楊曉偉，朱寧華，韓志強(qiáng)，劉天宇，李 恒，楊 捷，朱新傳

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.安?？h陳山林場，江西 吉安 343214）

杉木Cunningham lanceolate具有生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、木材價(jià)值高等優(yōu)良特性，是我國南方重要的商品用材林樹種[1]。隨著國內(nèi)外市場用材需求從原先單純數(shù)量型向數(shù)量與木材品質(zhì)轉(zhuǎn)變，現(xiàn)有杉木良種數(shù)量和質(zhì)量難以滿足未來生產(chǎn)需求。鐵心杉作為杉木的重要變種，發(fā)掘于湖南省永順縣小溪國家自然保護(hù)區(qū)，其心材現(xiàn)油亮的黑褐色，且心材比率大，木材堅(jiān)硬如鐵，耐腐，材性優(yōu)于速生杉、紅心杉、普通杉，是杉木中最為理想的商品用材林種質(zhì)資源[2]。

杉木育種工作始于20世紀(jì)50年代，陳岳武等[3]于60年代首次將配合力的概念引入到杉木育種并計(jì)劃應(yīng)用到杉木的多世代改良中。自此國內(nèi)有許多杉木研究者開展了大量的杉木雜交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，洪昌瑞等[4]以149 個(gè)杉木為材料進(jìn)行雜交設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)不同雜交組合間主要性狀差異顯著或極顯著。陳代喜[5]對不同雜交設(shè)計(jì)的6年生杉木子代進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同雜交組合間也存在顯著遺傳差異，多父本授粉可以極大提高得到優(yōu)良組合的幾率且一般配合力差異較大的兩個(gè)親本雜交產(chǎn)生較高的特殊配合力。另外陳代喜等[6]對28年生杉木全同胞子代測定林研究發(fā)現(xiàn)樹高、胸徑和立木采集雜交組合間均呈極顯著差異。李力等[7]通過測定杉木多系雜交子代發(fā)現(xiàn)組合杉木群組親本間變異很大。姜年春等[8]在杉木雜交組合容器育苗中表明不同杉木雜交組合間的苗高、分指數(shù)、基徑存在顯著差異。以上研究表明，通過選擇優(yōu)良性狀的親本雜交開展杉木育種不一定產(chǎn)生性狀同樣優(yōu)良的子代且耗時(shí)耗力，因此，傳統(tǒng)雜交親本的選配有一定的局限性。而親本鑒定是可以基于天然優(yōu)良半同胞子代追溯親本來源，進(jìn)而開展雜交育種工作，減少了育種的工作量，節(jié)約了時(shí)間成本，提高了育種效率，目前無相關(guān)對鐵心杉半同胞子代進(jìn)行父本鑒定的研究。

親本鑒定主要包括父本鑒定和母本鑒定，通常情況下主要有觀察記錄和遺傳標(biāo)記分析兩種方法[9]。天然群體中，親本分析主要判定子代親本來源，通常母本信息是已知的，因此主要以父本鑒定為主。對于木本植物而言，通過對每個(gè)子代及其候選父本進(jìn)行遺傳標(biāo)記分析，采用遺傳排除法或最大似然值法，可鑒定出候選父本。前者是基于孟德爾遺傳定律，在天然的群體中，子代的等位基因一定來自雜交親本，根據(jù)多位點(diǎn)遺傳數(shù)據(jù)直接排除與后代具有不同位點(diǎn)的親本，從而逐漸在候選父本中鑒定得到遺傳父本。而最大似然值法最早由Meaghher[10-11]提出，通過估計(jì)親本的似然性模型來預(yù)測最可能親本來源，當(dāng)選取多個(gè)連鎖不平衡位點(diǎn)同時(shí)用于父本分析時(shí)，將每一個(gè)位點(diǎn)的似然值相乘，并取得自然對數(shù)，最后得到聯(lián)合似然值（LOD），這種分析方法已經(jīng)被用于分析已知母本，或者親本均不明確的子代對應(yīng)的遺傳親本，是親本鑒定中最常用的方法[12-13]。SSR分子標(biāo)記是一種共顯性的分子標(biāo)記，符合孟德爾遺傳定律，可以提供大量的遺傳變異信息，且成本低，操作便捷，在遺傳結(jié)構(gòu)分析、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建和親本分析中應(yīng)用廣泛[14-18]。王建忠等[19]利用11 對SSR 標(biāo)記對桉樹20 個(gè)基因型半同胞子代進(jìn)行了父本鑒定和雜交親本重建；王毓求等[20]利用10 個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)對3 個(gè)南方紅豆杉進(jìn)行遺傳變異和父本分析，揭示3 個(gè)自然授粉群體的雄性繁殖貢獻(xiàn)率分別為37.5%、84%、18.91%，有效花粉傳播距離為10.00～25.00 m，且花粉傳播無明顯固定模式；韓志強(qiáng)[21]利用14對SSR 引物對77 個(gè)優(yōu)良單株進(jìn)行父本鑒定，鑒定出59 個(gè)優(yōu)株的父本，構(gòu)建了49 個(gè)潛在優(yōu)勢雜交組合；張曙光、劉振、雷雨等均采用SSR 標(biāo)記對茶樹新品種進(jìn)行了鑒定[22-24]。因此，利用SSR 標(biāo)記進(jìn)行父本鑒定在林木育種中應(yīng)用是切實(shí)可行的。

