王洪海，尹依，劉星，魏斯文，蘇偉怡，李春利

（1 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130；2 化工節(jié)能過程集成與資源利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300130）

反應(yīng)精餾（RD）將反應(yīng)過程與分離技術(shù)耦合在一個(gè)裝置內(nèi)，是新型強(qiáng)化工藝技術(shù)[1]。在RD 中通常使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿作催化劑，但它們回收困難，而且可能造成嚴(yán)重污染[2]。生物酶具有環(huán)境友好性，近年來已廣泛用于替代傳統(tǒng)催化劑[3-4]。將酶催化應(yīng)用到反應(yīng)精餾中即為酶催化反應(yīng)精餾（ERD），這一工藝可以高效利用反應(yīng)精餾的優(yōu)勢，提升酶催化反應(yīng)的效率[5]，因此，ERD 具有提高酯化行業(yè)技術(shù)水平和經(jīng)濟(jì)效益的潛力[6]。

南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）是一種優(yōu)異的生物催化劑，不僅具有高活性、立體選擇性和操作穩(wěn)定性[7-8]，而且它的耐熱性較強(qiáng)，失活溫度可達(dá)50～60℃，然而，游離態(tài)CaLB 存在不穩(wěn)定、有機(jī)溶劑耐受性差、難以回收再利用等缺點(diǎn)[9]，限制了其應(yīng)用。近年來，研究者使用各種固定化酶的方法如共價(jià)結(jié)合、包埋、吸附和交聯(lián)等[10-11]，以提高酶的穩(wěn)定性、高效回收率和可重復(fù)使用性[12]。溶膠-凝膠包埋法不僅可以增強(qiáng)生物酶的穩(wěn)定性，而且能夠維持酶結(jié)構(gòu)，因此被廣泛應(yīng)用于ERD 工藝中[13]。例如，Heils 等[14]首次使用溶膠-凝膠法將酶固定在規(guī)整填料上并在RD 柱中催化酯交換反應(yīng)。因?yàn)镃aLB 被固定在硅烷前體經(jīng)過水解、縮聚而成的三維網(wǎng)絡(luò)中，所以在催化酯交換反應(yīng)過程中，外部基質(zhì)可以自由擴(kuò)散到硅凝膠的內(nèi)部發(fā)生催化反應(yīng)，同時(shí)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物擴(kuò)散至凝膠外部[15]。

溶膠-凝膠包埋法在ERD中的應(yīng)用已經(jīng)取得很大的進(jìn)步，但是，對凝膠材料穩(wěn)定性的研究仍存在一些挑戰(zhàn)，特別是凝膠材料質(zhì)地較脆，容易發(fā)生龜裂現(xiàn)象[16]，這將造成載酶涂層嚴(yán)重脫落，從而降低催化劑的循環(huán)使用性，增加工藝成本。生物催化劑的性質(zhì)取決于酶和載體材料，而凝膠配方各組分的相對含量直接影響凝膠基質(zhì)和酶的性能[17]。凝膠配方中的有機(jī)改性硅凝膠（MTMS）可以克服材料的脆性，增強(qiáng)凝膠的韌性，提高涂層的黏附力[18]，而且MTMS是含有機(jī)官能團(tuán)的疏水性硅膠，可以實(shí)現(xiàn)酶分子與SiO2網(wǎng)絡(luò)之間的特殊鍵合，從而有效保留酶的活性[19]。

塑料填料質(zhì)地輕、耐腐蝕、不易破裂、加工方便、價(jià)格低廉，與金屬填料相比，它更符合綠色化學(xué)理念。在新型填料開發(fā)和應(yīng)用的背景下，聚丙烯填料具有優(yōu)異的物理、化學(xué)性能，在中國已經(jīng)成為使用最廣泛的塑料填料之一[20-21]。在已有的研究中尚未發(fā)現(xiàn)使用塑料填料制備負(fù)載型催化填料的詳細(xì)研究，因此，本文選擇聚丙烯填料進(jìn)行固定化酶的初步研究。

