劉東升，劉婷婷，姚世霞，朱旭江*，張明童*，朱琳，蘇蕊

1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；

2.國家藥品監(jiān)督管理局 中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，甘肅 蘭州 730070

風濕關(guān)節(jié)炎片是由制馬錢子（調(diào)制粉）、麻黃、當歸、續(xù)斷、桃仁、紅花等17 味中藥制成的中藥制劑，具有祛風燥濕、活血止痛的功效，臨床上用于治療腰腿疼痛、風濕痹痛、風濕性關(guān)節(jié)炎等證。處方中馬錢子為調(diào)制粉入藥，占處方總量的28%，其有效成分為馬錢子堿和士的寧，兩者都是毒性成分。其中，士的寧毒性較強，且治療劑量和中毒劑量接近[1]，士的寧對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性較大，成人口服5～10 mg 就會出現(xiàn)中毒癥狀[2-6]。馬錢子堿用于毒殺嚙齒類動物和其他害蟲，可阻斷神經(jīng)肌肉傳導，呈現(xiàn)箭毒性[6-8]。風濕關(guān)節(jié)炎片現(xiàn)行標準為《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第三冊，標準中僅有性狀和常規(guī)檢查項，缺少專屬性指標成分的定性鑒別和定量測定方法，無法實現(xiàn)標準可控和質(zhì)量安全有效的目標。

本研究結(jié)合文獻報道的風濕關(guān)節(jié)炎片質(zhì)量評價方法[9-16]和《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）馬錢子、麻黃和當歸質(zhì)量標準項下的有關(guān)方法[17-19]，采用麻黃、當歸對照藥材和馬錢子堿、士的寧對照品為指標性成分，分別建立了相應的定性和定量檢測方法；并分別采用馬錢子總生物堿對照提取物和馬錢子堿、士的寧對照品測定樣品含量，探討馬錢子總生物堿對照提取物代替馬錢子堿、士的寧對照品的可行性；完善了風濕關(guān)節(jié)炎片的質(zhì)量標準，為提高其質(zhì)量控制方法提供了實驗數(shù)據(jù)，對保證其質(zhì)量具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（沃特世公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME204 型分析天平（梅特勒-托利多公司）；SAMPLER4 型薄層色譜點樣儀（卡瑪公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品鹽酸麻黃堿（批號：171241-201508，純度：99.8%）、馬錢子堿（批號：110706-200505，純度：97%）、士的寧（批號：110705-200306，純度：95.9%），馬錢子總生物堿對照提取物（批號：112030-201601，含 馬 錢 子 堿45.4%，士 的 寧49.9%）、麻黃對照藥材（批號：121051-201606）、當歸對照藥材（批號：120927-201516）均購于中國食品藥品檢定研究院；試劑均為色譜純；水為超純水。

馬錢子（調(diào)制粉）、麻黃、當歸、蒼術(shù)、續(xù)斷、桃仁、紅花、乳香（制）、沒藥（制）、千年健、地楓皮、羌活、地龍、桂枝、穿山甲（制）、木瓜、牛膝經(jīng)甘肅省藥品檢驗研究院中藏藥室馬瀟主任中藥師鑒定為正品，均符合《中國藥典》2020 年版（一部）項下規(guī)定。

風濕關(guān)節(jié)炎片為A（批號分別為20170201、20170202、20170203、20170301、20170401、0170402）、B（批號分別為20141101、20131102）、C（批號：20141001）和D（批號：20140101）4 家生產(chǎn)企業(yè)共10批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃的薄層色譜法（TLC）鑒別

取本品3 g，研細，分別加三氯甲烷20 mL，濃氨試液1 mL，振搖1 h，取離心后的上清液加鹽酸溶液（3→10）5 mL，振搖混勻，蒸干上層液，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取麻黃對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取鹽酸麻黃堿對照品，加三氯甲烷制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制備工藝，制備缺麻黃的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。依據(jù)《中國藥典》2020 年版（四部）TLC[20]試驗，分別吸取供試品及陰性樣品溶液各10 μL，其余各3 μL，點于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（40∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應位置上，均出現(xiàn)相同的特征斑點，且陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 麻黃TLC圖

2.2 當歸的TLC鑒別

取本品約2.4 g，研細，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，揮干乙醚液，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取當歸對照藥材1 g 和陰性樣品2.4 g（按處方比例及制備工藝，制備缺當歸的陰性樣品）照供試品溶液的制備方法，同法分別制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。依據(jù)《中國藥典》2020 年版（四部）TLC[20]試驗，分別吸取陰性和供試品溶液各10 μL，對照藥材溶液3 μL，點于同一硅膠G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上，均出現(xiàn)相同的特征斑點，且陰性樣品無干擾，見圖2。

