尚姝明，張曉軍，馬天宇，張昊，于鳳超，齊宏玥，陳泳澤，莊松霖，王尚鵬

摘要：運(yùn)用細(xì)胞生存活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)（MTT）研究魚腥草提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116生長(zhǎng)的抑制情況.采用倒置顯微鏡觀察不同濃度魚腥草提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116形態(tài)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚腥草提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長(zhǎng)增殖有明顯的抑制作用，且存在濃度和時(shí)間的依賴性.魚腥草作為天然抗腫瘤化合物的篩選材料具有潛在的價(jià)值.

關(guān)鍵詞：魚腥草;結(jié)腸癌細(xì)胞;MTT

[中圖分類號(hào)]Q291[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Inhibitory Effect of Houttuynia cordata Extract on Proliferation

of Colon Cancer Cell HCT116

SHANG Shuming，ZHANG Xiaojun*，MA Tianyu，ZHANG Hao，YU Fengchao*，

QI Hongyue，CHEN Yongze，ZHUANG Songlin，WANG Shangpeng

（Mudanjiang Nomal University Life Science and Technology College，Mudanjiang 157011，China）

Abstract：Cell viability assay （MTT） was used to study the growth inhibition of Houttuynia cordata Thunb.extract on human colon cancer cell HCT116.The effect of Houttuynia cordata extract at different concentrations on the morphology of HCT116 colon cancer cells was observed by inverted microscope.The results showed that Houttuynia cordata extract had significant inhibitory effect on the growth and proliferation of human colon cancer cell HCT116 in a concentration and time dependent manner. Houttuynia cordata has potential value as a screening material for natural anti-tumor compounds.

Key words： Houttuynia cordata Thunb;colon cancer cells;MTT

結(jié)腸癌（Coloreetal Carcinoma，CRC）是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤.目前臨床上治療結(jié)腸癌的方法以手術(shù)切除為主，化療為輔.魚腥草中含有黃酮類、谷甾醇類、水溶性多糖、有機(jī)酸、生物堿、維生素等多種具有抗癌效果的物質(zhì)，是具有藥用和食用價(jià)值的中草藥.[1-4]《本草綱目》記載，魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）有“散熱毒癰腫，瘡痔脫肛，斷店疾，解硇毒”等功效.臨床上魚腥草注射液對(duì)腫瘤合并上呼吸道感染、急性氣管、支氣管炎、帶狀皰疹具有良好療效，尤其是魚腥草注射液能增強(qiáng)免疫功能，對(duì)該類患者更為有益.[5]鐘兆銀[6]研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草中提取的有效成分魚腥草素能抑制Hepg-2（人肝腫瘤細(xì)胞）、MG-63（人骨肉瘤細(xì)胞）、TCA（人舌癌細(xì)胞）三種腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡.薛興陽[7]研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草黃酮提取物有抑制人子宮頸癌細(xì)胞株SiHa生長(zhǎng)的作用，以濃度依賴性誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞的凋亡.張志偉[8]以中國(guó)倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株作為模型，發(fā)現(xiàn)魚腥草醇提取物有明顯的體外抗腫瘤活性.樊宏偉[9]等研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草黃酮提取物能抑制人白血病細(xì)胞HL60和小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16BL6生長(zhǎng)，具有誘導(dǎo)凋亡的作用.本實(shí)驗(yàn)選用魚腥草提取物作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，探究不同濃度魚腥草提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的抑制作用.

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料及供試細(xì)胞株魚腥草（Huttuynia cordata Thunb.）購于黑龍江省牡丹江市同仁堂大藥房.人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116由哈爾濱工業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng).

試劑RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），二甲基亞砜（DMSO），磷酸鹽緩沖液（PBS），青鏈霉素（Penicillin-Streptomycin Solution），3- （4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），0.25%胰蛋白酶.

儀器CO2培養(yǎng)箱（Nuaire，型號(hào)：NU-5700），酶標(biāo)儀（BioTek，型號(hào)：Synergy HTX），倒置顯微鏡（Olympus，型號(hào)：TH4-200）.

2實(shí)驗(yàn)方法

魚腥草提取物制備取干燥的魚腥草，按料液比1∶16加入90%乙醇提取.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮提取液，干燥后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

MTT法檢測(cè)魚腥草提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響采用MTT法評(píng)價(jià)魚腥草提取物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力.[10-13]

以濃度為1 000 cell/孔的標(biāo)準(zhǔn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組加入濃度為2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 mg/mL的魚腥草提取物，對(duì)照組不進(jìn)行藥物處理.處理時(shí)間為12 h和24 h.每孔加10 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，避光處理3～4 h.棄上清液，每孔加DMSO 100 μL，搖床振蕩10 min.490 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度（OD），3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)并記錄結(jié)果.

