忙順蘭，羅曉蔓，丁貴杰

（1.貴州大學(xué) a.貴州省森林資源與環(huán)境研究中心；b.貴州省高原山地林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，貴州 貴陽 550003）

馬尾松Pinus massoniana是我國全樹綜合利用程度高的鄉(xiāng)土喬木針葉樹種，具有分布廣、面積和蓄積大、生長快、產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)等特性，在荒山造林和工業(yè)用材等方面被廣泛應(yīng)用[1]。馬尾松還是典型外生菌根真菌樹種，其特有的哈氏網(wǎng)、外延菌絲、菌絲套等形態(tài)結(jié)構(gòu)與根系形成共生體[2]，拓寬根系與土壤接觸的面積、提高植物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增強(qiáng)植物抵御環(huán)境脅迫潛力[3]。真菌定植于根系后形成的菌根能夠改變植物根系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、膜透性和代謝功能，進(jìn)而影響根系分泌物的化學(xué)成分和數(shù)量[4-5]。

根系分泌物是植物在生長過程中通過根系向根際土壤釋放的糖類、氨基酸類、有機(jī)酸類等有機(jī)物質(zhì)統(tǒng)稱[6]。它不僅是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體，也是調(diào)節(jié)土壤微環(huán)境活力與功能的關(guān)鍵因素[7]。到目前為止，有學(xué)者對根系分泌物對土壤性質(zhì)的影響做了大量研究工作。例如，耿貴[8]發(fā)現(xiàn)大豆根系分泌物抑制土壤酸性磷酸酶和過氧化氫酶活性，提高脲酶和蔗糖酶活性，而玉米根系分泌物對土壤酶活性具有活化效應(yīng)。袁秀梅等[9]發(fā)現(xiàn)低量和高量蠶豆根系分泌物降低土壤pH 值和堿解氮含量，但顯著增加土壤中有效磷、鉀含量。唐穎[10]發(fā)現(xiàn)落葉樹根系分泌物中碳刺激胞外酶產(chǎn)生，促進(jìn)根際土壤氮素的轉(zhuǎn)化及有效性。由此可見，不同植物根系分泌物及其濃度對土壤酶活性及養(yǎng)分含量的影響存在顯著差異。

近年來，有學(xué)者針對菌根化馬尾松苗木形態(tài)變化(如生長狀況、根系形態(tài)等)、生理響應(yīng)(如光合作用、酶活性、養(yǎng)分循環(huán)等)和菌根苗脅迫等方面[11-12]做了大量工作，但尚未對接菌后馬尾松根系分泌物在土壤中的作用進(jìn)行研究。因此，本試驗(yàn)選用接菌/不接菌馬尾松幼苗根系分泌物，以不同濃度澆灌于馬尾松幼苗土壤，研究土壤酶活性和養(yǎng)分含量的變化規(guī)律，旨在為馬尾松菌根育苗、馬尾松人工林可持續(xù)利用及馬尾松林地肥力管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種：由西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院黃建國教授供給的兩種菌株褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteus(簡稱Sl)，記為Sl13 和Sl12。選取Pachlewski 培養(yǎng)基對上述菌種進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)繁。

馬尾松種子：采自貴州都勻馬寨馬尾松國家良種基地。

栽植基質(zhì)：黃壤土，理化性質(zhì)：pH 值為5.30，有機(jī)質(zhì)含量為76.83 g·kg-1，全量養(yǎng)分氮磷鉀含量依次為0.78、0.74、11.50 g·kg-1，速效養(yǎng)分氮磷鉀含量依次為47.80、80.00、40.00 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接菌/不接菌馬尾松苗培育

