田懷香，陳 霜，陳小燕，于海燕，黃 娟，袁海彬，陳 臣

不同提取方式對萱草花中酚類物質(zhì)及抗氧化活性的影響

田懷香，陳 霜，陳小燕，于海燕，黃 娟，袁海彬，陳 臣※

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精化妝品學(xué)部，上海 201418）

為了研究超聲、酶解-超聲以及發(fā)酵-超聲3種不同提取方式對萱草花中酚類物質(zhì)的含量、組成形態(tài)及抗氧化活性的影響，以明黃、桔黃、桔紅、朱紅、大紅5種顏色的萱草花為原料，檢測不同萱草花中總黃酮和總多酚含量以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除率；利用高效液相色譜對游離態(tài)、共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)3種形態(tài)酚類化合物進行測定，并研究其與抗氧化活性的關(guān)系。結(jié)果表明，不同顏色的萱草花中總黃酮和總多酚含量各不相同，其含量從高到低排列為：“紅鸚鵡”、“63#”、“健壯力蘭”、“玫瑰犀?！?、“太陽舞”。不同品種和不同提取方式的萱草花抗氧化性均存在顯著（<0.05）差異，發(fā)酵-超聲提取方式下“紅鸚鵡”、“63#”、“健壯力蘭”、“玫瑰犀?！?、“太陽舞”對DPPH自由基清除率的維生素C當量分別為44.32、40.63、38.24、37.64、35.60 mg/g，對ABTS自由基清除率的維生素C當量分別為39.74、36.24、30.88、28.38、24.88 mg/g；“紅鸚鵡”對DPPH清除率的維生素C當量由超聲時的38.24 mg/g升高到酶解-超聲后的41.49 mg/g和發(fā)酵-超聲后的44.32 mg/g；對ABTS自由基清除率的維生素C當量由超聲時的31.82 mg/g上升到發(fā)酵-超聲后的39.74 mg/g和酶解-超聲時的35.12 mg/g；可知發(fā)酵-超聲提取下萱草花的抗氧化性優(yōu)于酶解-超聲和超聲。在萱草花酚類物質(zhì)的3種形態(tài)中，游離態(tài)含量最高，占總含量的75%以上；經(jīng)酶解和發(fā)酵后顯著（<0.05）提高了“紅鸚鵡”中大部分游離態(tài)酚類化合物的含量，新檢出了對香豆酸，發(fā)酵后游離態(tài)槲皮素含量是超聲提取時的3倍；游離酚的DPPH和ABTS自由基清除率的維生素C當量分別從超聲時的40.53和35.57 mg/g升高到了發(fā)酵-超聲時的48.20和47.40 mg/g。游離態(tài)中的綠原酸、蘆丁、咖啡酸和槲皮素與抗氧化活性相關(guān)性高，對抗氧化活性貢獻大。研究為萱草花在食品和化妝品的開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

