王小芳，鄭倩倩，路麗娟

石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050011

杞菊地黃丸出自《麻疹全書》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典）2020 年版（一部），由枸杞子、菊花、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉8 味中藥組成，可用于治療肝腎不足、陰虛陽(yáng)浮、頭暈耳鳴、羞明流淚、視物昏花癥狀，臨床主要用于治療干眼癥、高血壓、高血脂、早期老年黃斑變性、慢性結(jié)腸炎、腦震蕩后遺癥等[1-5]。

中藥復(fù)方制劑是多成分協(xié)同發(fā)揮治療作用，僅檢測(cè)單一成分不能全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量，多組分評(píng)價(jià)模式已成為中藥質(zhì)量控制的一種發(fā)展趨勢(shì)。目前，關(guān)于杞菊地黃丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究更多的是關(guān)于莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量測(cè)定[6-10]，未檢索到對(duì)其他成分的含量測(cè)定和多組分質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）梯度洗脫，選取酒萸肉中莫諾苷、馬錢苷，牡丹皮中芍藥苷、丹皮酚，菊花中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釣闄z測(cè)目標(biāo)成分，對(duì)杞菊地黃丸中7 個(gè)成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ARC 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；CPA225D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Elmasonic P 型超聲波清洗儀（德國(guó)Elma 公司）；DK-98-Ⅱ型水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品芍藥苷（批號(hào)：110736-201640，純度：95.2%）、莫諾苷（批號(hào)：111998-201602，純度：96.3%）、馬錢苷（批號(hào)：111640-201707，純度：99.2%）、丹皮酚（批號(hào)：110708-201407，純度：100%）、綠原酸（批號(hào)：110753-201716，純度：99.3%）、木犀草苷（批號(hào)：111720-201408，純度：94.9%）、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)：111782-201706，純度：97.3%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

杞菊地黃丸（大蜜丸）購(gòu)自北京同仁堂科技發(fā)展有限公司制藥廠（批號(hào)分別為16013106、17010779、17010781）、藥都制藥集團(tuán)股份有限公司（批號(hào)分別為171101、170401）、天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司（批號(hào)：115495）、北京御生堂集團(tuán)石家莊制藥有限公司（批號(hào)：17101007）、天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠（批號(hào)：5480075）；杞菊地黃丸（水蜜丸）購(gòu)自太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司（批號(hào)：17110015）、湖北瑞華制藥有限責(zé)任公司（批號(hào)：180110）；甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-甲醇（B）-0.2%冰醋酸溶液（C）梯度洗脫（0～10 min，10%～12%A，0～5%B；10～20 min，12%～14%A，5%～10%B；20～30 min，14%～15%A，10%～25%B；30～40 min，15%A，25%～40%B；40～50 min，15%～25%A，40%～45%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)，240 nm（0～18.5、21～25 min，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷）、348 nm（18.5～21.0、25～42 min，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?74 nm（42～60 min，丹皮酚）；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岣鲗?duì)照品適量，加70%的甲醇制成質(zhì)量濃度分別為482.66、501.95、489.33、1038.15、125.83、62.98、233.99 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL 置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成分別含上述成分19.31、20.08、19.57、41.53、5.03、2.52、9.36 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取剪碎的大蜜丸（批號(hào)：17010779）約1.2 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞后稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量。用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液[11]。

2.4 陰性樣品溶液制備

按照樣品處方和工藝，分別制成缺酒萸肉、牡丹皮、菊花的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 分別取陰性樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定（圖1）。由圖1可知，樣品中各測(cè)定峰分離良好。缺牡丹皮陰性樣品溶液在與芍藥苷、丹皮酚色譜峰相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰；缺酒萸肉陰性樣品溶液在與莫諾苷、馬錢苷色譜峰相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰；缺菊花陰性樣品溶液在綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵘V峰相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰，表明陰性無(wú)干擾。

圖1 混合對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液及杞菊地黃丸樣品高效液相色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別加70%甲醇稀釋100、50、25、10、5、1倍，制得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵩谠囼?yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 杞菊地黃丸中7個(gè)化學(xué)成分的回歸方程及線性范圍

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：17010779）按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD 分別為0.64%、0.80%、0.72%、0.10%、0.71%、1.02%、0.74%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：17010779），按2.3 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算6份樣品的含量，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷康腞SD分別 為1.08%、1.73%、1.08%、1.63%、1.60%、1.74%、1.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品（批號(hào)：17010779）按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD分別為1.37%、0.70%、1.05%、0.20%、1.87%、1.15%、1.16%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一樣品（批號(hào)：17010779）約0.6 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液（莫諾苷48.266 μg·mL-1、馬錢苷50.195 μg·mL-1、芍藥苷48.933 μg·mL-1、丹皮酚103.815 μg·mL-1、綠原酸12.583 μg·mL-1、木犀草苷6.298 μg·mL-1、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸23.399 μg·mL-1）5 mL，再精密加入70%甲醇20 mL，之后按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的回收率分別為99.73%、101.00%、98.67%、99.19%、102.56%、101.66%、100.98%，RSD分別為1.29%、0.51%、1.21%、1.01%、0.97%、1.07%、0.47%，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表2。

表2 杞菊地黃丸中7個(gè)成分含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

2.5.7 樣品含量測(cè)定 取不同廠家10 批樣品，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同廠家杞菊地黃丸中7個(gè)成分的含量測(cè)定（n=2）mg·g-1

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取方法（超聲提取、加熱回流提取）、提取時(shí)間（30、45、60、75 min）對(duì)杞菊地黃丸中芍藥苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩? 個(gè)成分含量的影響。最終確定制備方法為70%甲醇加熱回流提取1 h[11]。

3.2 流動(dòng)相選擇及優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同種類的流動(dòng)相，首先參照《中國(guó)藥典》2020 年版采用乙腈-磷酸溶液[11]、再采用乙腈-冰醋酸溶液梯度洗脫，結(jié)果3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬姆蛛x效果不好；后采用甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液，結(jié)果木犀草苷分離效果不好且分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；之后選擇了甲醇-乙腈-冰醋酸溶液，并通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相比例，使各峰有較好的分離度，因此，最終確定以甲醇-乙腈-0.2%冰醋酸為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 同時(shí)測(cè)定了杞菊地黃丸中芍藥苷、莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮?，該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。