在這項(xiàng)工作中，首次使用聚丙烯為原料的鮑爾環(huán)填料與溶膠-凝膠包埋法結(jié)合制備載酶塑料填料。選擇正丁醇（BuOH）與乙酸乙酯（EtAC）在70℃下的酯交換反應(yīng)作為模型反應(yīng)[22]。由于原配方[23]（本文作者課題組先前工作中使用的凝膠配方稱為原配方）制備的載酶涂層存在明顯的開裂情況，進(jìn)而對凝膠配方進(jìn)行優(yōu)化以適用于塑料填料。結(jié)果表明優(yōu)化后塑料載酶涂層開裂現(xiàn)象得以改善，通過黏附力表征、循環(huán)使用性以及酶學(xué)穩(wěn)定性測試結(jié)果得出載酶塑料填料有希望應(yīng)用于ERD工藝。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

主要試劑：乙酸乙酯，乙醇，正丁醇，甲醇，乙酸正丁酯，AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲基三甲氧基硅烷和聚乙二醇400，AR，上海阿拉丁試劑有限公司；正硅酸甲酯，AR，天津希恩思生產(chǎn)科技有限公司；氟化鈉，AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。南極假絲酵母脂肪酶B，諾維信公司。聚丙烯鮑爾環(huán)，填料直徑、高度分別為16mm、16mm，萍鄉(xiāng)市海川化工有限公司。所有化學(xué)藥品均為分析純，無需進(jìn)一步處理。

1.2 載酶填料的制備

在本文作者課題組先前研究[23]的基礎(chǔ)上優(yōu)化了溶膠-凝膠的配方且將金屬填料改為聚丙烯填料，基體制備過程如下。①交聯(lián)劑的配制：將一定質(zhì)量比的正硅酸甲酯（TMOS）、甲基三甲氧基硅烷（MTMS）和甲醇（MeOH）混合稱為A 液。②溶劑的配制：將一定質(zhì)量比的聚乙二醇（PEG400）、氟化鈉、去離子水、CaLB 酶液混合稱為B 液。③因?yàn)榍绑w水解過程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱，為了避免這一過程放出的熱對生物酶造成嚴(yán)重?fù)p害，所以先將A液和B 液分別在0℃冰水浴中攪拌冷卻1min，再將A液緩慢多次的倒進(jìn)B液中，混合液繼續(xù)在冰水浴中攪拌冷卻約3min。④將商用噴槍以恒定的速度從距離填料15cm 的高度Z 字形噴涂，噴射流量為1.82kg/h，噴射壓力為0.1bar（1bar=0.1MPa），為了防止噴槍的氣流噴除掉剛剛涂覆到填料表面的溶膠溶液，在噴涂過程中使用吹風(fēng)機(jī)輔助干燥。噴涂完成后，將其放置在室溫下干燥至恒定質(zhì)量，即得到載酶塑料填料，4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。制備過程如圖1所示。

圖1 載酶填料的制備過程

1.3 表征方法

利用荷蘭Philips公司的XL30-TMP型掃描式電子顯微鏡（SEM）分析配方優(yōu)化前后填料表面凝膠涂層的形貌及形態(tài)。

使用德國布魯克公司的VECTOR22 型傅里葉紅外光譜（FTIR）分析凝膠的化學(xué)組成。

用蘭州中科凱華科技開發(fā)有限公司的WS-2005 型自動(dòng)劃痕儀測量涂層的黏附性能。壓頭尖端的半徑為200μm、采用0～50N 的動(dòng)態(tài)載荷加載范圍、加載速度為0.5N/min，劃痕長度為4mm。在聲發(fā)射模式下，產(chǎn)生的第一個(gè)聲發(fā)射信號(hào)載荷值即為涂層黏附力數(shù)值。涂層的黏附強(qiáng)度用式(1)計(jì)算。

式中，F(xiàn)為第一聲發(fā)射信號(hào)所處載荷值，N；P為涂層的黏附強(qiáng)度，MPa；S為壓頭與涂層的接觸面積，m2。

在深圳新三思計(jì)量公司的CMT-6104型材料萬能試驗(yàn)機(jī)上使用10kN 傳感器進(jìn)行單軸壓縮試驗(yàn)，加載速度為2mm/min，測量凝膠的機(jī)械性能。