提??；酚類物質(zhì)；萱草花；抗氧化活性；游離酚

0 引 言

萱草（L.），別名黃花菜、金針花、忘憂草等，植物隸屬百合科，屬于多年生草本植物[1]。萱草花是萱草屬植物萱草的花蕾，其營養(yǎng)價值較高，其根、莖、葉、花均可入藥，在中國已有三千多年的食用歷史[2]。有研究測定，每百克萱草花（干質(zhì)量）中含有質(zhì)量分數(shù)為60%的碳水化合物、14%的蛋白質(zhì)、0.4%的脂肪以及豐富的鐵、鈣、磷等微量元素和胡蘿卜素[3]。萱草花中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多酚、類黃酮、生物堿、蒽醌等，具有抗氧化、抗抑郁、抗癌等作用[4]。其中，多酚作為一種重要的活性物質(zhì)，可以阻止細胞的退化、衰老，有效清除體內(nèi)的自由基[5]。研究萱草花中酚類物質(zhì)提取工藝和分析檢測抗氧化成分，有利于開發(fā)萱草花中生物活性物質(zhì)資源，可提高萱草花利用率，促進萱草花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，已有大約8 000種酚類物質(zhì)從植物中被分離鑒定出來，其中黃酮類化合物屬于低分子量的酚類物質(zhì)[6]。酚類物質(zhì)的常用提取方法為超聲波提取法。楊婉對超聲輔助提取美藤果殼酚類物質(zhì)的工藝條件進行了研究，酚類物質(zhì)的提取率可達54.10 mg/g[7]。在本課題組前期研究中，利用超聲提取萱草花中的類黃酮，提取率為36.25 mg/g[8]，前期只研究了超聲提取的萱草花中的類黃酮的效果，沒有對比更多的提取方式對類黃酮提取率的影響。超聲法簡便、效率高，但存在活性物質(zhì)無法全部提取出來的問題，因此利用酶解和微生物發(fā)酵技術(shù)耦合超聲提取可提高生物活性成分的含量，是近年來植物提取技術(shù)中新的研究方向。酚類物質(zhì)在植物中，通常以游離態(tài)、共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)形式存在，通過酶解和發(fā)酵可以使共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)向游離態(tài)進行轉(zhuǎn)變[9]。劉皓涵等[9]研究了歐李多酚超聲輔助酶解提取工藝，在最佳提取條件下多酚提取量為42.63 mg/g。利用微生物發(fā)酵的方法，發(fā)酵過程中產(chǎn)生酚酸脫羧酶、去羥酶等會削弱共軛、結(jié)合的酚類物釋質(zhì)與細胞壁之間的醚鍵，增加游離態(tài)酚類物質(zhì)的含量及其的活性[10-12]。在Ricci等[13]的研究中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌在櫻桃汁發(fā)酵中，促進了底物中幾種酚類化合物的代謝轉(zhuǎn)化，游離酚含量和抗氧化性明顯增強。然而，目前的文獻中尚未有采用微生物發(fā)酵法輔助花類植物中多酚類物質(zhì)提取的報道，因此考察發(fā)酵處理花類植物對其多酚類物質(zhì)及抗氧化活性的影響有助于推動花類植物生物活性物質(zhì)領(lǐng)域的研究。

萱草花種類繁多，筆者課題組前期對20種萱草花的類黃酮成分進行分析檢測，證明了不同品種的萱草花中類黃酮含量存在顯著差異[14]。然而，目前關(guān)于萱草花的研究主要集中在藥理方面，對萱草花中酚類物質(zhì)的提取方式，酚類物質(zhì)的形態(tài)及其抗氧化活性的研究較少。基于此，本研究采用超聲、酶解-超聲和發(fā)酵-超聲3種方式提取5種萱草花中酚類物質(zhì)，通過總黃酮和總多酚含量以及DPPH（1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS((2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid)，2,2'-聯(lián)氮-雙- 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))自由基清除率的測定來比較不同品種的抗氧化活性；對較佳活性的萱草花品種提取3種形態(tài)的酚類物質(zhì)，探究萱草花中酚類物質(zhì)的組成與含量和抗氧化活性的關(guān)系。本研究旨在探究萱草花中酚類物質(zhì)的不同提取方式對抗氧化活性及其成分組成的影響，同時評價不同萱草花品種抗氧化活性的大小，為萱草花在功能食品和化妝品的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萱草花，選用明黃、桔黃、桔紅、朱紅、大紅5種色系的萱草花品種“太陽舞”、“玫瑰犀?！薄ⅰ敖蚜μm”、“63#”、“紅鸚鵡”為原料（2020年5—7月采摘于上海市新優(yōu)園林植物繁育基地），為了避免其發(fā)生氧化褐變，采摘萱草花后，去除花柄、花蕊，迅速將花瓣放入真空冷凍干燥機速凍，凍干后粉碎，過100目篩，自封袋保存，置于干燥器中儲存?zhèn)溆?；植物乳桿菌ST-III（光明乳業(yè)股份有限公司）。

色譜級蘆丁、兒茶素、異槲皮苷、表兒茶素、槲皮素、山奈酚、沒食子酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、對香豆酸，上海源葉生物技術(shù)有限公司；纖維素酶（50 000 u/g）、果膠酶（>50 000 u/g）、葡萄糖、蛋白胨、色譜級甲酸、甲醇、乙腈和分析級蘆丁、沒食子酸、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、福林酚、檸檬酸、檸檬酸鈉、維生素C、乙醇，上海探索平臺試劑公司；分析級1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid)，ABTS），上海國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity和DAD檢測器高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；SB-5200DTD 超聲水浴鍋，寧波新芝生物科技有限公司；UV-2000紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；FD-2C真空冷凍干燥機，上海比郎儀器制造有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；粉碎機，青州市新航機械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲提取萱草花中酚類物質(zhì)

