在無菌條件下飼喂的動(dòng)物腸道組織發(fā)育不良, 血管、營養(yǎng)和內(nèi)分泌功能受到損害, 與正常環(huán)境下飼喂的動(dòng)物相比胃腸道免疫功能較弱, 疾病抵抗力更弱[26,27]。我們認(rèn)為稻漁共作養(yǎng)殖模式可以給黃顙魚提供一個(gè)更優(yōu)良的生長環(huán)境, 其均勻度更高的腸道微生物也更有利于其生長和對(duì)疾病的抵抗。

3.2 腸道微生物組成和相對(duì)豐度分析

在門水平上, 變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和梭桿菌門(Fusobacteria)占到相對(duì)豐度的98%以上, 同時(shí)2個(gè)養(yǎng)殖模式的優(yōu)勢(shì)菌門種類一致。有研究指出黃顙魚腸道優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門[28,29]。同時(shí)在草魚(Ctenopharyngodon idella)和羅非魚(Oreochromis niloticus)等魚類的研究結(jié)果也得出一致的結(jié)論[30—32]。這些研究結(jié)果和本試驗(yàn)得到的結(jié)果相一致。雖然不同的養(yǎng)殖模式?jīng)]有改變黃顙魚優(yōu)勢(shì)菌門的種類, 但是會(huì)響其相對(duì)豐度, CT組的第一優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門, 相對(duì)豐度為64.8%, 顯著高于DY組的31.2%。而DY組的第一優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門, 相對(duì)豐度為36.7%, 顯著高于CT組的10.7%; 第三優(yōu)勢(shì)菌門的擬桿菌門相對(duì)豐度20.2%, 也顯著高于CT組的12.5%。而梭桿菌門在相對(duì)豐度上沒有差異。導(dǎo)致相對(duì)豐度改變的原因可能是2種養(yǎng)殖模式下不同的水體環(huán)境和餌料來源等外在因素綜合作用的結(jié)果。

研究報(bào)道指出, 變形菌門豐度的提高可能是腸道菌群失衡的一個(gè)重要標(biāo)志[33]。變形菌門是細(xì)菌中最大的一個(gè)門, 同時(shí)其也包含了大量的病原菌。通過LEfSe分析可知, γ-變形菌綱領(lǐng)單胞菌屬在CT組顯著富集。沙門氏菌屬(Salmonella)(腸炎和傷寒)、耶爾辛氏菌屬(Yersinia)(鼠疫)、弧菌屬(Vibrio)(霍亂)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等大量致病菌均屬于γ-變形菌綱。有研究發(fā)現(xiàn)在患病的水生動(dòng)物體內(nèi)γ-變形菌綱豐度顯著升高[34,35]。鄰單胞菌屬1種典型的條件致病菌, 常見于魚類、水生動(dòng)物和各種哺乳動(dòng)物消化道內(nèi), 與腹瀉和食物中毒相關(guān)[36]。我們猜測CT組黃顙魚腸道內(nèi)機(jī)會(huì)致病菌的相對(duì)豐度可能更高, 受到環(huán)境應(yīng)激等導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境紊亂時(shí), 機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力相對(duì)更弱。

膳食纖維在腸道內(nèi)通過發(fā)酵作用會(huì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA), 有研究證實(shí)腸道內(nèi)高SCFA水平與機(jī)體的肥胖相關(guān)[37]。在腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門在腸道內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生以丁酸鹽和丙酸鹽為主的SCFA, 厚壁菌門和擬桿菌門的比例被部分研究者認(rèn)為可以表現(xiàn)人類和其余動(dòng)物的肥胖程度[38—40]。肥胖機(jī)體腸道內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度的比值(Firmicutes/Bacteroidetes, F/B比值)要更高[41]。厚壁菌門豐度的提高有利于從相同飲食中獲取更多能量。在我們的研究中, CT組和DY組的F/B比值分別為0.86和1.82。由于在稻漁共作養(yǎng)殖模式下均沒有投喂飼料, 我們推測黃顙魚可能是捕食養(yǎng)殖水體內(nèi)豐富的生物餌料, 為了最大效率地利用有限的食物源獲取更多能量, 黃顙魚腸道可能形成以厚壁菌門為主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)。