載酶填料分別放置于70℃下的間歇反應(yīng)體釜中，使用電動(dòng)攪拌器對反應(yīng)體系進(jìn)行攪拌，攪拌速率均為400r/min，使反應(yīng)釜中的載酶填料近似模擬精餾塔中反應(yīng)段的環(huán)境，反應(yīng)4 次（每次30min）測試載酶填料的循環(huán)穩(wěn)定性。

1.4 酶活力測試

本文使用水解活性的方法測定固定化酶和游離酶的酶活，利用酶催化4-硝基苯基棕櫚酸酯（p-NPP，5.0mg/mL）水解生成對硝基苯酚（p-NP）的原理。水解酶活的定義：在測試條件下，單位時(shí)間（1min）內(nèi)，釋放單位產(chǎn)物p-NP（1μL）所需要的酶量，定義為1U。具體的，在3mL 的磷酸緩沖液（PBS，0.1mol/L，pH7.5）中加入20mg 的固定化酶粉（或200μL 的游離酶），放置于37℃的集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上攪拌5min，隨后在上述緩沖溶液中加入200μL的p-NPP，在室溫條件下使用旋渦混合器將其震蕩30s保證混合均勻，再放回集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中持續(xù)反應(yīng)3min，迅速取出過濾得到上清液，利用紫外分光光度計(jì)在410nm 的波長處測量吸光值，根據(jù)上清液中p-NP的含量，計(jì)算固定化酶（或游離酶）的酶活。

1.5 蛋白固載率的測定

采用考馬斯亮藍(lán)[24]測定固定化酶CaLB 的蛋白含量，參考牛血清蛋白（BSA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析游離酶和固定化酶的磷酸鹽緩沖洗滌液中脂肪酶的含量，計(jì)算固定化之前游離酶的蛋白含量和固定化之后洗滌液中的蛋白含量，兩者的差值即為蛋白固載量。蛋白固載率的計(jì)算公式為式(2)。

式中，C0為原酶液的蛋白含量，mg/mL；C1為固定化后洗滌液中的蛋白含量，mg/mL。

1.6 催化效率

正丁醇（BuOH）和乙酸乙酯（EtAC）酯交換反應(yīng)在間歇反應(yīng)釜中進(jìn)行。向四口燒瓶中加入EtAC 和適量的催化劑，將BuOH 放入錐形瓶中，分別加熱至70℃，然后將BuOH 迅速加入燒瓶中。反應(yīng)在恒溫水浴中進(jìn)行5h[23]。在此期間，每30min取樣一次，通過氣相色譜（GC）分析評(píng)估BuOH的轉(zhuǎn)化率。（反應(yīng)條件：酯醇摩爾比為2∶1，催化劑質(zhì)量為正丁醇的10%。）

1.7 游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)測試

為了測試優(yōu)化后配方制備的固定化酶的酶學(xué)性能，對其熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性進(jìn)行了測定，與游離酶CaLB 進(jìn)行比較。將游離酶和固定化酶的初始活性均設(shè)定為100%，計(jì)算孵育后的酶活性。在每次測試之后，用大量緩沖溶液清洗，再測試另一個(gè)環(huán)境下的酶活性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次，以確保結(jié)果的可靠性。相對酶活的計(jì)算如式(3)。

（1）熱穩(wěn)定性測試

在70℃、pH 7.5 的PBS（0.1mol/L）緩沖溶液中共孵育8h，每2h 測量并計(jì)算殘留的酶活性，用以表征游離CaLB和固定化酶的熱穩(wěn)定性。

（2）有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測試

將含酶量相同的游離酶CaLB 和固定化酶分別放置在乙酸乙酯溶劑中，在室溫下孵育20h研究有機(jī)溶劑的耐受性，采用式(3)測試殘留酶活性。

（3）儲(chǔ)存穩(wěn)定性測試

將游離酶CaLB 和固定化酶在室溫下放置60天，相同時(shí)間間隔（每10 天）取出樣品測量并計(jì)算相對酶活性，以此來評(píng)估游離CaLB 和固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