參考于海燕等[8]的方法略作修改。稱取2.0 g萱草花粉末，按照1∶25（質(zhì)量比）的料液比加入體積分數(shù)70%的乙醇，在50 ℃、300 kHz條件下超聲提取兩次，每次30 min，過濾，合并兩次的濾液離心，取上清液備用。

1.3.2 酶解-超聲提取萱草花中酚類物質(zhì)

參考Bei等[15]的方法略作修改。稱取2.0 g萱草花粉末，按照1∶25的料液比加入70%乙醇，加入3%的纖維素酶和2%的果膠酶，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至4.8，在溫度為45 ℃下酶解40 min，85 ℃水浴滅酶10 min，放置至25 ℃后，其余操作同超聲處理。

1.3.3 發(fā)酵-超聲提取萱草花中酚類物質(zhì)

1）菌懸液制備

植物乳桿菌ST-III于-84 ℃保存在含有10%（體積分數(shù)）甘油的MRS（De Man，Rogosa and Sharpe）液體培養(yǎng)基中。試驗時平板活化后挑取單一菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12～14 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩代。而后參照GB 4789.2—2016[16]的平板計數(shù)法配制活菌數(shù)為1.5×109CFU/mL的菌懸液。

2）萱草花發(fā)酵-超聲處理

參考文獻[12]的方法略作修改。稱取2 g萱草花粉末，按照1∶10的料液比加入20 mL去離子水制成萱草花漿，加入4%的葡萄糖和2%的蛋白胨，然后在121 ℃下滅菌15 min，按照3%比例接種植物乳桿菌ST-III，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵后的萱草花按照1∶25的料液比加入70%的乙醇，其余操作同超聲處理。

3）菌落計數(shù)及pH值的測定

采用平板計數(shù)法測定植物乳桿菌ST-III發(fā)酵萱草花過程中的活菌數(shù)[16]，采用pH計測定萱草花發(fā)酵過程中的pH值。

1.3.4 3種酚類組分的提取

游離酚、共軛酚、結(jié)合酚的提取參考Bei等[15]的方法略作修改，3種酚類物質(zhì)的提取方式及操作步驟如圖1所示。

1）游離酚的提取

參考Bei等[15]的方法略作修改。準確稱取2 g萱草花粉末，按照1∶25的料液比加入70%的乙醇，50 ℃、300 kHz超聲30 min，提取兩次，過濾離心，得到上清液，將乙醇用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉，得到剩下的溶液，再用12 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0，然后加入30 mL的乙酸乙酯，萃取3次，取上層清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃蒸干，然后用甲醇溶解，定容至10 mL，0.22m有機濾膜過濾后，待測。

2）共軛酚的提取

參考Bei等[15]的方法略作修改。在用乙酸乙酯提取游離酚之后，共軛酚從剩下的水相中提取。將水相用40 mL 2 mol/L NaOH堿水解4 h，然后用12 mol/L HCl調(diào)pH值至2，然后加入30 mL的乙酸乙酯，萃取3次，取上層清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃蒸干，然后用甲醇溶解，定容至10 mL，0.22m有機濾膜過濾后，待測。

3）結(jié)合酚的提取

參考Bei等[15]的方法略作修改。將1）中過濾得到的殘渣用40 mL 2 mol/L NaOH堿水解4 h，再用12 mol/L HCl酸化調(diào)節(jié)pH值至2.0。然后加入30 mL的乙酸乙酯，萃取3次，取上層清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃蒸干，然后用甲醇溶解，定容至10 mL，0.22m有機濾膜過濾后，待測。

4）總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定方法參考Liu等[17]方法并做適當修改。取0.3 mL樣液，加入1.5 mL去離子水和90L5%的NaNO2溶液，振蕩均勻后室溫下反應(yīng)6 min，然后加入180L10%的AlCl3·6H2O溶液，靜置5 min后加入0.6 mL1mol/L的NaOH溶液，最后用去離子水補足到3 mL，用紫外分光光度計于510 nm下測得其吸光值。同時以蘆丁為標準品，測得不同濃度下的吸光值，得到標準曲線，1=0.003 91+ 0.002 5 (2=0.999 4)，其中1為蘆丁質(zhì)量濃度（g/mL)，1為吸光值?？傸S酮含量結(jié)果以每克發(fā)酵萱草花中所含的蘆丁當量（mg/g）表示，單位為mg/g，試驗重復(fù)3次。

