瞿昊宇,何 群,謝夢(mèng)洲,3,4,5,陳光宇,3,4,5*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室;5.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙410208)

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖,主產(chǎn)于四川省彭州、都江堰等地,為四川道地藥材(道地藥材是指具有特定產(chǎn)區(qū)、貨真質(zhì)優(yōu)的中藥材)。川芎功能與主治為活血行氣、祛風(fēng)止痛,用于胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛[1],為歷版《中華人民共和國藥典》收載(如2015版《中華人民共和國藥典》一部40-41頁),經(jīng)炮制后以飲片入藥?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明,川芎的活性成分主要包括揮發(fā)油、酚酸類、生物堿類和內(nèi)酯類等,其中,阿魏酸是川芎中重要的活性成分,是評(píng)價(jià)川芎質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)阿魏酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化,抗血小板凝集和血栓,清除亞硝酸鹽、氧自由基、過氧化亞硝基,以及抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變、增強(qiáng)免疫功能等作用[3]。早期曾從國產(chǎn)川芎分離出有特殊氣味、易揮發(fā)的油狀生物堿、阿魏酸、酚性物質(zhì)和揮發(fā)油等,近年來,對(duì)川芎化學(xué)成分的研究比較深入,已分離鑒定出了260余種成分[4]。作為臨床常用中藥,有關(guān)川芎化學(xué)成分的研究較多,國內(nèi)外均有大量研究報(bào)道[5]。一般認(rèn)為,川芎經(jīng)炮制后,質(zhì)變酥脆,利于粉碎和有效成分煎出。2015版《中華人民共和國藥典》一部“川芎藥材及飲片”項(xiàng)下規(guī)定了性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測(cè)定,未規(guī)定指紋圖譜檢測(cè)。但僅從已有的檢測(cè)項(xiàng)目(如浸出物、阿魏酸含量等)無法全面控制川芎藥材質(zhì)量,研究其單體成分并不能洞悉川芎功效的全貌,不能全面反映川芎炮制前后質(zhì)量屬性的改變,從而影響川芎藥材及飲片質(zhì)量控制及質(zhì)量評(píng)價(jià)。目前,國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道川芎藥材或飲片的指紋圖譜研究,但其方法未被藥典收載。且其指紋圖譜未對(duì)原料來源進(jìn)行聚類分析,對(duì)于量質(zhì)傳遞研究還缺乏依據(jù)。本研究基于液相色譜法,對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的川芎指紋圖譜研究進(jìn)行驗(yàn)證,為藥典收載方法提供重現(xiàn)性依據(jù)。根據(jù)指紋圖譜驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)川芎指紋圖譜峰進(jìn)行辨認(rèn),為川芎藥材-飲片量值傳遞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司;包括G1316A四元梯度泵,G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A恒溫箱,G1314A紫外檢測(cè)器,Agilent Chemstation色譜工作站);中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司);ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);TCS-100型電子臺(tái)秤(上海乾峰電子儀器有限公司);PW135型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);QY-1中藥切片機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司);101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

各產(chǎn)地、批號(hào)的川芎藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智老師鑒定為川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖;阿魏酸對(duì)照品(批號(hào):110773-201614),購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)),供含量測(cè)定用(不少于99.0%50 mg);甲醇、乙腈為色譜純,水為重蒸餾水;液相色譜柱(月旭公司Ultimate?XB-C18型,5μm,4.6mm×250mm)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 川芎藥材指紋圖譜測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[1-6]液相色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相;梯度洗脫(0~10 min,15%→30%A;10~20 min,30%→50%A;20~40 min,50%→70%A;40~45min,70%A;45~55 min,70%→100%A;50~60 min,100%A;60~65min,100%→15%A;65~70 min,15%A)流速:0.8 m L·min-1,檢測(cè)波長為270nm,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:10μL,理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.1.2 阿魏酸對(duì)照品溶液制備 取阿魏酸約10mg,精密稱定,置于10 m L棕色容量瓶中,精密加入70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成每1m L含阿魏酸1.13mg的阿魏酸對(duì)照品濃溶液1,精密移取1 m L阿魏酸對(duì)照品濃溶液1置10 m L棕色容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成每1 m L含阿魏酸0.113mg的對(duì)照品濃溶液2,精密移取2 m L阿魏酸對(duì)照品濃溶液2于10 m L棕色容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成每1 m L含阿魏酸22.6μg的對(duì)照品溶液,過0.22μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中,即得。

2.1.3 供試品溶液制備基本方法 取川芎粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50m L,密塞,稱定重量,置超聲波提取器中超聲60 min(200 W,50 Hz),放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,靜置,取10 m L上清液離心7 min,取上清液,過0.22μm的微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中,即得供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照供試品溶液的制備 取缺川芎藥材的樣品,按“2.1.3”法同法制備,即得陰性供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察[7-10]