種子處理：將清水洗好的種子用5‰高錳酸鉀溶液進(jìn)行消毒后沖洗，溫水浸泡，置于恒溫箱催芽，等到種子露白時(shí)播種。

土壤處理：用5‰高錳酸鉀溶液消毒殺菌，蓋上塑料薄膜，通風(fēng)晾曬一周。

接菌和播種：試驗(yàn)在苗圃大棚中展開，采用條播方式。將已處理的土壤鋪成苗床，分別噴灑兩種菌劑(Sl13 和Sl12)，再播上露白種子，覆土。不接菌(NS)則噴灑等量無菌培養(yǎng)液。培養(yǎng)1 a 后提取根系分泌物。

1.2.2 根系分泌物的提取及溶液配制

根際土采集：選取規(guī)格一致的1年生馬尾松苗(其中Sl13、Sl12、NS 平均侵染率依次為85.90%、84.9%、2.84%)，從苗床上掘起，輕抖根系，把附在細(xì)根表面不脫落用滅菌刷刷落的土作為根際土，各處理均取200 g，裝入滅菌自封袋中，于4℃保存，待試驗(yàn)用。

根系分泌物提取：采用乙醇浸提法[13]，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。具體為：將各處理根際土分別裝入錐形瓶中，按1∶2 的體積比加入85%的乙醇，置于28℃恒溫?fù)u床中振蕩24 h；再置于高速離心儀(轉(zhuǎn)速：3500 r·min-1，溫度：4℃)中離心20 min，取過濾上清液；置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去乙醇浸提劑，乙酸乙酯萃取1 次；再分別用濃度均為1 mol·L-1的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH 值為酸性和堿性，等量乙酸乙酯萃??；合并中、酸、堿性乙酸乙酯相，即為馬尾松根系分泌物提取液。

濃度配制：將上述提取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮，無水硫酸鈉脫水，因部分根系分泌物難溶于水，需取1 mL 乙醇溶解，配制濃度為1 mg·mL-1的根系分泌物溶液( 每mL 蒸餾水含1 mg 根系分泌物)，并將其稀釋為0.5、0.25 mg·mL-1兩個(gè)濃度，即得到Sl13、Sl12、NS馬尾松高、中、低3 個(gè)濃度水平的根系分泌物，另取1%乙醇溶液作為對照CK。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在苗圃大棚中進(jìn)行，于2016年3月，將長勢一致的1年生幼苗移栽至盆(25 cm×20 cm)中，每盆種植3 株，每個(gè)濃度3 盆，共30 盆，緩苗后開展試驗(yàn)。每周分別向盆內(nèi)澆灌不同濃度根系分泌物溶液300 mL，4 個(gè)月后采集土樣，測定土壤酶活性和土壤養(yǎng)分。

1.2.4 指標(biāo)測定

土壤酶活性測定使用北京索萊寶生物科學(xué)技術(shù)有限公司的試劑盒，測定步驟和結(jié)果計(jì)算均參照說明書進(jìn)行，其中多酚氧化酶、脲酶、酸性磷酸酶依次采用鄰苯三酚比色法、靛藍(lán)比色法、磷酸苯二鈉比色法。土壤化學(xué)性質(zhì)均參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)方法測定[14]，包含：pH 值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 軟件對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及簇狀柱形圖和三線表制作，采用PASW Statistics 18.0 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 法顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌/不接菌馬尾松根系分泌物對土壤酶活性的影響

3 種土壤酶對接菌/不接菌馬尾松根系分泌響應(yīng)不同(圖1)。多酚氧化酶：接菌處理除高濃度外均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，不接菌處理影響不大，甚至略呈抑制作用，但處理間均差異不顯著(P＞0.05)。脲酶：高濃度(1 mg·mL-1) 下，Sl12 較CK 顯著增加了20.64%；中濃度(0.5 mg·mL-1)下，Sl13、Sl12、NS 較CK 分別增加了22.47%、22.47%、11.15%，Sl13 和Sl12 與CK 差異顯著(P＜0.05)，NS 與CK 差異不顯著(P＞0.05)；低濃度(0.25 mg·mL-1)下，Sl13 較CK 顯著增加了26.71%。酸性磷酸酶：與CK 相比，Sl13、Sl12、NS 依次提高了11.10%、9.32%、6.98%(1 mg·mL-1)，9.51%、6.04%、0.34%(0.5 mg·mL-1)，其中高濃度下Sl13與CK 差異顯著(P＜0.05)，低濃度下接菌/不接菌馬尾松根系分泌物表現(xiàn)為抑制作用，但差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 不同馬尾松幼苗根系分泌物對土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of root exudates of different Pinus massoniana seedlings on soil enzyme the activities