3.3 腸道微生物表型分析

越來越多的證據(jù)表明, 微生物群落的功能組成與環(huán)境因子密切相關(guān), 換而言之, 不同的生存環(huán)境會(huì)影起微生物群落功能的差異[42,43]。在研究腸道微生物群落組成的同時(shí), 嘗試使用BugBase揭示不同養(yǎng)殖模式下黃顙魚腸道微生物的功能輪廓。首先CT組和DY組的優(yōu)勢(shì)菌群均是革蘭氏陰性菌, 占到相對(duì)豐度的70%以上, 魚類腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群是革蘭氏陰性菌, 同時(shí)也存在革蘭氏陽性菌[44]。我們的研究結(jié)果也和這個(gè)結(jié)論相一致。但是我們發(fā)現(xiàn),DY組的第一優(yōu)勢(shì)菌門——革蘭氏陽性菌的厚壁菌門, 其大量繁殖形成優(yōu)勢(shì)導(dǎo)致DY組的革蘭氏陽性菌比例要顯著大于CT組。

從需氧性方面來看, CT組兼性厭氧菌豐富, 而DY組厭氧菌豐富, 在好氧菌方面則無顯著差異。腸道菌主要是由厭氧菌、兼性厭氧菌和好氧菌三大類組成, 其中厭氧菌的總數(shù)大于好氧菌2—3個(gè)數(shù)量級(jí)[45]。在一般情況下, 專性厭氧菌是優(yōu)勢(shì)菌群,厭氧菌和腸黏膜形成的生物保護(hù)膜是腸道抵御病原菌的第一道屏障[46]。CT組厭氧菌數(shù)量明顯低于DY組, 與此同時(shí)通過LefSe分析可知DY組厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度較高, 梭菌綱(Class Clostrida)和擬桿菌綱(Class Bacteroidia)富集, 而梭菌綱和擬桿菌綱都是典型的厭氧菌。顯著富集于CT組的腸桿菌目(Enterobacteriales)主要是兼性厭氧菌, 兼性厭氧菌多為條件致病菌, 在特定環(huán)境下, 會(huì)危害宿主的健康。

BugBase還預(yù)測CT組腸道微生物中存在潛在致病性, 生物膜形成能力細(xì)菌豐度更高。微生物生物膜是由微生物適應(yīng)生存環(huán)境附著于生物(非生物)表面, 被自身分泌的胞外聚合物包裹的高密度微生物群體, 形成生物膜后細(xì)菌具有較強(qiáng)的對(duì)抗生素能力, 對(duì)宿主免疫防御機(jī)制的抵抗力也會(huì)增強(qiáng), 生物膜也是細(xì)菌引起持續(xù)性感染的常見致病機(jī)制[47,48]。CT組黃顙魚腸道微生物不僅潛在致病性更高, 生物膜形成能力更強(qiáng), 側(cè)面反映出DY組黃顙魚腸道微生物相對(duì)而言更加健康, 稻漁共作養(yǎng)殖模式相較于傳統(tǒng)的池塘養(yǎng)殖, 為養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物提供了一個(gè)更為優(yōu)越的生存環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究從腸道微生物角度探究不同的養(yǎng)殖模式對(duì)雜交黃顙魚腸道微生物的影響, 不同的養(yǎng)殖模式會(huì)改變腸道微生物的組成(優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度), 會(huì)顯著影響黃顙魚腸道菌群均勻度, 但是沒有對(duì)其豐富度產(chǎn)生顯著影響。相較于池塘養(yǎng)殖模式, 在稻漁共作養(yǎng)殖模式下黃顙魚擁有更豐富的腸道微生物多樣性, 表型預(yù)測表明稻漁共作模式下潛在致病力和生物膜形成能力均要顯著低于池塘養(yǎng)殖?；谝陨辖Y(jié)果, 我們認(rèn)為稻漁共作模式可以給黃顙魚提供更為優(yōu)良的生存環(huán)境, 其腸道微生物抵御疾病的能力更強(qiáng)。