本研究在野外踏查鐵心杉的基礎(chǔ)上收集鐵心杉優(yōu)良雌株自由授粉種子進(jìn)行播種育苗，從中選擇表現(xiàn)突出的優(yōu)良單株幼苗，利用SSR 標(biāo)記技術(shù)對優(yōu)良半同胞子代父本來源進(jìn)行鑒定，探討自由授粉狀態(tài)下的優(yōu)良雜交親本組合和父本繁殖貢獻(xiàn)率，建立高配合力的鐵心杉雜交親本，以期為鐵心杉選擇育種和雜交育種提供科學(xué)理論基礎(chǔ)，從而促進(jìn)鐵心杉的開發(fā)利用和育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

團(tuán)隊(duì)于2017年10月中下旬至10月底在湖南省小溪國家自然保護(hù)區(qū)收集優(yōu)良母樹的球果，于中南林業(yè)科技大學(xué)自然風(fēng)干，收集鐵心杉種子。2018年5月份進(jìn)行穴盤播種育苗，經(jīng)播種育苗得到10 株優(yōu)良母樹半同胞子代3 576 個(gè)。2021年1月，在育苗溫室中，統(tǒng)計(jì)10 個(gè)母樹半同胞子代幼苗苗高、地徑、葉長、葉寬和葉面積，對其性狀進(jìn)行綜合評價(jià)并排名獲得半同胞子代優(yōu)株。將獲得的半同胞幼苗優(yōu)株新梢、母本及周圍所有候選父本的嫩葉放入5 ml 冷凍管，液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，共?jì)463 份鐵心杉種質(zhì)材料。

1.2 DNA 提取及引物合成

利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA 提取試劑盒（DP320）提取鐵心杉葉片全基因組DNA，操作見說明書；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量和純度，WF2800-D3B紫外分光光度計(jì)檢測DNA 濃度，各樣本DNA 統(tǒng)一稀釋為20～50 ng/uL，-20℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

從鐵心杉樣本中隨機(jī)選取20 個(gè)DNA 樣本對候選的199 對杉木引物進(jìn)行篩選，共選出穩(wěn)定、多態(tài)且特異的15 對引物用來鐵心杉優(yōu)良半同胞子代父本鑒定[25-27]，引物合成及檢測均由上海生物工程有限公司完成。其中，15 對SSR 引物正向引物F 端分別作4 種熒光（FAM、HEX、TOX 和TAMRA）標(biāo)記，篩選出的15 對SSR 引物基本信息見表1。

表1 15 對SSR 引物信息Table 1 Information of 15 pairs SSR primer

1.3 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

403 個(gè)候選父本、10 個(gè)優(yōu)株母本及篩選得到的優(yōu)良半同胞子代均采用同一反應(yīng)體系，共計(jì)20 ul。其中10 ul 2 ×Tap PCR Mix(Tiangen)DNA，6 ul ddH2O，4 ul DNA 模板，上、下游引物各1 ul。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，60℃退火90 s，72℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；60℃延伸10 min，最后4℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物質(zhì)量。將PCR 產(chǎn)物送去上海生物工程有限公司在ABI3730XL 自動(dòng)測序儀上進(jìn)行基因分型（Liz 600 為內(nèi)標(biāo)），GeneMarker 2.20 軟件統(tǒng)計(jì)基因分型結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將獲得的基因分型數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneMarker2.20軟件[28]統(tǒng)計(jì)基因分型結(jié)果，從而建立母本、候選父本及子代的基因型數(shù)據(jù)庫。利用GenALEx6.5 軟件[29]計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)（NA）、期望雜合度（HE）、觀測雜合度（HO）；軟件PIC_CALC Version 0.6[30]計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）。利用CERVUS3.0.7[31-32]軟件對10 個(gè)優(yōu)良母樹自由授粉的半同胞子代幼苗優(yōu)株進(jìn)行父本鑒定，首先計(jì)算等位基因頻率，得到等位基因頻率分析文件；運(yùn)行程序Simulation 中的paternity 子程序，選擇等位基因頻率文件，模擬10 000 次親子鑒定；運(yùn)行Parentage Analysis 程序中的paternity 子程序，輸入候選父本及半同胞子代基因型文件、等位基因頻率分析，估算各候選父本基因型最大似然對數(shù)比（LOD）值，根據(jù)LOD 的值大小判斷最似父本。其中，LOD 值表示與隨機(jī)父本相比，疑似父本傳遞給子代基因的可能性大小，當(dāng)LOD 值大于0 時(shí)，表明所鑒定出的親本為遺傳親本的可能性大于假設(shè)親本，并且LOD 值越大，結(jié)果越可靠。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵心杉半同胞子代幼苗優(yōu)株建立