（4）固定化酶的可重復(fù)使用性

為了研究此固定化酶在酯交換反應(yīng)中的重復(fù)使用性，分次反應(yīng)6 個(gè)周期（每次反應(yīng)2h）。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，通過抽濾、洗滌和干燥回收催化劑，然后用于新一輪的催化反應(yīng)。定義固定化酶反應(yīng)前的初始活力為100%，通過與初始活力比較來計(jì)算固定化酶的剩余活性，以此來評(píng)定固定化酶催化劑的重復(fù)使用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶膠-凝膠配方優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)初期，多次使用原配方噴涂至塑料填料表面制備載酶塑料填料，發(fā)現(xiàn)載酶涂層均存在明顯的開裂現(xiàn)象。這種開裂會(huì)降低載酶涂層與填料基體的結(jié)合強(qiáng)度，導(dǎo)致涂層嚴(yán)重脫落[25]，原因可能是凝膠基質(zhì)的脆性較大，在曲率較小的塑料填料表面開裂問題被放大，說明原配方不適合應(yīng)用于塑料基體。為了實(shí)現(xiàn)塑料填料固定化酶，提高總體經(jīng)濟(jì)效益，必須改善凝膠開裂問題。因?yàn)槟z配方各組分的相對含量直接影響凝膠基質(zhì)的性能，所以有必要優(yōu)化凝膠配方以改善凝膠基質(zhì)脆性，提高塑料載酶涂層的穩(wěn)定性。對凝膠配方的主要組分：硅烷前體甲基三甲氧基硅烷與正硅酸甲酯的質(zhì)量比（MTMS/TMOS）、CaLB、PEG400 和水的加入量進(jìn)行了研究。

2.1.1 硅烷前體的優(yōu)化

硅烷前體的比例對包埋酶的活性和凝膠結(jié)構(gòu)有很大影響?？疾霱TMS 與TMOS 的質(zhì)量比對固定化酶活性和蛋白固載率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。當(dāng)MTMS 與TMOS 的質(zhì)量比增大時(shí)，酶活性和固載率的比例先增大后減小，在質(zhì)量比為3.5∶1時(shí)達(dá)到最大值。在原凝膠配方中，MTMS 與TMOS 的質(zhì)量比為3∶1，這說明優(yōu)化后MTMS 的含量增加。凝膠基質(zhì)的疏水性取決于疏水性硅烷（MTMS）與親水性硅烷（TMOS）的比例，因此MTMS 的增加可以增強(qiáng)凝膠的疏水性；又因?yàn)橹久窩aLB 是一種界面活性酶，所以凝膠基質(zhì)的疏水性有利于維持分子構(gòu)象并增強(qiáng)酶的活性[26]；此外，TMOS 具有優(yōu)異的網(wǎng)絡(luò)形成能力[27]，若其相對質(zhì)量過高，在凝膠的干燥過程中可能會(huì)由于過度收縮導(dǎo)致涂層破裂和酶活性損失。因此，適當(dāng)增加MTMS的相對含量可改善材料的脆性且增強(qiáng)酶活性[13]。

圖2 硅烷前體對酶活和蛋白固載率的影響

2.1.2 游離酶添加量的優(yōu)化

酶的加入量是固定化過程中的關(guān)鍵因素，它直接影響固定化酶的“相對活性”[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，隨著CaLB 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶活提高，加入的酶幾乎被完全包埋，所以蛋白固載率基本不變；然而，當(dāng)CaLB 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于23%時(shí)，固定化酶CaLB 的活性幾乎保持不變，而蛋白固載率顯著降低。通常，隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)增加，酶與底物的結(jié)合效果更好[26]。但是，當(dāng)酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過一定量時(shí)，酶分子不能被完全包埋，容易產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象，導(dǎo)致酶活性和蛋白固載率下降。因此，選擇CaLB 的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為溶膠總質(zhì)量的23%。與原配方相比，優(yōu)化凝膠中包埋的酶數(shù)量有所增加。