2.2 接菌/不接菌馬尾松根系分泌物對土壤pH值和全量養(yǎng)分的影響

接菌/不接菌馬尾松幼苗根系分泌物對土壤pH 值和土壤全量養(yǎng)分影響程度有所區(qū)別(表1)。高、中濃度(0.5～1 mg·mL-1)下，與CK 相比，Sl13、Sl12、NS 的pH 值變化幅度為：-6.76%～-4.02%、-1.65%～-0.91%、0.18%～2.38%；土壤有機(jī)質(zhì)和全氮、全磷、全鉀的變化規(guī)律性不明顯，且處理間差異不顯著。低濃度(0.25 mg·mL-1)下，與CK 相比，Sl13、Sl12、NS 處理有機(jī)質(zhì)提高了10.51%、0.77%、6.05%，Sl13 與CK 差異顯著(P＜0.05)，3 種根系分泌物均促進(jìn)全氮、全磷、全鉀含量的積累，且接菌馬尾松根系分泌物的促進(jìn)作用較不接菌強(qiáng)，處理間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 不同馬尾松幼苗根系分泌物對土壤pH 值和土壤全量養(yǎng)分的影響?Table 1 Effects of root exudates of different Pinus massoniana seedlingson soil pH and total nutrients

2.3 接菌/不接菌馬尾松根系分泌物對土壤有效養(yǎng)分的影響

如圖2可知，接菌/不接菌馬尾松根系分泌物對土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量的影響不明顯，差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 不同馬尾松幼苗根系分泌物對土壤有效養(yǎng)分的影響Fig.2 Effects of root exudates of different Pinus massoniana seedlings on soil available nutrients

2.4 施加根系分泌物后的土壤酶活性與土壤養(yǎng)分相關(guān)性分析

由表2可知，多酚氧化酶與有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷相關(guān)系數(shù)分別為0.700、0.704、0.657，呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；與全磷、堿解氮、速效鉀相關(guān)系數(shù)分別為：0.808、0825、0.835，呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。脲酶與速效鉀相關(guān)系數(shù)為0.645，呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。酸性磷酸酶與pH 值和有效磷呈密切正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為：0.665，P＜0.05；0.769，P＜0.01)。由此說明在根系分泌物的作用下，土壤酶與土壤養(yǎng)分共同影響土壤肥力。

表2 施加根系分泌物后的土壤酶活性與土壤養(yǎng)分相關(guān)性分析?Table 2 Correlation analysis of soil enzyme activities and nutrients after applying root

3 討 論

土壤酶是土壤生化過程的動(dòng)力，其活性大小可反映土壤肥力、質(zhì)量、環(huán)境的演化情況[15]。研究表明，真菌與植物形成共生關(guān)系后，根系分泌物中游離氨基酸、可溶性蛋白、可溶性糖等低分子量化合物含量明顯增多[16-17]，豐富土壤微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)土壤中某些細(xì)菌、放線菌和真菌的繁殖和生長[18-19]，進(jìn)而增加了土壤酶的來源[20]。本研究中，接菌馬尾松根系分泌物對脲酶和酸性磷酸酶有一定的活化作用，對多酚氧化酶的作用效果不明顯；不接菌馬尾松根系分泌物對3 種土壤酶的影響未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與陳莉莎[21]研究結(jié)果有一定區(qū)別，原因可能是不同植物根系分泌的物質(zhì)成分和含量存在差異。