對10個(gè)半同胞家系中的3 576個(gè)子代的苗高、地徑、葉寬、葉長、葉面積生長性狀進(jìn)行測定統(tǒng)計(jì)，制作箱線（圖1A）。從箱線圖中可以看出，不同母樹子代各個(gè)性狀表現(xiàn)不一，無法從單一性狀來選擇幼苗優(yōu)株。因此通過R 語言中corrplot 包[33]將5 個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（圖1B），5 個(gè)生長性狀之間相關(guān)性系數(shù)較高，其中苗高與其他4 個(gè)性狀均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，地徑與葉長、葉寬、葉面積成顯著正相關(guān)關(guān)系，葉長、葉寬和葉面積兩兩成極顯著正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性分析表明，5 個(gè)指標(biāo)存在著較為密切的相關(guān)性，因此需要將5 個(gè)因子通過主因子分析降維，使其轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)互相獨(dú)立的新指標(biāo)，從而對半同胞子代進(jìn)行綜合評價(jià)。

圖1 鐵心杉子代生長性狀箱線圖及性狀相關(guān)性分析圖Fig.1 Box plot of growth traits and correlation analysis of traits

鐵心杉5 個(gè)性狀相關(guān)性分析如表2所示，前3個(gè)主因子的累積方差貢獻(xiàn)率可達(dá)97.93%，能夠滿足對各個(gè)半同胞子代性狀的評定，因此，選用前3個(gè)主因子對鐵心杉進(jìn)行綜合評價(jià)得分。將主因子的特征值作為各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，與各個(gè)指標(biāo)相乘，得到主因子綜合評價(jià)得分計(jì)算公式：

表2 鐵心杉半同胞子代主要生長性狀主成分分析Table 2 The factor analysis of main traits of the blackheart wood Chinese fir offspring

式（1）～（3）中：X1～X5分別為苗高、地徑、葉長、葉寬、葉面積。

前3 個(gè)主因子的方差貢獻(xiàn)率不同，在進(jìn)行生長性狀綜合評價(jià)時(shí)，需要協(xié)調(diào)各因子的側(cè)重關(guān)系，以3 個(gè)因子的貢獻(xiàn)率84.16%、10.67%、3.1%為權(quán)重，結(jié)合3 個(gè)公因子的貢獻(xiàn)率與因子得分Fi，參考綜合得分計(jì)算公式可建立鐵心杉半同胞子代主要生長性狀綜合得分?jǐn)?shù)學(xué)模型：

參考以上綜合得分計(jì)算公式，在10 個(gè)半同胞家系3 576 株子代幼苗中共篩選出50 株得分較高的優(yōu)良子代單株（表3），以此來作為鐵心杉父本鑒定的材料。

表3 鐵心杉半同胞家系中入選子代幼苗優(yōu)株Table 3 Superior plants selected in the black-heart wood Chinese fir half-sib hybrid progeny

2.2 父本鑒定

2.2.1 遺傳分析

鐵心杉DNA 及PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖2A—2B所示，15 個(gè)SSR 引物在鐵心杉子代、母本及候選父本的擴(kuò)增圖譜如圖2C所示（部分示意），遺傳表達(dá)參數(shù)見表4，其中等位基因數(shù)在3～19 之間，平均為9.867，位點(diǎn)SSR6 上含有的等位基因最多為19 個(gè)，位點(diǎn)SSR14 及SSR15含有的等位基因最少為3 個(gè)；觀測雜合度（HO）及期望雜合度（HE）變異范圍為0.296～0.680 和0.460～0.887，平均為0.475 和0.679；多態(tài)信息含量（PIC）在0.356～0.876 之間，平均為0.634，其中有12 個(gè)SSR 位點(diǎn)多態(tài)信息含量（PIC）＞0.5，為高度多態(tài)位點(diǎn)，位點(diǎn)SSR1、SSR14 和位點(diǎn)SSR15 為中度多態(tài)位點(diǎn)，PIC 值分別為0.456、0.356和0.387；15 個(gè)SSR 位點(diǎn)多態(tài)信息含量較高，能夠滿足鐵心杉半同胞子代父本分析需求。

