賈德功 賈志興 郭珊珊 程穎

肝移植是目前治療終末期肝病和肝臟不可切除性腫瘤的最終方法，但存在供者短缺、費(fèi)用高、手術(shù)對(duì)機(jī)體的創(chuàng)傷較大、受者需要長期服用免疫抑制劑預(yù)防排斥反應(yīng)以及可能發(fā)生其他嚴(yán)重并發(fā)癥等局限性[1-2]。其中缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）和排斥反應(yīng)是導(dǎo)致肝移植失敗的重要原因。目前，對(duì)于IRI的治療大多停留在支持階段，缺乏特異性的藥物和治療方法，并不能很好地緩解IRI[3]。自20世紀(jì)80年代以來，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和其他免疫抑制劑的臨床應(yīng)用使移植物1年存活率升高至80%[4]。但免疫抑制劑的長期使用會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡性腫瘤、機(jī)會(huì)性感染、代謝紊亂和器官毒性等，肝移植術(shù)后存活超過1年的受者中，惡性腫瘤和感染是兩大主要死因，分別占16.4%和10.5%[5]。因此，急需研究出一種既能減輕IRI和排斥反應(yīng)，又不影響受者整體免疫功能的新方法，以減少肝移植術(shù)后并發(fā)癥，提高肝移植的成功率。

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是由真核細(xì)胞和原核細(xì)胞釋放到細(xì)胞外微環(huán)境、被磷脂雙層膜包裹的納米顆粒[6-7]，包括外泌體（exosome）、微 囊 泡（microvesicle） 和 凋 亡 小 體（apoptosis body）[8]。但由于某些特征和內(nèi)容物的重疊，很難區(qū)分其不同的亞型。EV可攜帶多種參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)，如微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA，miR）、小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等[9]。在眾多體外和體內(nèi)研究中，來自多種細(xì)胞系的EV已被證明具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎和組織修復(fù)等特性。有研究表明，在大鼠腎移植低溫灌注期，EV具有減輕移植物IRI和抑制排斥反應(yīng)的作用[10]。而肝臟是EV治療的理想靶器官，因?yàn)镋V經(jīng)絕大多數(shù)系統(tǒng)給藥后，均會(huì)積聚在肝組織中[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，IRI前、中、后使用EV，均可減輕組織損傷并促進(jìn)組織修復(fù)[12]。這使EV成為肝移植領(lǐng)域一種十分具有吸引力的治療選擇。然而EV的實(shí)際臨床應(yīng)用仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，包括EV的分離、純化、鑒定、儲(chǔ)存和靶向遞送等。本文將總結(jié)EV在肝移植方面減輕IRI和促進(jìn)同種異體移植物免疫耐受的作用機(jī)制，討論EV應(yīng)用于臨床所需解決的問題，并對(duì)該領(lǐng)域未來的研究方向進(jìn)行展望。

1 EV在肝IRI中的作用機(jī)制

1.1 修復(fù)自噬

近期研究表明，肝臟發(fā)生IRI后，增強(qiáng)自噬可提高肝細(xì)胞的活性和功能[13]。自噬長期以來被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，而細(xì)胞應(yīng)激是一種防止細(xì)胞死亡的手段。在肝臟正常生理?xiàng)l件下，基礎(chǔ)水平的自噬可降解線粒體、衰老的細(xì)胞質(zhì)和受損的蛋白，從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝、免疫應(yīng)答和細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞受到缺血和缺氧等應(yīng)激時(shí)，自噬被激活。但目前關(guān)于自噬在肝IRI中的變化和作用機(jī)制仍然不是很清楚。

研究表明，IRI可導(dǎo)致線粒體自噬紊亂，清除受損的線粒體能夠預(yù)防活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生從而免受氧化應(yīng)激損傷[13]。EV可以恢復(fù)線粒體自噬，而線粒體自噬可以通過減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和抑制分解代謝來緩解IRI[14]。Yang等[15]在小鼠部分肝IRI模型中，分離小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)干細(xì)胞-肝細(xì)胞過渡表型細(xì)胞，從中分離出EV，再灌注前后通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，EV處理組小鼠肝損傷程度較輕，且微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈 3（microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3）-Ⅱ、p62和Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了變化，表明IRI導(dǎo)致的線粒體異常自噬被修復(fù)。另一項(xiàng)研究在大鼠肝IRI模型中注射人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV，發(fā)現(xiàn)EV與miR-20a共同應(yīng)用除了肝保護(hù)作用，還可以修復(fù)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的異常表達(dá)[16]。以上研究表明，自噬過程的修復(fù)在EV對(duì)移植物條件改善中起到重要作用。

