徐標(biāo) 李文華 吳威

武漢市第四醫(yī)院（華中科技大學(xué)附屬武漢普愛醫(yī)院）（武漢 430035）

肺缺血-再灌注損傷病理變化表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)通透性增高，進(jìn)而引起間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤、肺泡上皮細(xì)胞損傷及凋亡，最終導(dǎo)致肺水腫、通氣/換氣功能障礙，其發(fā)病機(jī)制可能與炎性介質(zhì)釋放增加等因素有關(guān)［1-3］。目前對肺缺血-再灌注損傷的防治研究手段單一、效果不佳且藥物防治研究多集中于“預(yù)防作用”，即在缺血期前給藥，然而在面對休克、心肺復(fù)蘇等危重癥救治過程中已經(jīng)發(fā)生肺缺血-再灌注損傷的病理生理狀態(tài)時(shí)如何治療，目前卻研究甚少，更缺乏多種治療方式聯(lián)合應(yīng)用的研究。近期研究表明迷走神經(jīng)電刺激可減輕急性肺損傷［4］，而納美芬可通過抑制TLR4 信號通路減輕肺缺血-再灌注損傷［5］。因此本研究將納美芬、迷走神經(jīng)電刺激聯(lián)合應(yīng)用于大鼠肺缺血-再灌注損傷模型，探討多種治療方式聯(lián)合應(yīng)用能否更有效地防治肺缺血-再灌注損傷及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級雄性SD 大鼠75 只，動(dòng)物許可證號：SCXK（鄂）2010-0009，體質(zhì)量（200±50）g，購自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在潔凈動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)自由攝食、飲水。飼養(yǎng)室溫度保持在20～25 ℃，相對濕度保持在50%～70%。

1.2 主要藥物、試劑與儀器鹽酸納美芬注射液（商品名：樂萌，成都天臺山制藥有限公司產(chǎn)品），規(guī)格：1 mL：0.1 mg，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20080645，批號：11210502161。兔抗大鼠強(qiáng)啡肽、κ受體、IL-17單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。BCA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。C9000光密度掃描儀（日本島津公司）。BL-420 型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立、分組與給藥將75 只大鼠隨機(jī)均分為5 組，每組15 只。（1）模型組：參考何義等［6］方法開胸游離左肺門后，夾閉左肺門45 min（肺組織由淡紅色變成暗紫紅色，表明缺血阻斷成功）后解除阻斷，觀察5 min 后肺組織膨脹、顏色恢復(fù)（表明肺組織循環(huán)再灌注成功），繼續(xù)再灌注3 h。（2）迷走神經(jīng)電刺激組：預(yù)先分離出左側(cè)頸迷走神經(jīng)，參照模型組方法于再灌注成功時(shí)進(jìn)行迷走神經(jīng)電刺激，頻率30 Hz，脈寬0.5 ms，電流1.0 mA，刺激總時(shí)間為30 min（方法參考文獻(xiàn)［7］），同步繼續(xù)再灌注肺組織3 h。（3）納美芬組：參照模型組方法于再灌注成功時(shí)即刻尾靜脈注射納美芬（15 μg/kg），余處理同模型組。（4）納美芬+迷走神經(jīng)電刺激組：預(yù)先分離出左側(cè)頸迷走神經(jīng)，參照迷走神經(jīng)電刺激組于再灌注成功時(shí)進(jìn)行迷走神經(jīng)電刺激，同時(shí)尾靜脈注射納美芬（15 μg/kg），余處理同模型組。（5）假手術(shù)組：只開胸游離左肺門，不行夾閉，在上述各組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射等體積生理鹽水及處死大鼠。各組大鼠于再灌注3 h 后經(jīng)右頸總動(dòng)脈采血留取血標(biāo)本后處死大鼠，留取左肺上葉組織待檢。

1.3.2 大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鋈〈笫髣?dòng)脈血標(biāo)本經(jīng)血?dú)夥治鰞x檢測動(dòng)脈血pO2值、pCO2值。

1.3.3 大鼠肺組織濕/干重（W/D）測定取左肺上葉組織，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后用濾紙吸干多余水分后稱重，計(jì)量為濕重（W）；置80 ℃恒溫箱，烘烤72 h 至恒重后稱重，計(jì)量為干重（D）；計(jì)算肺組織W/D。

1.3.4 大鼠肺組織病理學(xué)觀察將左肺上葉組織置于4%多聚甲醛中固定24 h 后切成5 μm 的石蠟切片，HE 染色后光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。