5）總多酚含量測定

測定方法參考Dewanto等[18]并作適當修改，取125L樣品溶液，加入0.5 mL去離子水和125 μL福林酚試劑，混合均勻，室溫下靜置6 min，然后加入1.25 mL 7%的Na2CO3溶液和1 mL的去離子水，振蕩均勻后在室溫下避光反應(yīng)90 min，最后用紫外分光光度計在760 nm的波長下測得其吸光值。以沒食子酸為標準品，測得不同濃度下的吸光值，然后制作標準曲線，2=0.005 42+0.006 7（2=0.999），其中2為沒食子酸質(zhì)量濃度（g/mL），2為吸光值?？偡雍拷Y(jié)果以每克萱草花中所含的沒食子酸當量表示，單位為 mg /g，試驗重復(fù)3次。

1.3.5 液相色譜條件及測定方法

參考Kao等[2]方法，使用美國Agilent 1260 Infinity-高效液相色譜儀：色譜柱為反相HC-C18（4.6 mm×250 mm，5m）（美國安捷倫公司）。測定條件：柱溫為30 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速為0.4 mL/min；進樣體積為10L；波長280 nm；洗脫程序如表1所示。

表1 液相色譜洗脫程序表

1.3.6 抗氧化活性的測定

1）DPPH自由基清除率的測定

在試管中加入2.0 mL DPPH溶液（2.0×10-4mol/L），再分別加入2.0 mL不同濃度的萱草花提取液或者維生素C溶液，充分混勻[19]。室溫避光放置30 min后在517 nm處測定各組吸光度1（重復(fù)3次）[19]，以無水乙醇為空白對照組在517 nm處測定吸光度2，對照組用無水乙醇代替樣品液，吸光度記為3。同時以維生素C為陽性對照，DPPH自由基清除率的計算公式如下

2）ABTS自由基清除率的測定

將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合均勻，混合液在室溫避光下，靜置12～16 h，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值7.4）或95%乙醇稀釋40～50倍，使其在734 nm處吸光度達到0.70±0.02，將100L樣液加入200L ABTS自由基反應(yīng)液中，在734 nm處測定吸光度為1’[20]；同理，將200L ABTS工作液與100L乙醇混合測得吸光度為2'，同時以維生素C為陽性對照，ABTS自由基清除率的計算公式如下

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

不同樣品的抗氧化活性由每克萱草花（干質(zhì)量）的維生素C當量來表示，維生素C當量是由維生素C的IC50除以萱草花的IC50得出，而IC50值是通過Origin9.0軟件做出線性模擬之后求得。利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（ANOVA）中的鄧肯分析方法研究樣品間的顯著性差異（<0.05）；酚類物質(zhì)的組成和含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析采用SPSS中的Person相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方式對萱草花中總黃酮和總多酚含量的影響

如圖2所示，不同色系的萱草花中總黃酮和總多酚含量各不相同，其中，酚類物質(zhì)含量從高到低排列為：“紅鸚鵡”、“63#”、“健壯力蘭”、“玫瑰犀?！?、“太陽舞”。隨著萱草花顏色的加深，其酚類物質(zhì)含量也越來越多，這與孫澤飛[21]的研究牡丹花中深色花瓣的多酚含量高于淺色的花瓣結(jié)果類似。

“紅鸚鵡”酶解后總黃酮和總多酚含量分別達到52.01 mg/g、30.20 mg/g，而發(fā)酵后總黃酮和總多酚最高含量分別達到57.71 mg/g、34.10 mg/g，較僅超聲提取增加了10%～15%，表明酶解和發(fā)酵可以顯著（<0.05增加酚類物質(zhì)的提取含量。在相似的研究中，孟永海等[22]采用纖維素酶協(xié)同超聲波技術(shù)提取刺玫果中的總黃酮，得到的總黃酮含量為126.00 mg/g，是無酶超聲提取的1.30倍，酶解過程中，果膠酶可以使細胞間的果膠質(zhì)降解，把細胞從組織內(nèi)分離出來，纖維素酶可以將纖維素水解成水溶性糖，使細胞壁水解破裂，而超聲波振蕩可引起細胞振蕩，細胞內(nèi)物質(zhì)運動、細胞漿流動，從而使細胞壁變薄[23]，有利于溶劑與植物細胞內(nèi)部的相互滲透，增加了有效成分在溶劑中的溶解，從而使更多的酚類物質(zhì)溶出來；Lizardo等[24]采用植物乳桿菌和干酪乳桿菌共同發(fā)酵櫻桃漿果，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵后總多酚含量由2.03 mg/g增加到3.78 mg/g，總黃酮含量由0.11 mg/g增加到0.66 mg/g。研究表明，植物乳桿菌產(chǎn)生的酚酸脫羧酶、去羥酶等會削弱共軛、結(jié)合的酚類物質(zhì)釋放與細胞壁之間的醚鍵，使酚類物質(zhì)更容易提取出來。上述研究皆與本研結(jié)果類似。