1.2 免疫抑制

在大鼠IRI模型中，注射人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV降低了促炎因子干擾素（interferon，IFN）-γ、 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6的表達(dá)水平，并減少了中性粒細(xì)胞浸潤和呼吸爆發(fā)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV可降低促炎因子IL-6和CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）7 的表達(dá)水平，增強(qiáng)NOD樣受體蛋白（NOD-like receptor protein，NLRP）12的表達(dá)，而NLRP12是一種可通過抑制非典型核因子（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)的蛋白[18]。Sun等[19]也發(fā)現(xiàn)在大鼠IRI模型中，注射小型豬脂肪細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV，可使巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的CD11、CD14和CD161表型的表達(dá)減少，且聯(lián)合應(yīng)用褪黑素可以增強(qiáng)EV的免疫抑制功能以及對(duì)肝臟的保護(hù)作用。Nong等[20]發(fā)現(xiàn)在大鼠IRI模型中，注射間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV可減輕中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，降低髓過氧化物酶、TNF-α和IL-6等促炎因子的表達(dá)。也有研究者在小鼠IRI模型中發(fā)現(xiàn)，注射骨髓來源的樹突狀細(xì)胞分泌的EV可以減輕肝IRI，并通過誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來調(diào)控免疫反應(yīng)[21]。遺憾的是，這些研究均未提及EV對(duì)肝臟的長期影響。

有研究者在大鼠肝移植模型中發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞分泌的EV可以減輕肝損傷并且延長移植物存活時(shí)間，減少免疫細(xì)胞浸潤，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖和緩解同種異體移植排斥反應(yīng)[22]。有趣的是，使用EV和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞聯(lián)合治療的9只大鼠中，6只生存時(shí)間超過100 d，而未接受治療大鼠的中位生存期僅為10 d[22]。

以上研究闡示了EV對(duì)肝移植的免疫抑制機(jī)制，未來可通過研究肝免疫細(xì)胞群的表型和細(xì)胞因子信號(hào)通路，進(jìn)一步探討影響移植物存活的免疫學(xué)機(jī)制。

1.3 組織再生

EV也能促進(jìn)IRI后肝組織再生。在小鼠部分肝切除模型中，來自成人肝干細(xì)胞的EV能夠減少細(xì)胞凋亡并促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，且成人肝干細(xì)胞分泌的EV可促進(jìn)70%肝切除大鼠的肝組織再生[23]。同時(shí)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在IRI前注射間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV可以增強(qiáng)肝細(xì)胞Ki-67（一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物）的表達(dá)，這表明間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV可以刺激肝細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)IRI后肝組織再生[20,24]。Du等[10]通過觀察增殖細(xì)胞核抗原（proliferating nuclear antigen，PCNA）和磷酸化組蛋白 H3（phosphorylated histone H3，PHH3）等細(xì)胞增殖標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，注射EV可以促進(jìn)IRI后肝細(xì)胞的增殖。同時(shí)，該研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探索了誘導(dǎo)增殖的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇-1-磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）/鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）通路在肝細(xì)胞增殖中起重要作用。Nojima等[25]也發(fā)現(xiàn)EV可以攜帶SphK2刺激靶肝細(xì)胞S1P的產(chǎn)生，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝組織再生。有趣的是，該研究通過靜脈向小鼠分別注射肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞或血竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌的EV，發(fā)現(xiàn)只有肝細(xì)胞分泌的EV能起到作用。同時(shí)，Anger等[24]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV可促進(jìn)氧化應(yīng)激后肝細(xì)胞增殖，而成纖維細(xì)胞分泌的EV未能對(duì)損傷的移植物產(chǎn)生類似的保護(hù)和再生作用。表明EV的保護(hù)和再生作用取決于來源的母細(xì)胞性質(zhì)。

