謝 輝，祁芝珍，楊曉艷，趙海紅，劉中凱，李 勝，張 琪

(青海省地方病預(yù)防控制所，青海 西寧 811602)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，能否應(yīng)用于鼠疫現(xiàn)場(chǎng)觀點(diǎn)不一，本研究擬考察環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)鼠疫實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的敏感性及檢測(cè)時(shí)間，探討在鼠疫流行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用LAMP技術(shù)的可行性。現(xiàn)將有關(guān)研究情況報(bào)告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

試劑及儀器：LAMP引物由北京擎科生物有限公司合成，Loopamp?朗報(bào)?DNA擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)98004)、Loopamp熒光目視檢測(cè)試劑盒(批號(hào)98002)由北京成志科為生物科技有限公司提供；鼠疫膠體金免疫層析試紙(批號(hào)202001)由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)吧管(批號(hào)2018-1)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；恒溫水浴箱ZC-22Q由杭州卓馳儀器有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠、 豚鼠、大耳白兔由重慶鵬鑫生物科技有限公司西安分公司提供。

培養(yǎng)基：赫氏培養(yǎng)基由青海省地方病預(yù)防控制所培養(yǎng)基室提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物感染

1.2.2 鼠疫耶爾森菌反向血凝試驗(yàn)(RIHA)：

分別取制備的臟器懸液，按照鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)[1]方法進(jìn)行反向血凝試驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)菌檢測(cè)

按照鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)方法進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)。

1.2.4 鼠疫膠體金免疫層析法(RGICA)試驗(yàn)

按1.2.1方法制備臟器懸液取上清液200 μL加入膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)孔內(nèi)，15 min后觀察結(jié)果：見(jiàn)兩條顯色帶視為陽(yáng)性結(jié)果，僅見(jiàn)一條顯色帶視為陰性結(jié)果。同時(shí)做空白對(duì)照。

1.2.5 模板制備

采用煮沸法，取動(dòng)物臟器懸液于100 ℃水浴加熱10 min，離心(12000r/min)取上清液作為DNA模板。將模板置-20 ℃冰箱保存。

1.2.6 鼠疫耶爾森菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)試驗(yàn)

引物合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank登錄號(hào)AF350075)公布的鼠疫耶爾森菌3a基因序列，用Priner Explorer version 4在線軟件設(shè)計(jì)LAMP引物，包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP以及相應(yīng)的環(huán)引物(表1)。模板制備方法同1.2.5所示方法。

表1 引物序列

LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：反應(yīng)體系(25μL)包括：2×Reaction Mix.(12.5μL)、混合引物(1μL。引物濃度：F3、B3為5pmol/μL，BIP、FIP為40pmol/μL)、Bst DNA聚合酶(1μL)、DNA模板(2μL)、熒光染料(1μL)、滅菌純水(補(bǔ)至25μL)；使用恒溫水浴加熱(65℃)1 h。

2.結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果

LAMP檢出率為100%，檢測(cè)時(shí)間為1 h，細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)檢出率為100%，檢測(cè)時(shí)間最短需24 h，RIHA檢出率低于細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間為2 h，RGICA檢出率最低，檢測(cè)時(shí)間為15 min(表2)。

表2 各類(lèi)動(dòng)物材料檢測(cè)結(jié)果

2.2 敏感性結(jié)果

表3 LAMP與RIHA法檢測(cè)動(dòng)物材料的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

1～12是不同稀釋度(40～81920)的LAMP可視化結(jié)果；13是陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果；14～15是陰性對(duì)照結(jié)果

3.討論

為考察LAMP檢測(cè)鼠疫實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的敏感性及檢測(cè)時(shí)間，探討在鼠疫流行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用LAMP技術(shù)的可行性，我們?cè)谘芯渴笠呔拿舾行院吞禺愋曰A(chǔ)上[2-3]，對(duì)本研究目的進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)探索。RIHA試驗(yàn)是目前應(yīng)用廣泛的鼠疫診斷方法之一，資料表明該方法最低檢菌量是2.5～5萬(wàn)個(gè)菌/mL[4]，RGICA 是6萬(wàn)個(gè)菌/mL[5]，當(dāng)菌量低于2.5萬(wàn)個(gè)菌/mL時(shí)RIHA、RGICA檢不出陽(yáng)性結(jié)果，LAMP的最低檢菌量是20個(gè)菌/mL[2]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP法檢測(cè)各種動(dòng)物臟器的陽(yáng)性符合率為100%，LAMP 檢出率優(yōu)于RIHA、RGICA。本試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果呈綠色，陰性對(duì)照結(jié)果為桔紅色，肉眼觀察結(jié)果清晰，易判斷。

從檢測(cè)時(shí)間來(lái)看，細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)在材料新鮮情況下可做檢測(cè)且檢測(cè)時(shí)間最短(24h)，而腐敗材料或患者用過(guò)抗生素，則不能對(duì)突發(fā)的鼠疫疫情做出快速判定；RIHA試驗(yàn)受反應(yīng)溫度等條件制約，結(jié)果判定依賴(lài)檢驗(yàn)人員專(zhuān)業(yè)層次及累積經(jīng)驗(yàn)因素的限制，最快的結(jié)果需2 h；RGICA檢測(cè)時(shí)間最短(15min)，其方法是采用鼠疫單克隆抗體作為探針，捕捉特異性的FI抗原[6]，具有較強(qiáng)的特異性，但敏感性不高，易漏診[7]；LAMP法的特點(diǎn)在于不需要特殊儀器設(shè)備，在1 h內(nèi)即可觀察結(jié)果，結(jié)果直觀可靠，適合在野外疫區(qū)快速診斷。

本研究結(jié)果顯示，LAMP技術(shù)具有高度敏感性，1 h內(nèi)肉眼可判讀結(jié)果，在鼠疫流行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用LAMP技術(shù)具有可行性。