2.2 不同提取方式對萱草花抗氧化活性的影響

測定5種萱草花經(jīng)3種提取方式后的DPPH和ABTS自由基清除率。由表2可知3種提取方式對應(yīng)的萱草花抗氧化性大小為：發(fā)酵-超聲、酶解-超聲、超聲。DPPH自由基清除率最高的品種“紅鸚鵡”的維生素C當量由超聲時的38.24 mg/g升高到發(fā)酵-超聲后的44.32 mg/g，上升了15.90%（<0.05）；而酶解-超聲后上升到41.49 mg/g，比單獨超聲上升了8.50%（<0.05）?！凹t鸚鵡”的ABTS自由基清除率的維生素C當量由超聲時的31.82 mg/g上升到發(fā)酵-超聲后的39.74 mg/g和酶解-超聲時的35.12 mg/g，比單獨超聲組分別上升了24.89%和10.37%（<0.05）。結(jié)果表明，酶解和發(fā)酵都可以顯著（<0.05）提高萱草花的抗氧化活性，發(fā)酵-超聲提取后對DPPH和ABTS自由基清除效果更好。與Kusznierewicz等[25]研究一致，明串珠菌發(fā)酵卷心菜后，其總酚含量相比發(fā)酵前增加3倍，其DPPH自由基清除能力在發(fā)酵后也增加3倍。Chen等[26]研究了擠壓和發(fā)酵后的脫脂米糠的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后米糠的氧自由基抗氧化（oxygen radical antioxidant capacity，ORAC）和細胞抗氧化（cellular antioxidant activity，CAA）的活性都有所提高，而擠壓對CAA活性沒有影響。

2.3 不同提取方式對“紅鸚鵡”中三種酚類形態(tài)中黃酮和多酚含量的影響

在植物酚類的多種形態(tài)中，游離酚主要存在于植物細胞液泡中；結(jié)合態(tài)酚類可分為不可溶性結(jié)合酚和可溶性共價結(jié)合酚[27]即共軛酚，不可溶性結(jié)合酚主要通過酯鍵與細胞壁中木聚糖側(cè)鏈上一些糖殘基相連而結(jié)合，可溶性結(jié)合態(tài)主要與長鏈醇類、長鏈脂肪酸、甘油等可溶性物質(zhì)相結(jié)合[28]。大量研究表明，在3種形態(tài)的酚類物質(zhì)中，其活性按從大到小的順序為：游離酚、共軛酚、結(jié)合酚[29-31]。

表2 五種萱草花在三種提取方式抗氧化活性

注：同列不同的上標小寫字母表示存在顯著差異（<0.05）。

Note: The values marked with different upper subscript lowercase letters indicate that there are significant differences in the same column (< 0.05).

萱草花“紅鸚鵡”品種在超聲、酶解-超聲、發(fā)酵-超聲3種方式下得到的游離態(tài)、共軛態(tài)以及結(jié)合態(tài)的黃酮和多酚含量如圖3所示。在3種形態(tài)中，游離態(tài)的黃酮和多酚含量最高，占總含量的75%以上。在酶解時，游離態(tài)的黃酮和多酚含量由超聲時的12.18、6.49 mg/g增加到酶解-超聲時的13.48、7.5 mg/g，分別上升了10.67%和15.56%（<0.05），對應(yīng)地，結(jié)合態(tài)的黃酮和多酚含量由超聲時的3.49、0.34 mg/g降低到酶解-超聲時的3.04、0.26 mg/g，分別減少了12.89%和23.50%。經(jīng)酶解提取后，共軛態(tài)的黃酮含量也有所增加，但多酚含量變化不顯著。相類似的是，發(fā)酵過程也有明顯的多酚物質(zhì)從結(jié)合態(tài)到共軛態(tài)、游離態(tài)轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象（圖3）。