圖2 當歸TLC圖

2.3 馬錢子含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為CAPCELL PAK C18MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀等量混合溶液（用磷酸調(diào)pH 2.8）（B），梯度洗脫（0～45 min，17%～20%A）；檢測波長為260 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。在上述條件下，陰性樣品、對照、馬錢子總生物堿對照提取物及樣品的HPLC 圖見圖3。

圖3 風濕關(guān)節(jié)炎片專屬性HPLC圖

2.3.2 溶液的制備 對照提取物溶液：精密稱取馬錢子總生物堿對照提取物23.60 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻線，搖勻，即得。

對照品溶液：分別精密稱取馬錢子堿和士的寧對照品12.81、16.02 mg 于100 mL 的量瓶中，加甲醇至刻線，搖勻，即得。

供試品溶液：取本品15 片，除去包衣，研細，取粉末約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，滴加5%氫氧化鈉溶液約8 mL，混勻，超聲處理（250 W，50 kHz）2 min。精密加入三氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量，置于70 ℃水浴加熱回流2 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補足減失質(zhì)量，充分振搖，濾過，精密吸取續(xù)濾液5 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液：按處方比例及制備工藝，制備缺馬錢子的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成不含馬錢子堿和士的寧的陰性樣品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取馬錢子總生物堿對照提取物溶液（馬錢子堿質(zhì)量濃度為0.106 2 mg·mL-1，士的寧質(zhì)量濃度為0.117 8 mg·mL-1）和對照品溶液（馬錢子堿質(zhì)量濃度為0.098 86 mg·mL-1，士的寧質(zhì)量濃度為0.124 30 mg·mL-1），按2.3.1 項下色譜條件分別進樣0.5、3.0、5.0、8.0、10.0、15.0 μL。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積A 為縱坐標（Y），進行回歸分析。

對照提取物：馬錢子堿及士的寧回歸方程分別為Y=1 841 826.94X-40 431.31（r=0.999 9）；Y=1 995 338.32X-50 076.73（r=0.999 9），表明馬錢子堿和士的寧分別在0.005 310～0.159 300、0.005 890～0.176 650 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

對照品：馬錢子堿及士的寧回歸方程分別為Y=108 123.41X-291.24（r=0.999 9）；Y=139 697.79X-171.65（r=0.999 9），表明馬錢子堿和士的寧分別在0.004 913～0.147 410、0.006 215～0.186 450 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 取同一批號（批號：20170201）的供試品溶液，按2.3.1 項下條件連續(xù)進樣，結(jié)果馬錢子堿和士的寧峰面積的RSD 分別為0.53%、1.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：20170201），在室溫下放置0、6、12、16、20、24 h后分別進樣，測定待測成分峰面積積分值。結(jié)果馬錢子堿和士的寧峰面積的RSD 分別為1.26%、2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗 精密稱取同一批（批號：20170201）的供試品6 份，平行測定峰面積積分值，計算馬錢子堿和士的寧含量的RSD 分別為2.12%、1.61%，表明本方法的重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 分別精密吸取2.3.2 項下對照提取物溶液和對照品溶液2 mL，各平行6 份，置12 個具塞錐形瓶中，氮氣吹干，再分別精密稱取已知含量的同一批樣品（批號：20170201）約1 g，加入上述錐形瓶中，按供試品溶液的制備方法同法處理，按2.3.1 項下色譜條件測定含量，計算加樣回收率，結(jié)果馬錢子堿平均回收率分別為103.20%、101.90%，RSD 分別為2.56%、1.85%；士的寧平均回收率為95.65%、97.27%，RSD 分別為1.90%、1.72%（表1），表明測定方法的回收率良好。

表1 風濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿、士的寧含量測定的加樣回收率試驗

2.4 樣品測定

按2.3.1 和2.3.2 項下方法測定10 批樣品中馬錢子堿和士的寧的含量，見表2。結(jié)果顯示，馬錢子總生物堿對照提取物和馬錢子堿對照品測得樣品中馬錢子堿含量分別為0.018 8～0.748 1、0.012 6～0.731 5 mg/片；馬錢子總生物堿對照提取物和士的寧對照品測得樣品中士的寧含量分別為0.034 9～0.813 1、0.038 9～0.795 9 mg/片。