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,檢測(cè)指紋圖譜峰,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與峰面積比值大體一致,阿魏酸色譜峰面積RSD=1.382%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份,按供試品溶液的制備法制備成供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定其色譜圖,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與峰面積比值大體一致,阿魏酸色譜峰面積RSD=2.272%(n=6),表明本分析方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣,測(cè)定其HPLC譜圖,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值基本一致,阿魏酸色譜峰面積RSD=2.772%(n=6),表明本分析方法穩(wěn)定性良好,供試液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 川芎藥材及飲片指紋圖譜建立

根據(jù)CX-02、06、07、08、09、17、20、21、22、23、24、25、26、29、30等15批次川芎藥材及飲片色譜圖,參照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行匹配,15批藥材指紋圖譜見圖1,15批飲片指紋圖譜見圖2,生成的川芎藥材對(duì)照特征圖譜見圖3,川芎飲片對(duì)照特征圖譜見圖4。陰性對(duì)照品溶液(甲醇空白)見圖5,阿魏酸對(duì)照品溶液見圖6,川芎藥材供試液指紋圖譜見圖7,川芎飲片供試液指紋圖譜見圖8,各批藥材供試品對(duì)照特征圖譜相似度見表1。各批飲片供試品對(duì)照特征圖譜相似度見表2。

表1 15批川芎藥材HPLC指紋圖譜相似度

表2 15批川芎飲片HPLC指紋圖譜相似度

圖1 15批川芎藥材指紋圖譜

圖2 15批川芎飲片指紋圖譜

圖3 川芎藥材對(duì)照特征圖譜

圖4 川芎飲片對(duì)照特征圖譜

圖5 陰性對(duì)照品指紋圖譜(甲醇溶劑空白)

圖6 阿魏酸對(duì)照品指紋圖譜

圖7 川芎藥材指紋圖譜

圖8 川芎飲片指紋圖譜

由表1知,川芎藥材各指紋圖譜相似度值皆不低于0.9, 故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)規(guī)定川芎藥材指紋圖譜相似度不低于0.9。

由表2知,川芎飲片各指紋圖譜相似度值皆不低于0.9,故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)規(guī)定川芎飲片指紋圖譜相似度不低于0.9。

2.4 聚類分析

以川芎藥材(30個(gè)共有峰)及飲片(29個(gè)共有峰)15批樣品中所有共有峰面積為變量,利用DPS 7.05軟件中“系統(tǒng)聚類”方法對(duì)川芎藥材及飲片HPLC指紋圖譜進(jìn)行聚類分析,選擇數(shù)據(jù)不轉(zhuǎn)換、歐氏距離、最短距離,結(jié)果見圖9、圖10。

圖9 川芎藥材指紋圖譜聚類分析

圖10 川芎飲片指紋圖譜聚類分析

由圖9、圖10可知,川芎藥材及飲片相似度與產(chǎn)地并無太大關(guān)聯(lián),說明產(chǎn)地來源并不對(duì)指紋圖譜相似度有顯著影響。

2.5 川芎藥材和川芎飲片指紋圖譜特征分析與比較

對(duì)15批川芎藥材和川芎飲片指紋圖譜相似度進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),得配對(duì)樣本相關(guān)系數(shù)γ=0.918 8,其均值差異檢驗(yàn)t=1.896,df=14,P=0.078 8,結(jié)果表明川芎藥材和川芎飲片指紋圖譜大體一致,川芎炮制前后其化學(xué)成分變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

川芎藥材炮制成飲片過程中需要清洗、悶潤(軟化)、切片、干燥,川芎中的阿魏酸及揮發(fā)油在清洗、干燥中易損失,故川芎飲片指紋圖譜可反映川芎炮制前后各成分的變化,從而評(píng)價(jià)川芎藥材-飲片的量值傳遞率,控制川芎飲片質(zhì)量。

本研究生成了川芎藥材及飲片的對(duì)照特征圖譜,比較了各批次相似度,發(fā)現(xiàn)各批次產(chǎn)地與相似度并無太大關(guān)系。

川芎指紋圖譜研究多用于不同產(chǎn)地、采收期、川芎飲片及其煎劑、飲片等級(jí)[11],以及提取方法[12]等方面差異的比較,而川芎炮制前后質(zhì)量屬性(主要是化學(xué)成分)、質(zhì)量傳遞的比較(以相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo))未見報(bào)道,本研究可為川芎產(chǎn)地粗加工、炮制前后質(zhì)量屬性的變化及川芎飲片質(zhì)量控制提供參考。