圖3 游離酶添加量對酶活和蛋白固載率的影響

2.1.3 PEG400添加量的優(yōu)化

PEG400 具有良好的生物相容性，它可以先于脂肪酶吸附在凝膠材料的表面，減弱凝膠與脂肪酶之間的相互作用，更好地保持酶活性[26,28]；而且適量的PEG400 能調(diào)節(jié)凝膠的孔結(jié)構(gòu)。當(dāng)PEG400 含量低時(shí)，它對硅烷前體的水解和縮聚過程影響很小，僅起到分散劑的作用，不足以為凝膠制孔。當(dāng)PEG400 含量較高時(shí)，由于聚乙二醇鏈結(jié)構(gòu)在溶膠顆粒表面的包覆作用，溶劑層的厚度增加，因此無法使凝膠形成規(guī)則的孔道[28]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，隨著PEG400 含量的增加，固定化酶活性和蛋白固載率增加；然而，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.4%后，酶活性和蛋白固載率均呈下降趨勢。因此，PEG400 的添加量為溶膠總質(zhì)量的1.4%。適量的PEG400有利于形成均勻的孔隙分布，防止因孔坍塌導(dǎo)致涂層開裂[28]。

圖4 PEG400加入量對酶活和蛋白固載率的影響

2.1.4 水添加量的優(yōu)化

水的含量是影響凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)和包埋效果的另一重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，固定化酶的活性和蛋白固載率隨水加入量增加而逐漸增加，當(dāng)水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過12%時(shí)，固定化酶CaLB 的活性和蛋白固載率下降。水的加入量較低時(shí)，前體不能被完全水解，大量Si—OR 基團(tuán)的存在使得縮聚形成的Si—O—Si 網(wǎng)絡(luò)化程度很低，極易引起凝膠層開裂[19]，此外，水含量過低，在SiO2網(wǎng)絡(luò)形成過程中會(huì)發(fā)生醇縮合，不利于酶的固定化[29]；當(dāng)水含量過高時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)可以提供更多的微水環(huán)境，酶分子傾向于停留在水相中，這可能導(dǎo)致凝膠化過程的延長[19]，降低酶活性和蛋白固載率。因此，水的加入量被確定為溶膠總質(zhì)量的12%。

圖5 水的量對酶活和蛋白固載率的影響

2.2 優(yōu)化后硅凝膠的性能

使用優(yōu)化后的溶膠-凝膠配方，制備載酶塑料填料，并對其性能進(jìn)行表征。

2.2.1 SEM分析

使用優(yōu)化后的配方制備了載酶填料，通過SEM 圖可以觀察到填料表面凝膠涂層的形態(tài)。從圖6(a)可以看出，原配方制備的載酶涂層存在多處裂紋，而圖6(b)表明優(yōu)化后涂層幾乎沒有明顯的裂紋，說明配方優(yōu)化改善了凝膠的脆性開裂問題。證明優(yōu)化配方適用于塑料填料固定化酶。

圖6 塑料填料載酶涂層的SEM圖

2.2.2 紅外光譜分析

FTIR被廣泛應(yīng)用于分析樣品中官能團(tuán)的變化。圖7為優(yōu)化前后凝膠粉末的紅外光譜圖，新配方?jīng)]有添加或去除任何組分，因此官能團(tuán)數(shù)量沒有變化，僅峰面積發(fā)生變化。在波長1645cm-1和3412cm-1處對應(yīng)CaLB的—NH2伸縮振動(dòng)峰，兩處峰面積均變大表明凝膠網(wǎng)絡(luò)中包埋的酶量增加[30]。波長1411cm-1處的峰歸因于Si—CH3的拉伸振動(dòng)，Si—CH3是MTMS 的獨(dú)特官能團(tuán)，其峰變大，說明凝膠中MTMS相對含量增加。此外，硅烷前體的水解程度可以通過Si—O—C 的拉伸振動(dòng)來評(píng)估，該拉伸振動(dòng)對應(yīng)于1039cm-1的譜帶[31]，其峰面積變小，意味著硅烷前體的水解程度增加。從峰面積的變化可以看出，配方中各組分相對含量的變化對硅烷前體的水解、縮聚過程起促進(jìn)作用。