表4 15 個(gè)SSR 位點(diǎn)多態(tài)檢測及非父本排除概率Table 4 Polymorphism detection of 15 SSR loci and exclusion probability of non-paternal parents

圖2 鐵心杉DNA、PCR 產(chǎn)物檢測及引物在半同胞子代與母本及疑似父本中的擴(kuò)增圖譜（部分示意圖）Fig.2 DNA detection and polymorphic finger prints detected by SSR primer of half-sib progenies,parents

續(xù)圖2Continuation of Fig.2

2.2.2 SSR 位點(diǎn)的非父排除率

由表4可知，當(dāng)雙親基因型未知時(shí)，單個(gè)SSR 位點(diǎn)的非父排除概率（NE-1P）平均為0.700，最高為SSR14，0.894，最低為SSR6，0.370；當(dāng)一個(gè)親本的基因型已知時(shí)，單個(gè)SSR 位點(diǎn)的非父排除概率（NE-2P）的變化范圍在0.227～0.821之間，平均值為0.540；當(dāng)雙親已知時(shí)，單個(gè)SSR 位點(diǎn)的非父排除概率（NE-PP）變化范圍為0.079～0.728 之間，平均為0.365。NA為等位基因數(shù)，HO為觀測雜合度，HE為期望雜合度；PIC為多態(tài)信息含量，NE-1P為在候選父本中隨機(jī)取樣，被排除為疑似父本的概率；NE-2P為當(dāng)母本已知時(shí)，在候選父本群體中隨機(jī)取樣，被排除為疑似父本的概率；NE-PP 為當(dāng)父本母本均已知的情況下，在候選父本群體中隨機(jī)取樣，被排除為疑似父本的概率。

2.2.3 半同胞子代幼苗優(yōu)株父本鑒定

篩選到的15 個(gè)SSR 位點(diǎn)用于50 個(gè)鐵心杉半同胞子代的父本鑒定，其結(jié)果見表5。10 個(gè)優(yōu)良母本子代幼苗優(yōu)株的基因型均未出現(xiàn)與對應(yīng)母本SSR 位點(diǎn)上相異的等位基因且在95%的置信水平下LOD 值均為正值，說明50 個(gè)子代在候選父本中均找到最似父本。

表5 鐵心杉50 個(gè)半同胞子代父本鑒定結(jié)果Table 5 Identification of male parents of 50 half-sib progenies of the black-heart wood Chinese fir

50 個(gè)半同胞子代幼苗優(yōu)株在候選父本中共鑒定出42 個(gè)唯一父本，42 個(gè)父本在50 個(gè)半同胞優(yōu)株中分布頻率如圖3所示，其中TXS-14 的繁殖貢獻(xiàn)率最高為6%，TXS-20、TXS-201、TXS-204、TXS-399、TXS-5 的繁殖貢獻(xiàn)率次之，為4%，其余均為2%（圖3）。

圖3 候選父本被鑒定為優(yōu)株父本的概率分析Fig.3 The frequency of the male plant identified as male parent

3 討 論

優(yōu)良親本不一定產(chǎn)生優(yōu)良子代，通過優(yōu)良親本雜交進(jìn)行林木育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而父本鑒定可以通過優(yōu)良子代追溯親本，降低了雜交工作的局限性，從而縮短育種進(jìn)程，優(yōu)良子代的篩選則為父本鑒定奠定基礎(chǔ)和提供材料[9]。本研究共獲得10株不同優(yōu)株鐵心杉3 576 個(gè)半同胞子代，并對半同胞株高、地徑、葉長、葉寬和葉面積進(jìn)行測量，利用R 語言對3 576 個(gè)半同胞子代的性狀進(jìn)行主成分降維分析，選取前3 個(gè)主因子的方差累積貢獻(xiàn)率可達(dá)97.93%，建立鐵心杉綜合性狀得分?jǐn)?shù)學(xué)模型，進(jìn)行綜合評價(jià)共篩選出50 株鐵心杉幼苗優(yōu)株。