1.3.5 大鼠肺組織MPO 測定切取大鼠肺組織相應(yīng)部位0.5 × 0.5 × 0.5 cm3稱重，加入肺組織10倍重的生理鹽水，置入勻漿器中在冰水中勻漿。再以4 000 r/min 離心5 min，分別吸取0.1 mL 上清液按照MPO 測定試劑盒提供的方法測定MPO含量。

1.3.6 Western blot 檢測大鼠肺組織強(qiáng)啡肽、κ 受體、IL-17表達(dá)取大鼠肺組織100 mg/份，勻漿后加入適量組織蛋白裂解液，離心后吸取上清，按照BCA 蛋白定量試劑盒操作。樣品經(jīng)15%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素膜上。以1∶1 000 的兔抗大鼠強(qiáng)啡肽、κ 受體、IL-17 單克隆一抗4 ℃靜置孵育過夜，再以1∶15 000 過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育2 h，用ECL 試劑盒發(fā)光顯影，同時(shí)檢測GAPDH 的表達(dá)作為內(nèi)參對照。圖像經(jīng)掃描儀掃描，重復(fù)3 次。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)跡條帶灰度，測定并計(jì)算強(qiáng)啡肽、κ 受體、IL-17 與GAPDH 表達(dá)灰度的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 軟件行方差分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治黾胺谓M織濕/干重比值與模型組比較，迷走神經(jīng)電刺激組、納美芬組的濕/干重比值、動(dòng)脈血pCO2值均顯著降低，動(dòng)脈血pO2值顯著升高（P＜0.01）。與迷走神經(jīng)電刺激組比較，納美芬組濕/干重比值、動(dòng)脈血pCO2值、pO2值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與納美芬組、迷走神經(jīng)電刺激組比較，納美芬+迷走神經(jīng)電刺激組濕/干重比值、pCO2值均顯著降低，pO2值顯著升高（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治黾胺谓M織濕/干重比值Tab.1 Arterial blood gas analysis and lung tissue wet/dry weight ratio

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治黾胺谓M織濕/干重比值Tab.1 Arterial blood gas analysis and lung tissue wet/dry weight ratio

注：與模型組比較，aP ＜0.01；與迷走神經(jīng)電刺激組比較，bP ＞0.05，cP ＜0.01；與納美芬組比較，dP ＜0.01

2.2 大鼠肺組織病理變化模型組、迷走神經(jīng)電刺激組、納美芬組、納美芬+迷走神經(jīng)電刺激組均可見肺泡間隔破壞，部分肺泡萎陷，肺間質(zhì)水腫明顯、見炎癥細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出。假手術(shù)肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)無滲出。在病變程度和病變范圍上，納美芬+迷走神經(jīng)電刺激組比迷走神經(jīng)電刺激組、納美芬組明顯減輕（圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE×100）Fig.1 Pathological changes of lung tissue in each group（HE×100）

2.3 大鼠肺組織MPO 水平與模型組比較，迷走神經(jīng)電刺激組、納美芬組MPO 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與迷走神經(jīng)電刺激組比較，納美芬組MPO表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與納美芬組、迷走神經(jīng)電刺激組比較，納美芬+迷走神經(jīng)電刺激組MPO 表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），見表2。

2.4 大鼠肺組織強(qiáng)啡肽、κ受體、IL-17表達(dá)水平與模型組比較，納美芬組強(qiáng)啡肽、κ 受體、IL-17表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），而迷走神經(jīng)電刺激組強(qiáng)啡肽、κ 受體表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）、IL-17 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與迷走神經(jīng)電刺激組比較，納美芬組強(qiáng)啡肽、κ 受體表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）、IL-17 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與納美芬組、迷走神經(jīng)電刺激組比較，納美芬+迷走神經(jīng)電刺激組強(qiáng)啡肽、κ 受體、IL-17 表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），見圖2、表2。

圖2 各組大鼠肺組織強(qiáng)啡肽、κ 受體和IL-17 表達(dá)（Western blot）Fig.2 Expression of dynorphin，κ-receptor and IL-17 in lung tissue of rats in each group（Western blot）

表2 各組大鼠肺組織強(qiáng)啡肽及MPO、κ 受體、IL-17 表達(dá)水平Tab.2 Expression of dynorphin and MPO、κ-receptor and IL-17 in lung tissue of each group

表2 各組大鼠肺組織強(qiáng)啡肽及MPO、κ 受體、IL-17 表達(dá)水平Tab.2 Expression of dynorphin and MPO、κ-receptor and IL-17 in lung tissue of each group