圖7 配方優(yōu)化前后凝膠粉末的紅外光譜圖

2.2.3 凝膠材料抗壓性

使用材料測試機(jī)對配方優(yōu)化前后制備的干凝膠的機(jī)械性能進(jìn)行測試[31]。通常，較低的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致凝膠涂層開裂[32]。測試結(jié)果如圖8所示，當(dāng)干凝膠經(jīng)壓縮時(shí)，應(yīng)力-應(yīng)變曲線以階梯式上升，在達(dá)到峰值后快速下降，此特征表明凝膠基質(zhì)是脆性材料，破壞模式為脆性斷裂[31,33]。在壓縮過程中，當(dāng)應(yīng)力達(dá)到5.79MPa時(shí)，原配方凝膠上出現(xiàn)明顯的斷裂現(xiàn)象，優(yōu)化后的凝膠僅出現(xiàn)少量微裂紋。結(jié)果表明配方優(yōu)化改善了凝膠材料的脆性，提高了凝膠的韌性[34]。

圖8 兩配方制備干凝膠的應(yīng)力應(yīng)變曲線

2.2.4 黏附強(qiáng)度

黏附強(qiáng)度是評(píng)估涂層性能的重要依據(jù)[35]。在聲發(fā)射模式中，涂層的黏附強(qiáng)度由劃痕斷裂產(chǎn)生的第一聲發(fā)射信號(hào)的載荷值表示。抗劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，原配方制備的載酶涂層在載荷值5.3N時(shí)開始被破壞，由式(1)計(jì)算可得，原配方涂層附著力為42.198MPa， 而優(yōu)化配方涂層附著力為48.169MPa。表明脆性問題的改善可以提高涂層與基體的黏附強(qiáng)度[34]，使載酶涂層與填料的附著力提高了14.2%。優(yōu)化配方制備的載酶填料與本文作者課題組先前使用的金屬載酶填料的黏附強(qiáng)度值相近[36]。因?yàn)榻饘佥d酶填料已成功進(jìn)行精餾實(shí)驗(yàn)[23]，所以塑料填料制備的載酶涂層有希望應(yīng)用于ERD工藝。

圖9 配方優(yōu)化前后載酶涂層的黏附強(qiáng)度

2.2.5 循環(huán)穩(wěn)定性

載酶填料的循環(huán)穩(wěn)定性不僅是評(píng)估催化劑工業(yè)應(yīng)用潛力的重要特征之一，而且決定精餾工藝的經(jīng)濟(jì)成本。為了進(jìn)一步表征載酶填料的穩(wěn)定性，將優(yōu)化前后兩配方制備的載酶填料在反應(yīng)釜中攪拌反應(yīng)，測試各循環(huán)反應(yīng)后的涂層損失率。載酶涂層從塑料填料上脫落的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖10所示，在反應(yīng)4次后，優(yōu)化配方載酶填料的質(zhì)量損失為18.66%，而原配方載酶涂層的損失為26.35%?？梢钥闯龈纳颇z開裂問題后，涂層與基體黏附強(qiáng)度提高，涂層脫落率降低，有利于提高精餾工藝的經(jīng)濟(jì)效益。

圖10 兩配方制備的載酶填料的循環(huán)穩(wěn)定性

2.2.6 催化效率

通過酶活性測試，得到游離CaLB 的酶活性為(510±17)U/g，原配方制備的固定化酶活性為(484±12)U/g，優(yōu)化后的酶活性為(496±11)U/g，可能是因?yàn)閮?yōu)化后被包埋酶的含量增加，酶活有一定提高。比較了兩配方制備的催化劑在間歇反應(yīng)釜中酯交換反應(yīng)的催化效率，結(jié)果如圖11 所示，雖然最終的平衡轉(zhuǎn)化率基本一致，但是原配方催化的反應(yīng)在240min 達(dá)到平衡，優(yōu)化后反應(yīng)在210min 平衡。因此，使用優(yōu)化配方制備的固定化酶催化劑具有更好的催化效果和酶活力。

圖11 配方優(yōu)化前后的催化效率對比

通過上述分析可以得出，配方優(yōu)化不僅提高了凝膠機(jī)械強(qiáng)度，改善了凝膠涂層開裂，減少了涂層的質(zhì)量損失，而且提高酶的活力和催化性能。接下來探討優(yōu)化配方制備的固定化酶的酶學(xué)穩(wěn)定性。