本研究選用已發(fā)表的15 對SSR 引物對自然授粉的鐵心杉半同胞子代進(jìn)行父本鑒定。通常認(rèn)為，SSR 位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）小于0.25 時(shí)位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)，PIC 介于0.25～0.50 時(shí)為中度多態(tài)位點(diǎn)，PIC 大于或等于0.50 時(shí)為高度多態(tài)位點(diǎn)[33]。本研究所篩選出的15 對SSR 位點(diǎn)的PIC 值在0.356～0.876 之間，平均值為0.634，86.7%的位點(diǎn)為中高度多態(tài)位點(diǎn)，表明所篩選得到的SSR 位點(diǎn)能夠?qū)﹁F心杉半同胞子代進(jìn)行父本鑒定。利用CERVUS3.0 軟件計(jì)算已知母本情況下的LOD 值，50 株幼苗優(yōu)株在父本鑒定中LOD 均大于0，均能確定出唯一父本。雖然鐵心杉天然群體花粉傳播受很多因素的影響，但因?yàn)楸狙芯恳伤聘副拘畔⑤^全因此共鑒定出42 個(gè)唯一父本，其中TXS-14 的繁殖貢獻(xiàn)率最高為6%，TXS-20、TXS-201、TXS-204、TXS-399、TXS-5的繁殖貢獻(xiàn)率次之，為4%，其余均為2%。實(shí)驗(yàn)為10月份在野生天然林中采集鐵心杉種子，可以確定母本，但是卻無法確定母本周圍的候選父本是否具有產(chǎn)生花粉的能力，候選父本數(shù)量的增加，降低了父本鑒定率，因此本研究父本鑒定率（9.77%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于武星彤在紅豆杉和韓志強(qiáng)在楊樹父本鑒定的研究[21,34]，但本研究在鐵心杉天然群體中篩選出了配合力的母本10 株，父本42 株，共計(jì)50 個(gè)潛在高配合力雜交組合。

在自然授粉的情況下，杉木主要依靠風(fēng)力進(jìn)行傳粉，父本花粉的競爭力、花期一致性、親本在群體中的位置以及風(fēng)力和風(fēng)向等因素會(huì)影響基因交流及半同胞子代的產(chǎn)生[20,35-36]，因此所選優(yōu)株可能不能代表優(yōu)良雜交組合后代群體的全部表現(xiàn)。但是，通過選取已知優(yōu)良母本的優(yōu)良半同胞子代，從而鑒定父本來源，構(gòu)建鐵心杉優(yōu)良雜交組合，為鐵心杉親本群體構(gòu)建提供一種策略，進(jìn)而為鐵心杉種子園的營建、新品種的開發(fā)、利用和保護(hù)提供了理論依據(jù)，高配合力親本的篩選有利于鐵心杉的繁育。SNP[37-38]是第三代分子標(biāo)記，與SSR標(biāo)記相比，具有數(shù)量更多、分布更廣泛、遺傳穩(wěn)定性更高、易于快速進(jìn)行基因分型等優(yōu)點(diǎn)，其在群體擴(kuò)增、遺傳圖譜構(gòu)建方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景，另外一個(gè)R 包和生物信息管道已經(jīng)成功開發(fā)并應(yīng)用于基于SNP 的親子關(guān)系分析[39]。因此，開發(fā)合適的SNP 位點(diǎn)可作為今后鐵心杉分子標(biāo)記研究的重點(diǎn)，另外鐵心杉種資源配置和種子園營建時(shí)應(yīng)該充分考慮開花時(shí)氣候條件、花粉的有效傳播距離、親本植株間距離等因素，以期獲得子代的最高增益，實(shí)現(xiàn)鐵心杉異地保存。

本研究利用已發(fā)表的杉木EST-SSR 標(biāo)記對鐵心杉半同胞子代進(jìn)行父本鑒定，由于標(biāo)記數(shù)量不夠多等原因，這在一定程度上會(huì)影響父本鑒定結(jié)果，其結(jié)果存在與現(xiàn)有親緣關(guān)系不一致的問題[40-41]。因此，后續(xù)研究將專門利用鐵心杉幼苗材料開發(fā)EST-SSR 標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本研究在統(tǒng)計(jì)鐵心杉半同胞子代幼苗優(yōu)株生長特性的基礎(chǔ)上，通過主成分降維的方法和思想篩選得到10 株鐵心杉母本50 個(gè)半同胞子代幼苗優(yōu)株；利用已發(fā)表的15 對SSR 引物、453 個(gè)候選父母本對50 個(gè)優(yōu)株進(jìn)行父本鑒定，鑒定出42 個(gè)唯一父本，且最高父本繁殖貢獻(xiàn)率為4%，其余均為2%，共計(jì)得到50 個(gè)優(yōu)良雜交組合，完成了自然授粉狀態(tài)下鐵心杉半同胞子代優(yōu)株父本鑒定。