在酶解過程中，果膠酶可以將細胞間的果膠質(zhì)降解，纖維素酶將纖維素水解成水溶性糖，使細胞壁水解破裂，從而釋放出更多的活性物質(zhì)[22]。而在發(fā)酵過程中，植物乳桿菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酚酸脫羧酶、去羥酶等會削弱共軛、結(jié)合的酚類物質(zhì)與細胞壁之間的醚鍵，使得游離態(tài)黃酮和多酚含量均有所增加，結(jié)合態(tài)酚類含量下降[32]。賴婷等[33]研究發(fā)現(xiàn)，采用植物乳桿菌發(fā)酵后的桂圓肉游離態(tài)酚類和黃酮類含量分別增加11.90%、19.60%，結(jié)合態(tài)酚類和黃酮類含量分別下降41.40%。Wu等[34]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵能顯著增加石蓮花游離酚含量，這些都與本研究結(jié)果一致。

2.4 不同提取方式對“紅鸚鵡”中酚類成分組成和含量的影響

文獻報道[3,35-36]萱草花中鑒定出的酚類化合物有蘆丁、異槲皮苷、槲皮素、綠原酸、新綠原酸等，此外還有許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酚類物質(zhì)尚未被鑒定。本研究采用超聲、酶解-超聲以及發(fā)酵-超聲三種方式提取萱草花“紅鸚鵡”中酚類成分，對其三種酚類形態(tài)中的單體酚進行高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測，通過與標準品比對可知，在游離態(tài)、共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)中共檢測到含量較高的10種酚類化合物（含量低的物質(zhì)未列出），分別是沒食子酸、新綠原酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、對香豆酸、槲皮素，其中兒茶素、表兒茶素、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素是被檢出含量高的黃酮類化合物，新綠原酸、綠原酸、蘆丁是被檢出含量高的酚類化合物。

如表3所示，不同提取方式下游離態(tài)、共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)中的酚類化合物含量和分布有明顯不同，其中大部分主要以游離酚形式存在。酶解和發(fā)酵提高了大部分游離態(tài)酚類化合物的含量（除新綠原酸和兒茶素）?？Х人嵩诠曹棏B(tài)和結(jié)合態(tài)中分布較多，經(jīng)酶解和發(fā)酵后，游離態(tài)分別顯著增加25.40%和46.31%，共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)顯著下降（<0.05）；對香豆酸在超聲提取時主要以共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)存在，經(jīng)酶解和發(fā)酵后游離態(tài)中新檢出對香豆酸，且其共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)均有所下降，證明部分對香豆酸由共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)；槲皮素酶解和發(fā)酵后游離態(tài)酚類均顯著增加，其中發(fā)酵后增加了3倍，與本研究類似的是，王儲炎等[37]采用乳酸菌發(fā)酵藍莓多酚，發(fā)現(xiàn)游離態(tài)槲皮素增加異常顯著，其原因可能是乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶將連接酚酸與糖或蛋白的酯鍵打開，結(jié)合態(tài)的酚酸被釋放，向游離態(tài)轉(zhuǎn)化。

3種方式中，發(fā)酵提取后所得酚類物質(zhì)含量最高，而發(fā)酵包含了高溫滅菌的步驟，然而黃酮酚類物質(zhì)是熱敏性成分，發(fā)酵提取后所得酚類物質(zhì)含量較高可能的原因是：盡管發(fā)酵前的滅菌會導(dǎo)致多酚類物質(zhì)有損失，但研究表明一般損失率不超過10%[38]；而接種菌株后進入微生物發(fā)酵階段，有助于萱草花中酚類化合物的釋放，在Chen等[26]的研究中，滅菌后（121 ℃，15 min）再進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵的米糠樣品中總酚含量比未處理的樣品提高了71.6%；此外Ricci等[13]，滅菌后（65 ℃，30 min）再進行乳酸菌櫻桃汁發(fā)酵，在微生物轉(zhuǎn)化下通過各種代謝途徑合成新的黃酮和酚類化合物。

表3 不同提取方式下“紅鸚鵡”中三種形態(tài)的酚類化合物的組成與含量

注：同一列的每種單體酚中上標小寫字母不同表示同一酚類化合物存在明顯差異（0.05）；ND表示未檢出。

Note: The different superscript lowercase letters in each monomer phenol in the same column indicate significant differences in same phenolic compounds (<0.05); ND indicates not detected.