注：與模型組比較，aP ＞0.05，bP ＜0.01；與迷走神經(jīng)電刺激組比較，cP ＜0.01，dP ＞0.05；與納美芬組比較，eP ＜0.01

3 討論

阿片肽與其受體的相互作用在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［8-9］。強(qiáng)啡肽是目前已知的活力最強(qiáng)的內(nèi)源性阿片肽，是κ 阿片受體的內(nèi)源性配體［10］。研究表明阿片肽與肺泡細(xì)胞表面受體結(jié)合后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肺泡—毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)通透性增高、肺間質(zhì)水腫［11］。阿片肽物質(zhì)與免疫細(xì)胞表面特定阿片肽受體結(jié)合后能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞活化增殖、釋放IL-17 等炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致細(xì)胞損傷［12］。MPO是多型核粒細(xì)胞的一種標(biāo)志性酶，其活性和組織中中性粒細(xì)胞的浸潤程度成正比，是反映中性粒細(xì)胞浸潤的可靠指標(biāo)［13］。IL-17 是一種強(qiáng)有力的中性粒細(xì)胞趨化及激活因子，可早期特異性地出現(xiàn)在炎癥部位［14］，在肺組織炎癥啟動(dòng)中發(fā)揮主要作用。在急性肺組織損傷過程中，IL-17可趨化巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量聚集、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生導(dǎo)致肺組織損傷，同時(shí)隨著肺組織損傷加重，肺組織中IL-17 表達(dá)明顯升高［15］。本研究發(fā)現(xiàn)肺缺血-再灌注損傷組大鼠肺泡組織炎癥反應(yīng)（表現(xiàn)為MPO、IL-17 表達(dá)水平明顯升高）、肺功能損害（表現(xiàn)為動(dòng)脈血pO2值下降、pCO2值升高）明顯加重，而肺組織中強(qiáng)啡肽及κ 受體表達(dá)水平亦明顯升高，表明肺組織中強(qiáng)啡肽與受體相互作用在肺缺血-再灌注損傷后介導(dǎo)粒細(xì)胞浸潤、促進(jìn)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。納美芬作為阿片肽受體拮抗劑可加速阿片肽物質(zhì)降解，經(jīng)納美芬處理后，肺組織中強(qiáng)啡肽水平明顯降低，κ 受體表達(dá)水平也隨之下降，炎癥反應(yīng)程度亦明顯減輕，推測納美芬抑制肺缺血-再灌注損傷的作用機(jī)制可能與加速強(qiáng)啡肽降解、抑制κ 受體表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。體內(nèi)膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）將神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)緊密聯(lián)系起來［16-17］。迷走神經(jīng)激活后傳出纖維釋放乙酰膽堿，直接或間接地作用于肺泡巨噬細(xì)胞的表面的α7n ACh R（膽堿能受體）［18］，抑制NF-κB等信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低炎癥因子的表達(dá)來減輕炎癥反應(yīng)。既往研究表明迷走神經(jīng)電刺激釋放乙酰膽堿可以降低IL-6 等炎性因子的表達(dá)從而控制炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，減輕肺組織損傷［19-20］。給予迷走神經(jīng)電刺激后，肺組織中強(qiáng)啡肽及κ 受體表達(dá)水平無顯著變化，但炎癥反應(yīng)程度明顯減輕（MPO、IL-17 表達(dá)水平明顯降低），推測迷走神經(jīng)電刺激可能通過CAP 來減輕缺血-再灌注損傷時(shí)肺組織中的炎癥反應(yīng)。將迷走神經(jīng)電刺激和納美芬聯(lián)合應(yīng)用后，肺組織中強(qiáng)啡肽及κ 受體表達(dá)水平、炎癥反應(yīng)程度較之單獨(dú)應(yīng)用納美芬出現(xiàn)明顯下降，表明聯(lián)合應(yīng)用迷走神經(jīng)電刺激可以增強(qiáng)納美芬降解強(qiáng)啡肽、抑制炎癥反應(yīng)的作用，推測肺組織內(nèi)膽堿能抗炎通路與阿片肽—受體炎癥通路可能存在交叉、級聯(lián)反應(yīng)，具體過程尚需進(jìn)一步研究。本研究表明迷走神經(jīng)電刺激與納美芬聯(lián)合應(yīng)用于防治肺缺血-再灌注損傷可產(chǎn)生協(xié)同、增效作用，鑒于目前國外已出現(xiàn)體表外的頸部迷走神經(jīng)電刺激儀器［20］，若能在臨床上將物理療法與藥物治療結(jié)合起來，多種方式聯(lián)合應(yīng)用防治肺缺血-再灌注損傷，有利于克服單一療法的效果局限，發(fā)揮各自優(yōu)勢，其應(yīng)用前景將進(jìn)一步廣闊。