表2 不同生產(chǎn)廠家風濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧的含量測定mg/片

3 討論

3.1 提取方法和時間考察

馬錢子含量測定中，分別考察超聲處理和加熱回流2 種提取方法。精密稱取樣品6 份各約2 g，置錐形瓶中，滴加5%氫氧化鈉溶液約4 mL，混勻，超聲處理2 min 后，精密加入三氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量后，分別超聲30、45、60 min或70 ℃水浴加熱回流1、2、3 h 后分別測定馬錢子堿和士的寧含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，釆用加熱回流提取效率更高、更完全，且70 ℃水浴加熱回流2 h 時已基本提取完全，所以采用70 ℃水浴加熱回流2 h的方法處理樣品。

3.2 色譜條件的確定

取士的寧和馬錢子堿對照品溶液，分別在190～400 nm 進行掃描，結(jié)果表明，士的寧在200.5、253.5 nm 均有吸收，馬錢子堿在195.8、264.2、299.8 nm 處均有紫外吸收。結(jié)合《中國藥典》2020年版（一部）馬錢子項下士的寧和馬錢子堿的測定方法，最后選定260 nm 為檢測波長。且在此檢測波長下對照品和樣品都能得到較好的圖譜。參考《中國藥典》2020年版馬錢子品種及有關(guān)文獻[3,5,19]，考察以乙腈為流動相A，以0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀等量混合溶液（用磷酸調(diào)pH 2.8）為流動相B，進行等度和梯度洗脫。對測定結(jié)果進一步分析發(fā)現(xiàn)，當采用上述流動相進行梯度洗脫時，得到較好的峰形和分離度。

3.3 限度規(guī)定

處方中馬錢子（調(diào)制粉）的量折算為55.9 mg/片，按此計算，士的寧應折算為0.642 9 mg/片（其中規(guī)定馬錢子（調(diào)制粉）制法為取制馬錢子，粉碎成細粉，照《中國藥典》2020 年版（一部）馬錢子〔含量測定〕項下的方法測定士的寧含量后，加適量淀粉，使其質(zhì)量分數(shù)為1.15%，混勻，即得）?！吨袊幍洹?020 年版（一部）馬錢子藥材士的寧質(zhì)量分數(shù)為1.20%～2.20%，并結(jié)合士的寧的不良反應和日口服量（士的寧為馬錢子的主要毒性成分，口服致死量為30 mg），暫定0.30～0.50 mg/片。風濕關(guān)節(jié)炎片口服量一次4 片，2 次/d。計算后1 d 口服馬錢子中士的寧最大量為4.0 mg，遠遠低于口服致死量。參考《中國藥典》2020 年版（一部）馬錢子和馬錢子粉項下含量，士的寧與馬錢子最低含量比約為1.5。結(jié)合10 批樣品中馬錢子堿含量測定結(jié)果。暫時規(guī)定馬錢子堿含量不低于0.30 mg/片。即本品每片含馬錢子以馬錢子堿（C23H26N2O4）計不得少于0.30 mg，以 士 的 寧（C21H22N2O2）計 應 為0.30～0.50 mg。待收集多批樣品積累數(shù)據(jù)后再修訂合適的含量限度。

4 結(jié)論

風濕關(guān)節(jié)炎片現(xiàn)行標準中僅有性狀和常規(guī)檢查項，不能有效控制藥品質(zhì)量，本研究依據(jù)《中國藥典》2020 年版完善了風濕關(guān)節(jié)炎片的質(zhì)量標準。根據(jù)《中國藥典》2020 年版（一部）藥材項下相關(guān)方法并結(jié)合文獻[6-11]，建立了麻黃和當歸的薄層方法，得到的薄層色譜圖斑點清晰，且陰性無干擾；參考《中國藥典》2020 年版（一部）馬錢子藥材項下含量測定的方法及相關(guān)文獻[7-8,19]，建立了風濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧的HPLC 含量測定方法。上述方法簡便、準確、重復性好，可為風濕關(guān)節(jié)炎片質(zhì)量控制提供參考。同時，本研究對采用馬錢子堿、士的寧對照品與馬錢子總生物堿對照提取物對測定風濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧的含量進行測定，通過SPSS 27 軟件，采用獨立樣本非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U 秩和檢驗），對分別選用對照品與對照提取物作為對照后測定結(jié)果進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，風濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧含量差異無統(tǒng)計學意義?？紤]到馬錢子堿和士的寧為嚴格管控的劇毒化學品，且單體對照的純度非常高，存在安全隱患，而馬錢子總生物堿對照提取物純度較低、安全性好、成本較低，更易獲得[4]。因此，馬錢子總生物堿對照提取物代替馬錢子堿、士的寧單體對照有較強的可行性。