2 EV臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)

2.1 制 備

EV的臨床應(yīng)用仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。首先需要解決的是EV的制備問題。臨床應(yīng)用級(jí)EV的培養(yǎng)需從細(xì)胞庫中選出具有遺傳穩(wěn)定性的特定細(xì)胞系進(jìn)行體外擴(kuò)增和培養(yǎng)。當(dāng)EV達(dá)到一定濃度時(shí)，則需進(jìn)一步分離和純化EV。目前已有多種技術(shù)用于分離和純化EV，其中超速離心法是使用最為廣泛的方法[26]。超速離心法可以根據(jù)密度從其他樣品組分中分離和濃縮EV，但存在產(chǎn)量低、儀器昂貴、處理時(shí)間長以及損傷EV外膜等缺點(diǎn)[27]。超速離心法得到的EV可以通過追加密度梯度步驟進(jìn)一步提純[28]。凝膠排阻色譜法產(chǎn)量高、儀器便宜、簡單和高度可擴(kuò)展，且可以兼容動(dòng)態(tài)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（current Good Manufacturing Practices，cGMP），得到了越來越多的認(rèn)可，但其受限于對(duì)EV的分辨率低[29]。其他方法包括過濾、沉淀和試劑盒等，均存在產(chǎn)量低、破壞EV的完整性、價(jià)格昂貴或不符合cGMP等缺點(diǎn)[30-31]。為了克服這些缺點(diǎn)，人們正在積極探索新方法，如在切向流過濾裝置和生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞，通過尺寸排除層析法提高EV產(chǎn)量和純化EV[32]。同樣，乙醇調(diào)節(jié)和三維灌注生物反應(yīng)器的聯(lián)合使用也被證明可以提高EV的產(chǎn)量和效能[33]。無論選擇哪一種分離和純化方法，都應(yīng)著重評(píng)估該方法對(duì)EV制備和功能的影響。

2.2 儲(chǔ) 存

EV的長期儲(chǔ)存也是臨床應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵問題。雖然有研究表明EV經(jīng)過反復(fù)凍融，在-20 ℃保存6個(gè)月后仍可保持穩(wěn)定性，但也有研究表明在3次凍融循環(huán)后，EV的完整性就會(huì)喪失[34-35]。EV可以進(jìn)行凍干制成現(xiàn)成產(chǎn)品，在保留其功能的同時(shí)降低生產(chǎn)和存儲(chǔ)成本[36]。然而，存儲(chǔ)介質(zhì)在EV完整性中起著至關(guān)重要的作用，即使少量的離子也會(huì)引起pH值變化，導(dǎo)致EV聚集和功能喪失[37]。因此，需要優(yōu)化長期存儲(chǔ)條件，防止EV功能損害。

2.3 遞 送

EV的另一項(xiàng)臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)是特異性遞送到靶細(xì)胞。研究者們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同EV給藥途徑進(jìn)行了評(píng)估，其中靜脈給藥是最為常見[38]。一些關(guān)于EV治療作用的研究描述了通過靜脈給藥的方式將間充質(zhì)干細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞分泌的EV遞送到靶器官或組織，如肺血管、頸動(dòng)脈、心臟、肺、胰腺、肝臟和結(jié)腸[39-45]。基于這一證據(jù)，靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞分泌的EV似乎不能為特定器官提供足夠的特異性。同時(shí)，值得一提的是，這些研究大多沒有評(píng)估相同的實(shí)驗(yàn)方法是否會(huì)對(duì)除靶器官或靶組織之外的其他器官或組織產(chǎn)生影響。因此，對(duì)EV表面蛋白質(zhì)組和靶細(xì)胞表面聚糖圖譜的特性描述可以顯著提高EV靶特異性。

3 EV的潛在應(yīng)用

目前已有多家公司參與了EV療法的早期開發(fā)，其中幾家已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)[46]。如美國Aegle Therapeutics公司使用骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EV治療大皰性營養(yǎng)不良；美國Aruna Biomedical公司使用神經(jīng)干細(xì)胞分泌的EV治療腦卒中和肌萎縮側(cè)索硬化；澳大利亞Exopharm公司使用來源于自體血小板分泌的EV促進(jìn)傷口愈合。以上證據(jù)表明EV在臨床應(yīng)用中具有較大的潛力。研究開發(fā)具有成本效益、符合cGMP要求的方法和設(shè)施，用于大規(guī)模生產(chǎn)臨床級(jí)EV，是實(shí)現(xiàn)EV廣泛臨床應(yīng)用的必要條件。盡管具有挑戰(zhàn)性，但將為EV未來的治療應(yīng)用打開大門。