2.5 不同提取方式對“紅鸚鵡”中三種酚類形態(tài)抗氧化活性的影響

不同提取方式下“紅鸚鵡”中三種酚類形態(tài)DPPH和ABTS自由基清除率的維生素C當量如表4所示。超聲、酶解-超聲和發(fā)酵-超聲三種提取方式下的游離酚DPPH自由基清除率維生素C當量為40.53 mg/g、44.26 mg/g、48.20 mg/g。三種提取方式提取的游離酚ABTS自由基清除率維生素C當量分別為35.57 mg/g、39.88 mg/g、47.40 mg/g。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵-超聲的游離酚清除DPPH和ABTS自由基效果是最好的，其次是酶解-超聲和超聲提取的游離酚。

表4 不同提取方式下三種酚類形態(tài)DPPH和ABTS自由基清除率維生素C當量

注：標有不同的上標小寫字母的值表示同一列中存在顯著差異（0.05）。

Note: Values marked with different superscript lowercase letters indicate significant differences in the same column (<0.05).

2.6 萱草花中酚類成分的組成與含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

為了研究萱草花酚類成分的組成與含量與抗氧化活性的關(guān)系，由表2和表3的數(shù)據(jù)構(gòu)建了“紅鸚鵡”主要酚類化合物與其在發(fā)酵-超聲提取下抗氧化活性的相關(guān)性（表5）。結(jié)果表明，不同的酚類化合物對總抗氧化活性貢獻不同，在游離態(tài)中，綠原酸、蘆丁、咖啡酸和槲皮素的含量與DPPH和ABTS清除率相關(guān)性顯著（> 0.9，0.01），游離態(tài)中的對香豆酸、異槲皮苷與DPPH和ABTS自由基清除率也具有較好的相關(guān)性（>0.85，<0.05）；在共軛態(tài)中，異槲皮苷的含量與DPPH和ABTS自由基清除率有較高的相關(guān)性（> 0.85，0.05），游離態(tài)和共軛態(tài)兒茶素與DPPH和ABTS自由基清除率呈負相關(guān)；在結(jié)合態(tài)中，未表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系，僅新綠原酸、蘆丁與DPPH和ABTS自由基清除率呈負相關(guān)。因此綜合上述結(jié)果，萱草花酚類物質(zhì)的抗氧化活性不是一種或幾種單體酚的作用，而是多種酚協(xié)同作用的結(jié)果。

表5 萱草花中酚類化合物的含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

注：*在0.05水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)，**在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)。

Note: *Significantly correlated at the 0.05 level (bilateral), **Significantly correlated at the 0.01 level (bilateral).

3 結(jié) 論

通過對“紅鸚鵡”、“63#”、“健壯力蘭”、“玫瑰犀?！?、“太陽舞”5種萱草花采用發(fā)酵-超聲、酶解-超聲、超聲3種不同的提取方式，比較不同品種和不同提取方式萱草花中總黃酮和總多酚含量以及DPPH和ABTS自由基清除率；測定游離態(tài)、共軛態(tài)和結(jié)合態(tài)三種形態(tài)酚類化合物，分析了不同形態(tài)的酚類物質(zhì)與抗氧化活性的關(guān)系。結(jié)果表明：

1）不同顏色的萱草花中總黃酮和總多酚含量從高到低依次為：“紅鸚鵡”、“63#”、“健壯力蘭”、“玫瑰犀?！薄ⅰ疤栁琛?。

2）經(jīng)不同提取方式的萱草花抗氧化活性大小排序為：發(fā)酵-超聲、酶解-超聲、超聲。發(fā)酵-超聲后的“紅鸚鵡”對DPPH和ABTS自由基清除率最高，維生素C當量分別達到了44.32 mg/g和39.74 mg/g，較僅超聲提取分別上升了15.90%和24.89%（<0.05）。

3）在“紅鸚鵡”的3種酚類形態(tài)中，游離態(tài)的黃酮和多酚含量最高，占總含量的75%以上；酶解和發(fā)酵顯著（<0.05）提高了“紅鸚鵡”中大部分游離態(tài)酚類化合物的含量，且新檢出了對香豆酸，發(fā)酵后游離態(tài)槲皮素含量達到超聲時的3倍；發(fā)酵后萱草花中游離酚的DPPH和ABTS自由基清除率的維生素C當量分別達到了48.20 mg/g和47.40 mg/g。在游離態(tài)中，綠原酸、蘆丁、咖啡酸和槲皮素與抗氧化活性相關(guān)性高（>0.9），對抗氧化活性貢獻較大。