土壤中有機(jī)質(zhì)、氮、磷和鉀含量的高低表征土壤養(yǎng)分及肥力狀況[22]。根系分泌物能夠通過多種途徑降解土壤中碳和磷等難溶性物質(zhì)，促進(jìn)土壤養(yǎng)分積累，增強(qiáng)土壤供肥能力[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，接菌馬尾松根系分泌物降低土壤pH 值，不接菌提高土壤pH 值，這與羅曉蔓等[25]研究結(jié)果一致，接菌植物根系分泌物含量和成分增多，尤其是甲酸、乙酸、草酸等酸類物質(zhì)，使土壤pH 值下降；其次接菌馬尾松根系分泌物中可能含有攜帶羧基等酸性的粘膠，釋放H+離子，降低土壤pH值[26]。本研究中，盆栽馬尾松幼苗土壤受到低濃度(0.25 mg·mL-1)接菌根系分泌物作用后，土壤有機(jī)質(zhì)含量明顯升高，而不接菌根系分泌物處理的土壤有機(jī)質(zhì)變化不大，這可能在于真菌與寄主形成的共生體改變了根系分泌物特性，這種改變誘導(dǎo)土壤難溶性碳受到絡(luò)合作用及降解反應(yīng)等打破有機(jī)礦質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，將保護(hù)性碳釋放出來，增加有機(jī)質(zhì)含量[27]；土壤氮磷鉀養(yǎng)分含量對接菌和不接菌馬尾松根系分泌物無明顯響應(yīng)，但接菌根系分泌物對氮磷鉀養(yǎng)分的影響幅度更大，這在于接菌馬尾松根系分泌物降低土壤酸堿度，加重原生礦物的酸化程度降低其穩(wěn)定性，增強(qiáng)氮磷鉀等礦物質(zhì)的溶解釋放，增大土壤氮磷鉀含量的變化幅度。本試驗(yàn)結(jié)果與孫磊等[28]研究有所不同，可能與供體植物根系分泌物、土壤類型和受體植物等因素有關(guān)。

相關(guān)研究顯示，土壤酶和土壤養(yǎng)分相關(guān)性較強(qiáng)[29-30]。本研究中，多酚氧化酶活性與有機(jī)質(zhì)、全量養(yǎng)分氮磷、有效養(yǎng)分氮磷鉀含量存在較強(qiáng)的正相關(guān)性，脲酶活性與有效鉀含量存在較強(qiáng)的正相關(guān)性，酸性磷酸酶活性與pH 值和有效磷含量存在較強(qiáng)的正相關(guān)性。說明土壤酶通過酶促作用改變土壤中化學(xué)物質(zhì)存在形式，土壤化學(xué)性質(zhì)對土壤酶作出反饋調(diào)節(jié)，協(xié)同修飾土壤質(zhì)量。這與前人的研究結(jié)論相似。易艷靈等[31]用柏木根系分泌物處理盆栽香椿土壤后發(fā)現(xiàn)，土壤酶活性增強(qiáng)，有效養(yǎng)分含量也得到提高。魏圣釗等[32]發(fā)現(xiàn)，受連載巨桉根系分泌物影響的土壤理化性質(zhì)改變土壤酶活性，提高土壤肥力。由此可知，土壤酶活性和土壤養(yǎng)分相輔相成，土壤養(yǎng)分循環(huán)和土壤有效養(yǎng)分供給力的強(qiáng)弱離不開土壤一系列酶的酶促作用，酶促反應(yīng)也離不開作為基礎(chǔ)底物的土壤理化性質(zhì)，二者共同影響土壤肥力。