2.3 游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

生物酶催化劑的穩(wěn)定性在工業(yè)應(yīng)用中至關(guān)重要。當(dāng)固定化酶具備優(yōu)異的穩(wěn)定性和長效性時(shí)才能實(shí)現(xiàn)在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用[37]。在本研究中，采用熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和循環(huán)穩(wěn)定性來評(píng)估配方優(yōu)化后酶的固定化效果。

2.3.1 熱穩(wěn)定性

良好的熱穩(wěn)定性是工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性如圖12 所示，將初始酶活設(shè)為100%，在70℃、PBS 緩沖溶液中，隨著孵育時(shí)間的延長，固定化酶的相對酶活高于游離酶CaLB。孵育8h后，游離酶的相對酶活僅為8%，而固定化酶的相對酶活高達(dá)77%，表現(xiàn)出優(yōu)異的耐熱性。通常，在高溫下游離脂肪酶的蛋白結(jié)構(gòu)易被破壞[38]，酶在凝膠中的原位包埋有效阻止酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，從而保護(hù)酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，降低其變性程度，因此，固定化酶具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖12 游離酶和固定化酶在70℃環(huán)境下的熱穩(wěn)定性

2.3.2 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

將游離酶CaLB 和固定化酶浸泡在乙酸乙酯溶劑中，測定其有機(jī)溶劑耐受性。結(jié)果如圖13所示，隨時(shí)間延長相對酶活均降低，孵育20h后游離酶的相對酶活為51%，但固定化酶的相對酶活仍能維持在83%。這是因?yàn)榘窈竽z三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對CaLB 起了一定的保護(hù)作用，提高了酶的剛性并阻止了酶在惡劣條件下的構(gòu)象變化[39]，有機(jī)溶劑穩(wěn)定性明顯提高。

圖13 游離酶和固定化酶的有機(jī)溶劑耐受性

2.3.3 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

儲(chǔ)存穩(wěn)定性是固定化酶在工業(yè)應(yīng)用中的關(guān)鍵因素之一。將固定化酶和游離酶在室溫下放置一段時(shí)間，評(píng)定其儲(chǔ)存穩(wěn)定性，初始酶活定義為100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示，固定化酶在儲(chǔ)存60天后仍保持86%的相對活性，游離酶表現(xiàn)出更快的分解速度，相對酶活僅為53%，活性降低的原因主要有兩方面：①隨著時(shí)間延長，酶活性的自然喪失；②酶溶液可作為微生物的營養(yǎng)來源而被分解，因此，在儲(chǔ)存過程可能會(huì)發(fā)生自溶[40]。凝膠載體可以為酶提供適宜生存的孔結(jié)構(gòu)，不僅可以防止蛋白分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變，還會(huì)阻止環(huán)境中的微生物與酶蛋白接觸[39]。因此，固定化酶具有優(yōu)異的長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

圖14 游離酶和固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.3.4 重復(fù)使用性

以乙酸乙酯和正丁醇為底物測試各循環(huán)反應(yīng)的相對活性，研究固定化酶的可重復(fù)利用性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15 所示，隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，相對酶活逐漸降低，在循環(huán)反應(yīng)6次后，固定化酶的相對活性為67%，且活性趨于穩(wěn)定。表明此固定化酶具有較強(qiáng)的可重復(fù)使用性，為其在酶催化的工業(yè)應(yīng)用中降低成本。

圖15 固定化酶的重復(fù)使用性

3 結(jié)論

（1）本文首次使用塑料填料固定化酶，發(fā)現(xiàn)了凝膠載酶涂層的開裂現(xiàn)象。

（2）對凝膠配方進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果如下：硅烷前體（MTMS∶TMOS）的質(zhì)量比為3.5∶1；酶、PEG400、水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23%、1.4%、12%。

（3）通過優(yōu)化配方，改善了凝膠材料的脆性和涂層與填料之間的黏合強(qiáng)度，降低了涂層損失率，說明此配方制備的載酶塑料填料穩(wěn)定性較優(yōu)異，符合綠色可持續(xù)發(fā)展理念。證實(shí)了塑料填料固定化酶的可行性，為進(jìn)一步在ERD 中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

（4）測定了優(yōu)化配方制備的催化劑的酶學(xué)穩(wěn)定性，結(jié)果表明此固定化酶具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性及可重復(fù)利用性。