根據(jù)公式（細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率%=（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/對(duì)照組×100%）計(jì)算魚腥草提取物對(duì)HCT116的生長(zhǎng)抑制率，應(yīng)用SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S ）表示，進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3結(jié)果與分析

3.1魚腥草提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見對(duì)照組（圖1、圖2）細(xì)胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，呈棱形、橢圓形、多邊形或短梭形.不同濃度魚腥草提取物作用結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 12 h或24 h后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，且隨濃度和時(shí)間的升高，其變化愈加明顯，細(xì)胞排列疏松，呈簇橢圓型或者圓型，細(xì)胞收縮，體積變小，細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變?yōu)榘胭N壁狀態(tài)，高濃度的細(xì)胞開始出現(xiàn)脫落現(xiàn)象.鏡下可清晰觀察到凋亡小體和自噬小泡，魚腥草提取物濃度愈高，凋亡小體和自噬小泡愈明顯，數(shù)量也越多（圖3、圖4）.由此可知，魚腥草提取物能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬.

3.2MTT法檢測(cè)魚腥草提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的抑制作用作用時(shí)間為12 h和24 h后，MTT法檢測(cè)魚腥草提取物作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的結(jié)果詳見表1.隨著魚腥草提取物濃度（0～20 mg/mL）不斷增加，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的抑制率不斷升高，呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系.魚腥草提取物濃度20 mg/mL處理時(shí)間為12 h時(shí)，HCT116細(xì)胞的抑制率為58.57%，24 h時(shí)HCT116細(xì)胞的抑制率為61.80%，無顯著差異.隨著魚腥草提取物濃度的增加，殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的能力隨之增強(qiáng).MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚腥草提取物能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖，且存在濃度和時(shí)間的依賴性.

4討論及結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚腥草提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，呈一定的量效劑量依賴性及時(shí)間依賴性.隨著培養(yǎng)時(shí)間及藥物濃度的增加，魚腥草提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，當(dāng)魚腥草提取物濃度為20 mg/mL時(shí)，12 h HCT116細(xì)胞的抑制率為58.57%，24 h HCT116細(xì)胞的抑制率為61.80%.

在世界范圍內(nèi)，每年都有人死于結(jié)腸癌，尋求副作用小、有效率高、價(jià)格低廉的天然抗腫瘤藥物，利用它們使化療藥物增敏從而減少化療藥物用量尤為重要.該研究為魚腥草作為天然抗腫瘤藥物的開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù).

參考文獻(xiàn)

[1]梁明輝.魚腥草的化學(xué)成分與藥理作用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2019，17（2）：153-154.

[2]樊宏偉，瞿衛(wèi)，立彥，等.魚腥草黃酮提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008（7）：528-531.

[3]雒江菡，于瑞洪，閻紅.魚腥草多糖提取工藝及抑菌活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34（11）：27-29+43.

[4]洪緯.食物、藥物和景物：魚腥草在傳統(tǒng)中國(guó)的利用[J].中國(guó)農(nóng)史，2016，35（6）：111-120.

[5]王立，王亞平，同生志.魚腥草注射液治療腫瘤合并感染38例[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2002（4）：31.

[6]鐘兆銀，黃鎖義.魚腥草提取物魚腥草素對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用[J].廣東化工，2019，46（16）：27-28.

[7]薛興陽，付騰飛，邵方元，等.魚腥草總黃酮對(duì)人腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性作用[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（23）：2509-2511.

[8]張志偉，孟進(jìn)，蘇冰.魚腥草醇提取物抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（23）：134-135.

[9]樊宏偉，瞿衛(wèi)，立彥，等.魚腥草黃酮提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008（7）：528-531.

[10]Plastina Pierluigi，Bonofiglio Daniela，Vizza Donatella，et al.Identification of bioactive constituents of Ziziphus jujube fruit extracts exerting antiproliferative and apoptotic effects in human breast cancer cells.[J].Journal of Ethnopharmacology，2012，140：325-332.

[11]張強(qiáng)，趙新淮.黃酮和黃酮醇通過誘導(dǎo)PIG3表達(dá)引發(fā)人食管癌細(xì)胞凋亡[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（2）：213-219.

[12]潘一鳴，張蕾，閆兵，等.華蟾毒精對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2017（1）：52-53.

[13]蔣小飛，張嫩玲.9-O-芐基小檗堿和3-O-芐基藥根堿衍生物的合成及抗菌和細(xì)胞毒活性研究[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2018（1）：51-55.

編輯：琳莉