馬尾松根系分泌物對土壤質(zhì)量的影響是一個(gè)復(fù)雜的過程。本研究比較了3 個(gè)濃度水平下的接菌馬尾松分泌物和不接菌馬尾松根系分泌物處理后土壤多酚氧化酶、脲酶、酸性磷酸酶活性，及土壤酸堿度、有機(jī)質(zhì)、總氮磷鉀量和速效氮磷鉀量含量的差異，并分析了施加馬尾松根系分泌后土壤酶活性與土壤養(yǎng)分兩者之間相關(guān)緊密程度，對于馬尾松菌根苗的培育和馬尾松人工林林地肥力的調(diào)控具有一定的指導(dǎo)意義。但是僅僅掌握土壤酶活性及土壤養(yǎng)分變化規(guī)律尚不能完全調(diào)控土壤肥力，還需深入研究根系分泌物處理后土壤微生物種類和數(shù)量的分布情況及變化趨勢。通過研究這些指標(biāo)，系統(tǒng)掌握根系分泌物在土壤養(yǎng)分循環(huán)和轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制，進(jìn)而科學(xué)管理林地肥力，提高林地土壤生產(chǎn)力。此外，目前關(guān)于季節(jié)性動(dòng)態(tài)監(jiān)測林木根系分泌物-土壤-微生物互饋機(jī)制及林木根系分泌物調(diào)節(jié)林地碳動(dòng)態(tài)變化機(jī)理的研究尚未見到報(bào)道[33]，未來森林培育工作應(yīng)加強(qiáng)上述研究，厚實(shí)林木根系分泌物與土壤生態(tài)環(huán)境相互關(guān)系理論知識，為林業(yè)發(fā)展提供更好的服務(wù)。

4 結(jié) 論

接菌馬尾松根系分泌物影響土壤酶活性。從數(shù)值上來看，中、低濃度下，接菌Sl13 和Sl12 使多酚氧化酶活性增大，不接菌則減??；高、中濃度下，3 種根系分泌物脲酶活性和酸性磷酸酶活性均增大，但接菌根系分泌物作用幅度更大。從顯著性來看，高濃度下接菌Sl12、中濃度下接菌Sl13 和Sl12、低濃度下接菌Sl13 的脲酶活性顯著增強(qiáng)，高濃度下接菌Sl13 顯著提高酸性磷酸酶活性，不接菌處理對土壤酶無顯著影響。

接菌馬尾松根系分泌物使土壤pH 值下降，不接菌根系分泌物使土壤pH 值升高。接菌馬尾松根系分泌物Sl13 在低濃度下顯著促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)含量的積累。接菌/不接菌馬尾松根系分泌物對土壤全氮、全磷、全鉀、有效氮、有效磷、速效鉀的影響不明顯。但從數(shù)值上來看，接菌馬尾松根系分泌物在高低濃度下的全氮、全鉀、全磷含量比不接菌根系分泌物高。

土壤多酚氧化酶與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷，土壤脲酶與土壤速效鉀，土壤酸性磷酸酶與土壤pH 均呈顯著正相關(guān)；土壤多酚氧化酶與土壤全磷、堿解氮、速效鉀，土壤酸性磷酸酶與土壤有效磷均呈極顯著正相關(guān)。

綜上所述，接菌馬尾松根系分泌物激活土壤脲酶活性和酸性磷酸酶活性，降低土壤pH 值，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，對土壤多酚氧化酶活性和土壤氮磷鉀含量的影響未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不接菌馬尾松根系分泌物提高土壤pH 值，對土壤酶和土壤養(yǎng)分的影響較小。對盆栽馬尾松幼苗土壤施加接菌/不接菌馬尾松根系分泌物后，土壤酶與土壤養(yǎng)分存在顯著或極顯著相關(guān)性。表明接菌馬尾松根系分泌物對土壤肥力的影響程度較不接菌馬尾松根系分泌物大，在接菌馬尾松根系分泌物的作用下，土壤酶和土壤理化性質(zhì)協(xié)同改善土壤質(zhì)量。