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Effects of different extraction methods on phenolic compounds and antioxidant activity inflower

Tian Huaixiang, Chen Shuang, Chen Xiaoyan, Yu Haiyan, Huang Juan, Yuan Haibin, Chen Chen※

(,,,201418,)

is one of the most popular flowers rich in bioactive substances, such as polyphenols, flavonoids, and alkaloids anthraquinones, particularly on antioxidant, antidepressant and anticancer. The extraction of phenolic compounds and antioxidant properties can also greatly contribute to the popularization offlower in the agricultural industry. However, only a few reports were focused on the extraction, forms and antioxidant activities of phenolic compounds in theflower. The present study aims to explore the effects of different extraction on the content, composition and antioxidant activity of phenolic compounds in variousflowers. Five kinds of flowers with different colors (yellow, orange, red-orange, jujube red, and bright red) were selected as raw materials. Three processing treatments (ultrasound, enzymolysis-ultrasound, and fermentation-ultrasound) were also utilized to determine the content of total flavonoids, total polyphenols, and scavenging rate of free radicals. Furthermore, high-performance liquid chromatography was adopted to identify the free, conjugated, and bound fractions of phenolic compounds, where the relationship was also established between phenolic compounds and antioxidant activity. Specifically, the types of total flavonoids and polyphenols were as follows: 'Hongyingwu', '63#', 'Jianzhuanglilan', 'Meiguixiniu', and 'Taiyangwu'. The results showed that there was a significant difference () of antioxidant activity in the different varieties of flowers, where the antioxidant activity was positively correlated with phenolic content. Furthermore, the antioxidant activities of flowers depended mainly on the varieties and extraction. More importantly, the vitamin C equivalents of DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) were 44.32, 40.63, 38.24, 37.64, and 35.60 mg/g, respectively, for the 'Hongyingwu', '63#', 'Jianzhuanglilan', 'Meiguixiniu' and 'Taiyangwu' under the fermentation-ultrasonic processing. The corresponding ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) vitamin C equivalents were 39.74, 36.24, 30.88, 28.38 and 24.88 mg/g, respectively. The vitamin C equivalent of DPPH of 'Hongyingwu' increased from 38.24 mg/g by ultrasonic extraction to 41.49 mg/g by enzymatic ultrasonic extraction and 44.32 mg/g by fermentation-ultrasonic extraction. The vitamin C equivalent of ABTS of 'Hongyingwu' increased from 31.82 mg/g by ultrasonic extraction to 35.12 mg/g by enzymatic ultrasonic extraction and 39.74 mg/g by fermentation-ultrasonic extraction. Among the three fractions, the content of phenolic compounds in the free fraction was the highest, accounting for more than 75% of the total contents. Enzymatic hydrolysis and fermentation significantly (＜0.05) improved the contents of most phenolic compounds in the free fraction of 'Hongyingwu'. Particularly, the p-Coumaric acid was newly detected, while the free quercetin content after fermentation reached three times that of the original. The Vitamin C equivalent of DPPH and ABTS free radical scavenging rate of free phenols increased from 40.53 and 35.57 mg/g for ultrasonic processing to 48.20 and 47.40 mg/g for fermentation-ultrasonic processing, respectively. Correlation analysis demonstrated that the chlorogenic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin in the free fraction were highly correlated with the antioxidant activity, indicating a great contribution to antioxidant activity. The finding can provide a theoretical basis for the development and utilization offlower in functional foods and cosmetics.

extraction;phenolic compounds;flower; antioxidant activity; free phenol

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Tian Huaixiang, Chen Shuang, Chen Xiaoyan, et al. Effects of different extraction methods on phenolic compounds and antioxidant activity inflower[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(20): 303-312. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.20.034 http://www.tcsae.org

2021-05-18

2021-08-05

上海食品風(fēng)味與品質(zhì)控制工程技術(shù)研究中心（20DZ2255600）

田懷香，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為食品科學(xué)與工程。Email：tianhx@sit.edu.cn

陳臣，博士，副教授，研究方向為食品科學(xué)與技術(shù)，食品生物技術(shù)。Email：chenchen@sit.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.20.034

TS255.2

A

1002-6819(2021)-20-0303-10