在過去的十年里，人們逐漸認(rèn)識(shí)到EV在細(xì)胞間信號(hào)傳遞中的作用及其作為生物標(biāo)志物的潛能。體外和體內(nèi)研究表明EV具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎和組織修復(fù)等特性，且EV受到囊泡膜蛋白的保護(hù)，因此具有一定的穩(wěn)定性和生物安全性。迄今為止，已有多項(xiàng)研究探索了EV作為一種新的治療方法在減輕肝IRI和同種異體肝移植模型移植物損傷中的作用，證實(shí)了EV具有改善肝IRI的潛力，并闡述了潛在的機(jī)制，包括修復(fù)自噬、免疫抑制和組織再生。以間充質(zhì)干細(xì)胞為代表的細(xì)胞療法適合應(yīng)用于肺IRI，因?yàn)殪o脈注射的細(xì)胞體積大，往往被困在小的肺毛細(xì)血管中，促進(jìn)其在肺組織中積聚[47]。與之相反，肝臟由于血管開窗作用和枯否細(xì)胞駐留，可以促進(jìn)納米顆粒在其中選擇性沉積[48]。EV在肝臟中高水平積聚，因此肝臟是EV作用的理想靶點(diǎn)。另外，在肝移植領(lǐng)域，EV的給藥時(shí)間更是十分靈活，可在缺血前（器官動(dòng)脈夾閉）、在器官保存或體外灌注期間、再灌注前以及再灌注后。體外機(jī)械灌注更是為EV在肝移植領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一種新的選擇。在移植前將EV遞送到供肝，避免了在獲得供肝前進(jìn)行器官修整的相關(guān)倫理問題。

為了進(jìn)一步改善治療方法，可以在EV內(nèi)裝載具有減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞死亡或者降低氧化應(yīng)激水平的藥物。通過合成納米顆粒進(jìn)行給藥在臨床中已十分常見[49]，這種方式有助于從對(duì)同一疾病統(tǒng)一治療的舊模式向根據(jù)病人參數(shù)進(jìn)行個(gè)體化治療的新模式轉(zhuǎn)變。例如，脂質(zhì)體是一種在大小、形狀和結(jié)構(gòu)上與EV相似的人工合成納米顆粒級(jí)別的脂質(zhì)，自20世紀(jì)90年代以來，一直被用于遞送化學(xué)藥物治療（化療）藥物和抗真菌藥物到病人體內(nèi)，改善了藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和特異性靶向遞送，減少了藥物的不良反應(yīng)，提高了治療效果[50-53]，但仍存在著高免疫原性、高毒性和高清除率等缺點(diǎn)[54]。而EV則表現(xiàn)出較低的毒性和免疫原性，且較少被巨噬細(xì)胞吞噬，因此可以在循環(huán)系統(tǒng)和組織中停留較長時(shí)間[55]。截止至投稿日，美國國立衛(wèi)生研究院網(wǎng)站已經(jīng)注冊(cè)了51項(xiàng)涉及使用治療性EV的臨床試驗(yàn)，包括通過植入EV將姜黃素遞送到結(jié)腸癌組織中（NCT01294072）、通過EV將治療性siRNA遞送到胰腺癌組織中（NCT03608631）等。雖然目前還沒有研究結(jié)果，但這些研究可能會(huì)為EV遞送治療藥物的臨床實(shí)踐提供借鑒。不僅如此，類似其他人工合成的納米顆粒，EV未來的潛在應(yīng)用還應(yīng)包括聯(lián)合療法，即不同的藥物被共同裝載到EV中，以確保受體細(xì)胞暴露于最佳的藥物濃度比例中[56-58]。

4 小結(jié)與展望

部分動(dòng)物模型研究表明EV具有緩解IRI和促進(jìn)同種異體移植物免疫耐受的作用，但其安全性還需要進(jìn)一步研究。EV的臨床應(yīng)用面臨著生產(chǎn)、分離、純化、儲(chǔ)存以及將如何將EV遞送到靶細(xì)胞等問題。盡管關(guān)于EV的眾多問題仍未得到解答，技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方面的挑戰(zhàn)也阻礙了其從實(shí)驗(yàn)室到臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化，但這種新穎的方法具有極高的應(yīng)用前景?？傊?，在肝移植中，EV是一種十分具有吸引力的新型治療方法，具有改善肝IRI和減輕排斥反應(yīng)的潛力，值得進(jìn)一步研究。